Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi và cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo (abelmoschus sagittifolius kurz var septentrionalis gagnep)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa dùng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Dương Thị Thanh Huyền i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập môn Công nghệ sinh học thực vật, quan tâm, dạy dỗ bảo nhiệt tình thầy giáo, cán phòng thí nghiệm nỗ lực cố gắng thân em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể thầy cô giáo truyến đạt cho em kiến thức, kỹ vô quan trọng quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện tai Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo – Trưởng Khoa Công Nghệ Sinh Học tận tình hướng dẫn em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới ThS Ninh Thị Thảo, giảng viên môn Công nghệ sinh học Thực vật dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn bảo em suốt trình thực tập Em xin gửi lời cảm ơn tới giảng viên môn công nghệ sinh học Thực vật, ThS Phạm Thị Thu Hằng, cán phòng thí nghiệm môn Công nghệ sinh học Thực vật chị kĩ thuật viên phòng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực tập Cám ơn bạn bè, tập thể lớp K56-CNSHA động viên tạo động lực để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân nuôi nấng, yêu thương, động viên tạo động lực cho em suốt trình học tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày… tháng… năm 2015 Sinh viên Dương Thị Thanh Huyền ii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep)” tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo cảm ứng thành công rễ tơ sâm báo làm tiền đề cho việc xây dựng quy trình sản xuất hợp chất thứ cấp phục vụ ngành công nghệ dược liệu Việt Nam Với mục đích thứ cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo, nghiên cứu thu kết ban đầu sau: Nồng độ đường thích hợp cho phát triển chồi in vitro sâm báo 50 g/l, nồng độ IBA vàGA3 tốt dùng để cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo 0,5 mg/l 2,0 mg/l Môi trường lỏng mơi trường thích hợp cho phát triển chồi in vitro sâm báo Môi trường có bổ sung tổ hợp auxin/BA khơng có tác dụng việc cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo Mục đích thứ hai để tài cảm ứng tạo rễ tơ sâm báo nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, nghiên cứu thu số kết định sau: Nồng độ dịch khẩn giá trị OD 600 = 0,2 thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo Vật liệu lây nhiễm cho hiệu cảm ứng tạo rễ tơ tốt mô in vitro sâm báo Phương pháp lây nhiễm mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dịch khuẩn phương pháp thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ sâm báo iii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR .Error: Reference source not found Bảng 2: Chu kì nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA rễ tơ Error: Reference source not found Bảng 3: Chu kì nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen virD Agrobacterium rhizogenes Error: Reference source not found Bảng 4: Các mồi đặc trưng cho gene rolA virD sử dụng phản ứng PCR Error: Reference source not found Bảng 4.1: Ảnh hưởng nồng độ đường đến chất lượng chồi in vitro sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.2: Ảnh hưởng nồng độ IBA đến chất lượng chồi in vitro sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.3: Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến chất lượng chồi in vitro sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.4: Ảnh hưởng trạng thái môi trường + 0,5 mg/l IBA đến chất lượng chồi in vitro sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.5: Ảnh hưởng tổ hợp auxin/BA đến chất lượng chồi in vitro sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.6: Ảnh hưởng nồng độ dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đến khả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo Error: Reference source not found Bảng 4.7: Ảnh hưởng loại mô lây nhiễm đến khả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo sau tuần nuôi cấy Error: Reference source not found Bảng 4.8: Ảnh hưởng phương pháp lây nhiễm đến khả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo sau tuần nuôi cấy Error: Reference source not found iv DANH MỤC HÌNH Hình 4.1: Chồi in vitro sâm báo môi trường có nồng độ đường khác sau 30 ngày ni cấy Error: Reference source not found Hình 4.2 : Chồi sâm báo mơi trường chứa nồng độ IBA khác sau 30 ngày nuôi cấy .Error: Reference source not found Hình 4.3: Chồi sâm báo mơi trường chứa nồng độ GA khác sau 30 ngày nuôi cấy .Error: Reference source not found Hình 4.4: Chồi sâm báo trạng thái môi trường khác kết hợp 0,5 mg/l IBA sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Hình 4.5: Chồi sâm báo môi trường chứa 0.5 mg/l auxin khác + mg/l IBA sau 30 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Hình 4.6: Mẫu mơ sâm báo cảm ứng tạo rễ nồng độ dịch khuẩn khác sau tuần nuôi cấy Error: Reference source not found Hình 4.7: Cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo loại mô lây nhiễm (lá, đoạn thân) khác sau tuần ni cấy Error: Reference source not found Hình 4.8: Mẫu mô sâm báo cảm ứng tạo rễ tơ phương pháp lây nhiễm khác sau tuần nuôi cấy .Error: Reference source not found v DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÍ HIỆU VIẾT TẮT α – NAA : Axit α – naphtyl axetic BA : - Benzylaminopurine CT : Công thức CV (%) : Sai số thí nghiệm đ/c : Đối chứng GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole acetic acid IBA : Indole butyric acid LSD0,05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS : Môi trường Murashige and Skoog TB : Trung bình vi PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep) loại dược liệu quý y học cổ truyền Sâm báo có vị nhạt, có chất nhầy, tính bình, có tác dụng bổ mát, nhuận phế, dưỡng tâm, sinh tân dịch, với gạo tính ấm bổ tỳ vị, giúp tiêu hoá, tăng thêm sức dẻo dai Sâm báo sử dụng kết hợp với số vị thuốc đông y khác để chữa số bệnh thể bệnh đường tiêu hóa (trẻ em gầy còm xanh xao, lỵ kéo dài, phân lỏng), bệnh phụ nữ (rối loạn kinh nguyệt), bệnh nam giới (bổ thận, tráng dương)… Một số chất có củ sâm báo flavonoid có tác dụng chống viêm loét dày, chống co thắt túi mật, ống dẫn mật, có tác dụng chống độc giúp làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức gan, chất coumarin rễ củ sâm báo có nhiều tác dụng chống co thắt, làm giản nở động mạch vành, làm bền bảo vệ thành mạch, chống đông máu, chống viêm,… Tại Việt Nam, sâm báo phát mọc hoang nhiều vùng núi thấp, vùng đồi núi trung du Thanh Hoá Hiện nay, nguồn sâm báo cung cấp cho thị trường chủ yếu thu hái từ tự nhiên dẫn đến số lượng sâm báo tự nhiên ngày giảm sút, số lượng giống Trên tảng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu dược liệu đan sâm, sâm ngọc linh, sâm dây… Một số nghiên cứu sâm báo tiến hành nghiên cứu Nguyễn Thị Hạnh – năm 2013 Nguyễn Thị Yến – năm 2014 thuộc môn Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học cho số kết tốt Tuy nhiên số vấn đề cần khắc phục chất lượng chồi kém, thường xuất hiện tượng úa vàng lá, còi cọc Bên cạnh số lượng sâm báo cung cấp cho thị trường hạn chế giá trị nhu cầu sâm báo ngày tăng cao Việc áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu sinh khối cần thiết Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với ưu điểm vượt trội rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hóa tăng trưởng ngoại sinh, bền vững mặt di truyền tổng hợp hợp chất thứ cấp hàm lượng cao, tạo sinh khối lớn, giúp hạ giá thành sản phẩm đáp ứng nhu cầu ngày cao người giải pháp đầy hứa hẹn để khắc phục khó khăn trước mắt Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết tiến hành đề tài “Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep)” 1.2 Mục đích nghiên cứu • Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến chất lượng chồi in vitro sâm báo làm sở hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro sâm báo cho chất lượng giống tốt • Cảm ứng rễ tơ sâm báo vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes làm tiền đề cho việc xây dựng quy trình sản xuất số hợp chất thứ cấp phục vụ công nghiệp dược liệu Việt Nam 1.3 Yêu cầu • Xác định mơi trường thích hợp cho phát triển chồi in vitro Sâm Báo • Cảm ứng tạo rễ tơ sâm báo • Kiểm tra dòng rễ tơ sau chuyển gen phương pháp PCR PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây sâm báo 2.1.1 Vị trí phân loại, phân bố sâm báo: Cây sâm báo có tên khoa học Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep thuộc: Họ: Malvaceae (Bông) Chi : Hibiscus (Dâm Bụt) Phân bố: Cây Sâm Báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep) phát mọc hoang nhiều vùng núi thấp, vùng đồi núi trung du Thanh Hoá, xã Cẩm Bình huyện Cẩm Thủy, núi Báo xã Vĩnh Hùng huyện Vĩnh Lộc hay vườn quốc gia Bến En huyện Như Thanh, tỉnh Thanh Hóa (Viện dược liệu trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Hà Nội) 2.1.2 Đặc điểm thực vật học Sâm báo thân thảo, cao 30 - 50cm Rễ củ hình trụ, đơi phân nhánh, màu trắng đục Thân hình trụ, có lơng nhám Lá mọc so le hình tam giác, dạng thuỳ hình tim, dài - 7cm, rộng - 5cm, hai mặt có lơng đơn lơng hình sao; mép xẻ tù nơng lượn sóng; gân 3, gân phụ hình mạng lưới Cuống dài 2.5 - 4,0cm, có lơng Lá kèm hình chỉ, có lơng Hoa màu đỏ vàng, mọc đơn độc kẽ lá, có nhiều lơng Đài hình mo có rãnh nhỏ đỉnh, sớm rụng; đài phụ gồm 10 dạng sợi, có lơng, tồn với Cánh hoa dạng thìa hay trứng thn dài Nhị nhiều dính với thành cột, mang bao phấn phú kín nhị Bầu hình trứng hay hình thoi Vòi nhuy có đầu xẻ thành đầu nhỏ, tròn, có chất dính Quả nang, hình trứng nhọn có gờ dọc, vỏ ngồi có nhiều lơng nhám chín tách thành mành Hạt nhiều, hình thận, màu nâu (Đào Thị Vui, 2006) 2.1.3 Đặc điểm vi học rễ củ sâm báo • Đặc điểm vi phẫu rễ củ sâm báo: Ngoài – lớp tế bào bần Dưới lớp bần lớp tế bào tầng phát sinh bần lục bì – lớp tế bào lục bì Tiếp đến mơ mềm vỏ Rải rác mơ mềm có tinh thể calci oxalate hình cầu gai túi tiết chất nhầy Các bó libegỗ cấp bó chồng, gồm – bó chiếm tồn phần trung trực rễ Giữa bó libe-gỗ tia ruột Bó gỗ cấp khơng rõ (Đào Thị Vui, 2006) • Đặc điểm bột rễ củ sâm báo: Bột màu trắng ngà, mùi thơm nhẹ, vị nhạt Soi kính hiển vi thấy có nhiều hạt tinh bột, hạt đơn, kép đơi, kép ba kép tư có hình dạng khác nhau, có rốn nhìn rõ khơng nhìn rõ vân Sợi có thành mỏng, riêng lẻ hay xếp thành bó Mảnh mơ mềm cấu tạo từ thành mỏng có chứa hạt tinh bột, đơi có túi chứa chất nhầy Rải rác có tế bào mô cứng Mảnh mạch thường mạch điểm Các tinh thể calci oxalate hình cầu gai (Đào Thị Vui, 2006) 2.1.4 Giá trị dược liệu Bộ phận dùng: Rễ, thu hái vào mùa thu, đông, cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy khơ Thành phần hóa học có rễ: Rễ sâm báo trồng Bạc Liêu xác định có chứa chất phytosterol, coumarin, acid béo, acid hữu cơ, đường khử hợp chất uronic Hàm lượng lipid có rễ 3,96% Lipid gồm acid myrisric, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic Hàm lượng protein toàn phần 0,23g %, hàm lượng protide 1,26g % Các acid amin gồm 11 chất, có histidin, arginin, threonin, alanin,prolin, tyrosin, valin, phenylalanin leucin Hàm lượng tinh bột 15,14% chất nhầy 26,7% Chất nhầy D-glucose Lrhamnose Ngồi ra, có 13 ngun tố : Na, Ca, Mg, Al, So Fe, V, Mn, Ti, Mo, Cu, Zr P Tác dụng dược lý: Bằng đường uống tiêm phúc mạc, cao cồn Sâm Báo có tác dụng gây giảm hoạt động tự nhiên chuột nhắt trắng, đối kháng với tác dụng tăng hoạt động amphetamin, kéo dài thời gian gây ngủ thuốc ngủ barbituric, chống co giật gây pentetrazol Điều chứng tỏ Sâm Báo có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, an thần Bảng 4.8: Ảnh hưởng phương pháp lây nhiễm đến khả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo sau tuần nuôi cấy Công Phương thức thức lây nhiễm CT đ/c Đối chứng không lây nhiễm CT1 Tiêm trực tiếp dung dịch vi khuẩn vào mẫu cấy CT2 Mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dung dịch khuẩn CT3 Mẫu ngâm vào dịch khuẩn thời gian 20 phút A B Tỷ lệ mẫu xuất rễ(%) 34,21 45,83 6,25 C A: Phương pháp tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào mẫu cấy B: Phương pháp mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dịch khuẩn C: Phương pháp mẫu ngâm vào dịch khuẩn 20 phút Hình 4.8: Mẫu mơ sâm báo cảm ứng tạo rễ tơ phương pháp lây nhiễm khác sau tuần nuôi cấy Kết từ bảng 4.8 cho thấy: Các phương pháp lây nhiễm khác cho hiệu cảm ứng tạo rễ tơ khác Phương pháp lây nhiễm cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ cao phương pháp mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dịch khuẩn, đạt 45,83% Phương pháp tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào mẫu cấy cho tỷ lệ mẫu cảm ứng rễ 34,21% phương pháp cho tỷ lệ mẫu cảm ứng rễ thấp phương pháp mẫu ngâm vào dịch khuẩn thời gian 20 phút đạt 6,25% Như từ kết bảng 4.8 xác định phương pháp lây nhiễm mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dịch khuẩn phương pháp cho hiệu cảm ứng tạo rễ cao mô in vitro sâm báo 33 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết rút kết luận sau: Nồng đọ đường 50 g/l thích hợp cho sinh trưởng phát triển chồi in vitro sâm báo Nồng độ IBA = 0,5 mg/l thích hợp dùng để cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo Nồng độ GA3 thích hợp để cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo mg/l Trạng thái môi trường phù hợp để cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo môi trường lỏng Việc bổ sung tổ hợp auxin/BA vào môi trường nuôi cấy không mang lại hiệu để cải thiện chất lượng chồi in vitro sâm báo Dịch khuẩn giá trị OD thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo OD600 = 0,2 Mô mơ thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo Phương pháp lây nhiễm thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo phương pháp mẫu tạo vết thương dao cấy nhúng dịch khuẩn 5.2 Kiến nghị 1.Tiếp tục khảo sát yếu tố khác ảnh hưởng tới chất lượng chồi in vitro sâm báo 2.Tiến hành thí nghiệm tìm mơi trường rễ thích hợp cho sâm báo, tạo hồn chỉnh in vitro, thử nghiệm đưa ngồi mơi trường chăm sóc 3.Tìm giá thể, chế độ chăm sóc tốt cho giai đoạn ngồi mơi trường tự nhiên 4.Tiếp tục xác định dòng rễ chuyển gen dòng rễ cảm ứng in vitro thu phương pháp phân từ 5.Phân tích hợp chất thứ cấp rễ chuyển gen thu 6.Tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới phát triển, tăng sinh khối rễ tơ in vitro sâm báo sinh, tổng hợp tích lũy hợp chất thứ cấp có rễ tơ sâm báo 34 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Lã Hồng Anh (2013) Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đề tài “Bước đầu nghiên cứu cảm ứng rẽ tơ đan sâm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị Lê Thị Muội 1997 Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Tô Hà (2014), Phát triển du lịch Vĩnh Hưng, Cổng thơng tin văn hóa huyện Vĩnh Lộc Hà Thị Loan, Dương Hoa Xơ, Nguyễn Quốc Bình, Nguyền Hồng Qn, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Tạp chí sinh học 2014, 36(1se):293-300 Đỗ Tất Lợi (1991), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB khoa học phát triển ,Hà Nội Lê Thu Ngọc, Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Dương Tấn Nhựt Nghiên cứu tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen rol tăng cường cảm ứng tạo rễ tơ thực vật chuyển gen Tạp chí sinh học 2013, 35(4): 494-503 Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Thủy Quy trình nhân giống in vitro ba kích (Morinda officenalis How) Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 3: 285-292 Bùi Văn Thế Vinh, Chu Thị Bích Phượng, Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt Tái sinh chồi trực tiếp từ dầu mè (Jatropha curcas L) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 9(1): 1-7, 2011 Đào Thị Vui (2007), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý theo hướng điều trị loét dày rễ củ sâm báo Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr., họ Bông (Malvaceae) 10 Nguyễn Thị Yến (2014), khóa luận tốt nghiệp khoa Cơng nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đề tài “Hồn thiện quy trình nhân nhanh in vitro sâm báo” 35 11 Trần Thị Lệ, Trần Thị Triệu Hà (2011) Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro số giống khoai sọ (Colocasia antiquorum) Tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 67, 2011 Tài liệu nước Akramian, Morteza, Seyed M S T, Masoud M 2008 “Virulence of Different Strains of Agrobacterium Rhizogenes on Genetic Transformation of Four Hyoscyamus Species” , 759 – 763 Ashwani S, Vinod K, Bellur C N P, Harischandra B G, Gokare A R 2005 “ agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment” Baransk, Rafal 2008 “Genetic Transformation of Carrot and ather APIAcEae species” Transgenic plant journal 92: 303 – 390 Christey M C, Braun and R H 2004 “Production of transgenic vegetable Brassicas in Bitechnology in Agriculture and Forestry” Brassicas biotechnology Springer – Verlag 89: 133 - 154 Chyuam Y N., Norihan M S., Faridah Q Z., 2010 In vitro multiplication of the rare and endangered slipper orchid, Paphiopedilum rothschildianum (Orchidaceae) Af J.Biotech Eibl R and Eibl D (2009), “ Cell and tissue reaction Engineering: Principles and Practice, Chapter 8: Plant Ceel – Based Bioprocessing, Springer – Verlag Berlin Heidelberg, pp 323 – 324 Gupta S K., Liu R B., Liaw S Y., Chan H., Tsay H S (2011) Enhanced tanshinone production in hairy roots of ‘Salvia miltiorrhiza Bunge’ under the influence of plant growth regulators in liquid culture Botanical Studies, 52: 435-443 Hao G., Ji H., Li Y., Shi R., Wang J., Feng L., Huang L (2012) Exogenous ABA and polyamines enhanced salvianolic acids contents in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba Plant Omics Journal, 5(5): 446-452 Hu Z.B., Alfermann A.W (1993), “Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza”, Phytochemistry 32, pp 699-703 36 10 Larraburu E.E., Apóstolo N.M., and Llorente B.E (2012) In vitro propagation of pink lapacho: responese surface methodology and factorial analysis for optimisation of medium components Int J Fores Res 11 Li C H., Chi J L., Ching I K., Bau L H., Toshi M., 2001 Paphiopedilum cloning in vitro Sci Hortic 12 Parida R., Mohanty S., Kuanar A., Nayak S (2010) Rapid multiplication and in vitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissue culture Electron J Biotechnol., 13 Pierik R L M., Sprenkels P A., Harst B V D., Meys Q G V D., 1988 Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz In Vitro Sci Hortic 14 Priscila V.K, Maria Auxiliadora Milaneze and Maria de Fátima Pires da Silva Machado Effects of different combinations of growth regulators for bud induction from seedlings of Cattleya walkeriana Gardner (Orchidaceae) Maringá, v 25, n 1, p 179-182, 2003 15 Songjun Z., Kunlin W., Jaime A T S., Jianxia Z., Zhilin C., Nianhe X., Jun D., 2012 Asymbiotic seed germination, seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh, an endangered terrestrial orchid Sci Hortic 16 Vuylsteke D R 1989 Shoot Tip Culture for The Propagation, conservation and Exchange of Musa Germplasm, International Board for Plant Genetic Resources 37 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM IRRISTAT 4.0 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CHỒI IN VITRO CÂY SÂM BÁO BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN1 30/ 5/** 13: PAGE TN1: Anh huong cua nong duong VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 616560 * RESIDUAL 10 165400 154140 9.32 0.002 165400E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 781960 558543E-01 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE TN1 30/ 5/** 13: PAGE TN1: Anh huong cua nong duong VARIATE V004 LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT * RESIDUAL 12.2667 10 306667 3.06667 100.00 0.000 306667E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 12.5733 898095 - 38 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 30/ 5/** 13: PAGE TN1: Anh huong cua nong duong MEANS FOR EFFECT CT CT NOS CC LA 4.80000 6.66667 4.70000 6.33333 3 5.03000 7.66667 4.70000 5.66667 4.40000 5.00000 SE(N= 3) 5%LSD 10DF 0.742518E-01 0.101105 0.233970 0.318586 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 30/ 5/** 13: PAGE TN1: Anh huong cua nong duong F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % | | | | | CC 15 4.7260 0.23634 0.12861 2.7 0.0023 LA 15 6.2667 0.94768 0.17512 2.8 0.0000 39 | THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ IBA ĐẾN CHẤT LƯỢNG CHỒI CÂY SÂM BÁO BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN2 30/ 5/** 14: PAGE TN2: Anh huong cua IBA VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 19.7150 * RESIDUAL 10 161600 4.92876 305.00 0.000 161600E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 19.8766 1.41976 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE TN2 30/ 5/** 14: PAGE TN2: Anh huong cua IBA VARIATE V004 LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 30.2095 * RESIDUAL 10 233735 7.55238 323.12 0.000 233735E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 30.4432 2.17452 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 30/ 5/** 14: PAGE TN2: Anh huong cua IBA MEANS FOR EFFECT CT CC LA CT NOS 4.70000 5.66667 5.40000 8.40000 8.05000 9.99000 3 5.94000 6.05000 40 SE(N= 3) 5%LSD 10DF 5.20000 6.93333 0.733939E-01 0.882676E-01 0.231267 0.278134 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 30/ 5/** 14: PAGE TN2: Anh huong cua IBA F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % | | | | | CC 15 5.8780 1.1915 0.12712 2.2 0.0000 LA 15 7.6080 1.4746 0.15288 2.0 0.0000 41 | THÍ NGHIỆM 3: ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ GA3 ĐẾN CHẤT LƯỢNG CHỒI IN VITRO CÂY SÂM BÁO BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN3 30/ 5/** 14:20 PAGE TN3: Anh huong cua GA3 VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 11.1398 * RESIDUAL 2.78496 517.66 0.000 10 537995E-01 537995E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 11.1936 799546 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE TN3 30/ 5/** 14:20 PAGE TN3: Anh huong cua GA3 VARIATE V004 LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 24.3646 * RESIDUAL 6.09116 685.43 0.000 10 888666E-01 888666E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 24.4535 1.74668 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 30/ 5/** 14:20 PAGE TN3: Anh huong cua GA3 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS CC LA 4.70000 5.66667 5.58000 6.05000 6.94000 8.17000 3 5.02000 7.28000 42 SE(N= 3) 5%LSD 10DF 4.50000 4.38000 0.423476E-01 0.544263E-01 0.133439 0.171499 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 30/ 5/** 14:20 PAGE TN3: Anh huong cua GA3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % | | | | | CC 15 5.3680 0.89417 0.73348E-01 1.4 0.0000 LA 15 6.5093 1.3216 0.94269E-01 1.4 0.0000 43 | THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA TRẠNG THÁI MÔI TRƯỜNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CHỒI CÂY SÂM BÁO BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN4 30/ 5/** 14:31 PAGE TN4: Anh huong cua trang thai moi truong VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 17.1002 * RESIDUAL 516020E-01 860034E-02 8.55010 994.16 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 17.1518 2.14397 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE TN4 30/ 5/** 14:31 PAGE TN4: Anh huong cua trang thai moi truong VARIATE V004 LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 84.7202 42.3601 * RESIDUAL 353920E-01 589867E-02 ****** 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 84.7556 10.5945 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 30/ 5/** 14:31 PAGE TN4: Anh huong cua trang thai moi truong MEANS FOR EFFECT CT CT NOS CC LA 6.30000 15.8900 5.75000 12.3800 3 8.91000 8.38000 44 SE(N= 3) 0.535423E-01 0.443421E-01 5%LSD 6DF 0.185211 0.153386 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 30/ 5/** 14:31 PAGE TN4: Anh huong cua trang thai moi truong F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 9) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % | | | | | CC 6.9867 1.4642 0.92738E-01 1.3 0.0000 LA 12.217 3.2549 0.76803E-01 0.6 0.0000 45 | THÍ NGHIỆM 5: ẢNH HƯỞNG CỦA TỔ HƠP AUXIN/BA ĐẾN CHẤT LƯỢNG CHỒI IN VITRO CÂY SÂM BÁO BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN5 30/ 5/** 14:49 PAGE TN5: Anh huong cua to hop auxin/BA VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 1.24196 620978 * RESIDUAL 674667E-01 112445E-01 55.23 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 1.30942 163678 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE TN5 30/ 5/** 14:49 PAGE TN5: Anh huong cua to hop auxin/BA VARIATE V004 LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 39.6200 19.8100 * RESIDUAL 120001 200002E-01 990.49 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 39.7400 4.96750 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 30/ 5/** 14:49 PAGE TN5: Anh huong cua to hop auxin/BA MEANS FOR EFFECT CT CC LA CT NOS 4.28000 13.9000 4.33333 17.0000 3 3.52000 19.0000 46 SE(N= 3) 0.612222E-01 0.816501E-01 5%LSD 6DF 0.211777 0.282441 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 30/ 5/** 14:49 PAGE TN5: Anh huong cua to hop auxin/BA F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 9) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % | | | | | CC 4.0444 0.40457 0.10604 2.6 0.0003 LA 16.633 2.2288 0.14142 0.9 0.0000 47 | ... hành đề tài Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var septentrionalis Gagnep) 1.2 Mục đích nghiên cứu • Nghiên cứu ảnh hưởng... nhanh chồi chất lượng chồi in vitro 2.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng chồi in vitro số nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi in vitro Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến chất lượng chồi. .. xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày… tháng… năm 2015 Sinh viên Dương Thị Thanh Huyền ii TÓM TẮT Đề tài Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi cảm ứng tạo rễ tơ in vitro sâm báo (Abelmoschus sagittifolius