Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa cocos nucifera tại phú yên

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa Cocos nucifera tại Phú Yên” là công trình nghiên cứu của cá nhân tô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG

TRÁI CÂY TỪ NƯỚC DỪA Cocos nucifera TẠI PHÚ YÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG

TRÁI CÂY TỪ NƯỚC DỪA Cocos nucifera TẠI PHÚ YÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu

vang trái cây từ nước dừa Cocos nucifera tại Phú Yên” là công trình nghiên cứu của

cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Tác giả luận văn

Lê Thị Thúy Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng ban trường Đại học Nha Trang, trường Cao đẳng nghề Phú Yên đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của TS Thái Văn Đức và TS Lê Xuân Sơn đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài

Tiếp theo, tôi xin được dành lời cảm ơn đến Quí thầy cô Khoa CNTP – Hóa dầu

đã tạo điều kiện cho tôi về hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Và cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình và tất cả bạn

bè, đồng nghiệp vì những tình cảm của họ là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi, luôn ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Khánh Hòa , ngày 05 tháng 09 năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH x

TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ DỪA 3

1.1.1 Nguồn gốc và thành phần của quả dừa 3

1.1.2 Sản lượng dừa trong nước và trên thế giới 8

1.1.3 Các nghiên cứu bảo quản nước dừa 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN 11

1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm men 11

1.2.2 Giới thiệu về chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) 12

1.3 QÚA TRÌNH LÊN MEN RƯỢU ETHANOL VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 15

1.3.1 Quá trình lên men rượu ethanol 15

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 22

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH VỰC SẢN XUẤT RƯỢU VANG TRÁI CÂY 25

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước 25

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước 27

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 29

2.1.1 Nguyên liệu chính 29

2.1.2 Nguyên liệu phụ 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 30

2.2.2 Bố trí thí nghiệm kháo sát điều kiện bảo quản nước dừa 33

2.2.3 Bố trí thí nghiệm nhân giống nấm men 35

2.2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 35

2.2.5 Tối ưu hóa công đoạn lên men theo mô hình Box-Wilson .40

2.2.6 Nghiên cứu bảo quản sản phẩm rượu vang từ nước dừa 42

2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43

2.3.1 Thu và xử lý mẫu 43

2.3.2 Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan 43

2.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa học 44

2.3.4 Phương pháp phân tích vi sinh vật 44

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CỦA NƯỚC DỪA PHÚ YÊN 45

3.2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN NƯỚC DỪA 46

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng nước dừa sau thời gian bảo quản 24 giờ 46

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến chất lượng nước dừa sau thời gian bảo quản 24 giờ 47

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng nước dừa 48

3.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NƯỚC DỪA 48

3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN 50

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô hòa tan đến chất lượng rượu vang trái cây từ nước dừa 50

3.4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men đến chất lượng rượu vang trái cây từ nước dừa 53

3.4.3 Ảnh hưởng của pH dịch lên men đến chất lượng rượu vang trái cây từ nước dừa 55

3.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng rượu vang trái cây từ nước dừa 57

3.4.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất lượng rượu vang trái cây từ nước dừa 59 3.5 TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN LÊN MEN 65 3.6 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN SẢN PHẨM RƯỢU VANG TRÁI CÂY

TỪ NƯỚC DỪA 70 3.6.1 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu hóa lí và vi sinh của sản phẩm sau thời gian bảo quản 70 3.6.2 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm sau thời gian bảo quản 72 3.7 ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG TRÁI CÂY TỪ NƯỚC DỪA 74 3.7.1 Qui trình 74 3.7.2 Thuyết minh quy trình 75 3.8 TÍNH TOÁN SƠ BỘ CHI PHÍ GIÁ THÀNH SẢN PHẨM TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

ANOVA Analysis Of Variance: Phân tích phương sai

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần khoáng của nước dừa trưởng 6

Bảng 1.2 Bảng so sánh thành phần hóa học của nước dừa già và nước dừa non 7

Bảng 1.3 Diện tích trồng dừa và sản lượng thu được của các tỉnh đến năm 2014 8

Bảng 1.4 Diện tích trồng và sản lượng dừa thu được của tỉnh Phú Yên năm 2014 9

Bảng 1.5 Bảng Diện tích, sản lượng dừa các nước .10

Bảng 2.1 Miền thí nghiệm của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 41

Bảng 2.2 Điều kiện thí nghiệm 41

Bảng 2.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm và số lượng thí nghiệm 41

Bảng 2.4 Địa điểm và thời gian thu mẫu để nghiên cứu 43

Bảng 3.1 Hàm lượng một số thành phần hóa học chủ yếu trong nước dừa 45

Bảng 3.2 Hàm lượng chất khô còn lại sau thời gian lên men 12 ngày 51

Bảng 3.3 Nồng độ Ethanol tại các điều kiện khác nhau 66

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các biến độc lập đến nồng độ Ethanol 67

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phương sai ANOVA nồng độ cồn (Ethanol) 68

Bảng 3.6 Kết quả thực nghiệm kiểm tra kết quả tối ưu 70

Bảng 3.7 Kết quả các chỉ tiêu sau thời gian bảo quản 71

Bảng 3.8 Bảng điểm đánh giá cảm quan của sản phẩm A và sản phẩm B 73

Bảng 3.9 Hoạch toán chi phí thành phẩm 76

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây dừa 3

Hình 1.2 Cấu tạo quả dừa 4

Hình 1.3 Sự phát triển của quả dừa .5

Hình 1.4 Quả dừa già khi thu hoạch 9

Hình 1.5 Hình dạng tế bào nấm men 13

Hình 1.6 Tế bào nấm men nẩy chồi để lại sẹo lồi 13

Hình 2.1 Quả và nước dừa già 12 tháng tuổi 29

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 31

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 33

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của pH 34

Hình 2.5 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản 34

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi tăng sinh khối nấm men 35

Hình 2.7 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất khô hòa tan 36

Hình 2.8 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men 37

Hình 2.9 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của pH 38

Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 38

Hình 2.11 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men hiếu khí 39

Hình 2.12 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men kỵ khí 40

Hình 2.13 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản sản phẩm 43

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng của nước dừa 46

Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến chất lượng cảm quan nước dừa 47

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng nước dừa 48

Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của S cerevisiae trên môi trường nước dừa 49

Hình 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô đến quá trình lên men 51

Hình 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô đến giá trị cảm quan sản phẩm 52

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men đến hàm lượng chất khô 53

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men đến độ cồn thu được 53

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men đến giá trị cảm quan sản phẩm 54

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng chất khô 55

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến độ cồn thu được 55

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến giá trị cảm quan sản phẩm 57

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng chất khô 58

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ cồn thu được 58

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến giá trị cảm quan sản phẩm 59

Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian lên men hiếu khí đến hàm lượng chất khô còn lại .60

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian lên men hiếu khí đến quá trình lên men 61

Hình 3.18 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng chất khô còn lại 63

Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian lên men kỵ khí đến hàm lượng acid tổng số 63

Hình 3.20 Ảnh hưởng của thời gian lên men kỵ khí đến độ cồn sinh ra 64

Hình 3.21 Mặt đáp tối ưu thực nghiệm của các yếu tố đến nồng độ cồn 69

Hình 3.22 Sản phẩm đánh giá cảm quan 73

Hình 3.23 Kết quả đánh giá cảm quan của 2 sản phẩm rượu vang 73

Hình 3.24 Qui trình sản xuất rượu vang từ nước dừa 74

TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN

Tên luận văn: “Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa

Cocos nucifera tại Phú Yên”

Mục tiêu đạt được là: Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa Phú Yên nhằm sản xuất sản phẩm đồ uống có lợi cho sức khỏe và đa dạng hóa các sản phẩm từ dừa

Các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm được sử dụng bao gồm các phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan, phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa học (protein, tro, lipit, aldehyt, methanol, độ cồn, acid tổng số, diaxetyl, SO2 tổng,…)

và phương pháp phân tích vi sinh vật Các phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả đảm bảo yêu cầu khách quan về độ chính xác cho phép với sự hỗ trợ của phần mềm Ms Excel 2010 và SPSS 16.0

Kết quả phân tích một số thành phần hóa học chủ yếu của nước dừa 12 tháng tuổi

Cocos nucifera thu mẫu ở Huyện Sông cầu tỉnh Phú Yên cho thấy hàm lượng chất khô

hòa tan 4,10 ± 0,000Bx; pH 5,43 ± 0,06; hàm lượng đường khử 0,34 ± 0,05%; hàm lượng đường tổng 2,13 ± 0,06%; hàm lượng protein 0,77 ± 0,03%; hàm lượng tro 0,41

± 0,05%; hàm lượng lipit 0,15 ± 0,04%

Luận văn đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá trình bảo quản nước dừa nguyên liệu theo phương pháp cảm quan Kết quả cho thấy ở điều kiện nhiệt độ 100C

và pH 5, thời gian bảo quản có thể kéo dài đến 18 ngày

Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá trình lên men rượu vang trái cây từ nước dừa với: Hàm lượng chất khô 22%, thời gian lên men 10 ngày, tỉ lệ nấm men 6,5% so với dịch lên men, pH dịch lên men 4,6, nhiệt độ lên men 310C thu được rượu vang trái cây có độ cồn 9,67%

Luận văn đã xây dựng qui trình sản xuất sản phẩm rượu vang trái cây từ nước dừa Cocos nucifera Phú Yên và sản phẩm rượu vang trái cây từ nước dừa sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm về hóa học và vi sinh vật, với chi phí nguyên vật liệu là 49.000 đồng /500ml sản phẩm

Từ khóa: Phú Yên, nước dừa, lên men, rượu vang, nấm men Saccharomyces cerevisiae

MỞ ĐẦU

Rượu vang trái cây đã được con người biết đến và sử dụng cách đây vài thế kỷ Dần dần sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt khi ngành công nghệ thực phẩm và công nghệ vi sinh ngày càng phát triển thì các sản phẩm về rượu vang được cải tiến không ngừng về chất lượng và cả về chủng loại nhằm đáp ứng thị hiếu người tiêu dùng Hơn nữa, con người ngày càng hiểu rõ hơn giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh

tế của các sản phẩm về rượu vang trái cây mà giờ đây chúng có mặt hầu hết các nước trên thế giới

Việt Nam là một nước nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới ẩm với đa dạng các loại cây trái: nho, xoài, dứa, mít, rất thích hợp cho sản xuất rượu vang trái cây, trong đó quả dừa cũng không ngoại lệ

Dừa phát triển tốt trên đất pha cát và có khả năng chống chịu mặn tốt cũng như

ưa thích các nơi sinh sống có nhiều nắng và lượng mưa trung bình (750 ÷ 2.000 mm) hàng năm, điều này giúp nó trở thành loại cây định cư bên các bờ biển nhiệt đới một cách tương đối dễ dàng [63] Ở Phú Yên, dừa được trồng nhiều trên khắp miền quê từ miền núi đến đồng bằng đặc biệt là những vùng ven biển như: Sông Cầu, Tuy An,… Thành phần của nước dừa bao gồm các hợp chất carbohydrate (glucose, fructose, sucrose và sorbitol), các acid amin thiết yếu (lysine, histidine, tyrosine và tryptophan)

và một phần nhỏ các acid hữu cơ (acid tartaric, citric và malic), protein, các loại vitamin, khoáng chất, thích hợp cho quá trình lên men [37], [48], [53], [64] Tuy nhiên, hiện tại, đa số các nhà máy chế biến các sản phẩn từ trái dừa như cơm dừa sấy, dầu dừa, nước dừa chưa được tận dụng mà phải đổ thải, gây lãng phí, gây ô nhiễm môi trường

Nhằm tận dụng nước dừa để tạo ra loại rượu vang mang đậm hương vị Việt, có lợi cho sức khỏe, làm tăng giá trị từ trái dừa, đồng thời giải quyết đề ô nhiễm môi

trường, việc “Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa Cocos

nucifera tại Phú Yên” là cần thiết

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa Phú Yên nhằm sản xuất sản phẩm đồ uống có lợi cho sức khỏe và đa dạng hóa các sản phẩm từ dừa

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá hàm lượng một số thành phần hóa học chủ yếu trong nước dừa Phú Yên

- Nghiên cứu điều kiện bảo quản nước dừa nguyên liệu

- Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

- Tối ưu hóa điều kiện lên men rượu

- Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm đồ uống lên men từ nước dừa theo thời gian bảo quản

- Sơ bộ tính giá chi phí nguyên vật liệu

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề tài rượu vang trái cây sản xuất từ nước dừa Phú Yên là ý tưởng mới, chưa ai thực hiện và có tính khả thi cao Kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa khoa học và

là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy về kỹ thuật lên men rượu vang nói chung và lên men rượu vang trái cây từ nước dừa nói riêng

Kết quả của đề tài là cơ sở để các doanh nghiệp nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa, góp phần làm tăng thu nhập của người dân, phát triển kinh tế địa phương vùng trồng dừa

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nước dừa từ các quả dừa có độ chín khoảng 12 tháng tuổi của giống dừa ta Cocos

nucifera được trồng tại các vùng ven biển thuộc huyện Sông Cầu của tỉnh Phú Yên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Dừa được tìm thấy trên khắp các vùng có khí hậu nhiệt đới, đặc biệt là các vùng

có vị trí thấp Nó đã được biết đến từ hàng ngàn năm và không ai biết “quê hương” của

nó, có lẽ những nơi có khả năng nhất là Malaysia hay Indonesia, nhưng một điều chắc chắn, nó đã được lan truyền thông qua các vùng nhiệt đới bởi con người và đã trở thành một tính năng tiêu biểu [49]

Cây dừa di thực đến Việt Nam từ thế kỷ XIX, được phổ biến vào đầu thế kỷ XX chủ yếu ở các tỉnh Trung bộ và Nam bộ đặc biệt là Bến Tre, do sự du nhập giống dừa

từ các thương thuyền của những doanh nhân từ Malaysia, Philippin ra vào các cảng biển Việt Nam thời đó [65] Ngày nay, Việt Nam là một trong những quốc gia có diện tích trồng dừa cao trong khu vực Dừa được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như Bến Tre đang dẫn đầu cả nước về diện tích trồng dừa với 45.000ha trong tổng số 150.000ha của cả nước [65] Ở một số tỉnh ven biển miền trung như Bình Định là tỉnh có diện tích trồng dừa lớn thứ hai cả nước sau Bến Tre với gần 13.000ha Ở miền Bắc vùng trồng dừa nhiều nhất là Thanh Hóa với sản lượng hàng năm khoảng 40 triệu trái, chiếm đến 2/3 tổng sản lượng dừa quả ở miền Bắc [2]

Cây dừa là cây trồng lâu năm quanh năm Thông thường nó ra hoa mỗi tháng Cây có thể tồn tại hơn 70 năm và cho ra dừa đến 13 lần một năm [36]

Trong bối cảnh kinh tế phát triển theo hướng kỹ thuật cao ngày nay, cây dừa không chỉ đơn thuần có giá trị thương mại mà còn có giá trị xã hội Người ta ước tính

có khoảng 100 sản phẩm được làm trực tiếp từ dừa, chẳng hạn: nhiều sản phẩm thực phẩm như kẹo dừa, thạch dừa, cơm dừa sấy, sữa bột dừa, dầu; các sản phẩm mỹ nghệ như: vỏ dừa cắt, thảm xơ dừa… hoặc phân bón từ mụn dừa [2], [65]

1.1.1.2 Thành phần sinh hóa của quả dừa

Trái dừa thuộc loại quả hạch, nhân cứng Trái gồm có ba phần là ngoại quả bì (phần vỏ bên ngoài được phủ cutin), trung quả bì (xơ dừa) và nội quả bì bao gồm gáo, nước và cơm dừa

Hình 1.2 Cấu tạo quả dừa

Quả dừa phải mất từ 11 đến 12 tháng mới trưởng thành đầy đủ Sau 5 tháng, quả bắt đầu hình thành một lớp mỏng thạch xung quanh bên trong của vỏ nâu cứng Nước dừa là chất lỏng bên trong trái dừa non (quả của cây dừa) Khi quả chín, nước dừa đang dần thay thế bằng cơm dừa và không khí (hình 1.3) Từng ngày, cơm dừa phát triển và thay thế nước bằng tế bào lưu trữ chất béo [33] Khi trưởng thành đầy đủ (12 tháng), nước dừa chiếm khoảng 15% đến 30% trọng lượng của quả Lượng nước dừa

có thể được thu hoạch từ mỗi quả là khoảng 300 ml, nhưng phụ thuộc rất lớn vào giai đoạn trưởng thành và sự đa dạng của dừa

Hình 1.3 Sự phát triển của quả dừa [20]

1.1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa

Nước dừa nằm trong khoang bên trong quả là vô trùng và có chứa các thành phần như đường hòa tan, protein, các chất chống oxi hóa, các vitamin, khoáng chất và một lượng rất nhỏ chất béo, chúng là nguồn cung cấp và tạo ra cân bằng điện giải đẳng trương tốt cũng như là nguồn thực phẩm bổ dưỡng Trung bình một trái dừa có chứa 300ml nước, chiếm khoảng 22% trọng lượng trái dừa [20]

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để hiểu những thay đổi về hàm lượng dinh dưỡng của trái dừa trong giai đoạn trưởng thành của chúng Chất béo và hàm lượng đạm đã được tìm thấy tăng từ tháng sáu cho đến khoảng chín tháng, điều này được cho

là do sự phát triển nội nhũ [36]

Đường là phần chính của chất rắn hòa tan trong nước dừa [40], [45] Trong nước dừa non ban đầu chủ yếu đường tồn tại ở dạng glucose và fructose Trong những tháng đầu của quá trình trưởng thành, lượng đường sẽ tăng từ 1,5% lên khoảng 5,0 ÷ 5,5% Các loại đường chính trong nước dừa trưởng thành là sucrose, sorbitol, glucose và fructose [27], [44], tiếp theo là các loại đường nhỏ bao gồm galactose, xylose và mannose Theo thời gian trưởng thành của quả dừa, đường sucrose tăng và hàm lượng đường glucose và fructose giảm dần trong nước dừa [36], [59]

Trong nước dừa già có chứa các loại đường khử (glucose và fructose) và đường không khử (saccharose), trong đó đường saccharose chiếm khoảng 90% tổng hàm lượng đường Hàm lượng đường tổng trong nước dừa già (12 tháng tuổi) đạt 3,42g/100g [35], [48], thích hợp làm nguồn cung cấp carbon trong quá trình lên men Thành phần thứ hai về số lượng là khoáng, chiếm 0,4% đến 1% khối lượng chất lỏng, nhưng có hầu hết các chất khoáng cần thiết cho cơ thể như canxi, sắt, magiê, phốt pho, kali và natri [20], đặc biệt kali là nguyên tố khoáng chính trong nước dừa [45]

Bảng 1.1 Thành phần khoáng của nước dừa trưởng thành, theo các tác giả

khác nhau thể hiện trong danh sách tài liệu tham khảo

Santoso U

và cộng sự (1996) [45]

Thành phần vitamin C trong nước dừa thay đổi từ 20 ÷ 40mg/l Đây không phải

là cao so với các loại trái cây khác như cam hoặc sơ ri, nhưng nó đủ để ngăn chặn quá trình oxi hóa trong một thời gian [29] Các vitamin nhóm B có mặt trong nước dừa như: B1, B2, B3, B5, B6, B7 và B9 [50] với 0,64 mg/ml acid nicotic và 0,52 mg/ml acid panthotenic [52]

Trong nước dừa, protein chiếm khoảng 0,1%, có chứa acid amin alanine, arginine, cysteine và serine với hàm lượng nhỏ, không cân đối nên không đủ nguồn nitơ cho nấm men sử dụng [50] Do đó, trong quá trình lên men phải cung cấp thêm nguồn nitơ cho nấm men [20]

Bảng 1.2 Bảng so sánh thành phần hóa học của nước dừa già và nước dừa non [48]

Loại dừa

(6 tháng)

Trưởng thành (12 tháng)

1 Trung bình trọng lượng của

Ngoài đường, khoáng chất, protein, vitamin, một phần nhỏ bao gồm các hợp chất thơm Nước dừa có một hương vị đặc trưng nhờ vào các acid hữu cơ malic, succinic, citric, tartaric và acid axetic [48], [54]

Các hợp chất chính của nước dừa trưởng thành là nonanal (14,2%), nonanol (11,2%), heptanal (8,2%), octanoate ethyl (6,2%), heptanol (5,3%) và 2-nonanol (5,1%), octalactone (12,6%), ethyl octanoate (9,6%), nonanal (8,4%), acid nonanoic (7,2%), decanol (6,8%), decanal (6,2%) và nonanol (6,1%) Rượu, xeton, thiol, acid cacboxylic, phenol và este với chuỗi carbon ngắn cũng được phát hiện trong tinh dầu của nước dừa [25]

Độ pH của nước dừa dao động từ gần 4,5 lên đến gần 6 [22], [26], [31], [36], [43] Nước dừa cũng có chứa các enzym gây ra màu nâu trong cả nước và thịt dừa, trong đó có một enzym là phenoloxidase (PPO) [41] Vì sự thay đổi theo thời gian và

sự hiện diện của enzym, nên khi sản xuất, nước dừa phải chọn đúng tháng tuổi để thu hoạch dừa và thường cho phép bảo quản không quá một tuần ở nhiệt độ làm lạnh nếu nước dừa chưa được chế biến hoặc xử lý [36], [57]

1.1.2 Sản lượng dừa trong nước và trên thế giới

Tại Việt Nam, theo Niên giám thống kê các tỉnh Khánh Hòa, Bình Định, Bạc Liêu, Tiền Giang, Bến Tre, diện tích trồng dừa và sản lượng thu hoạch dừa được thể hiện tại bảng 1.3 [61]

Bảng 1.3 Diện tích trồng dừa và sản lượng thu được của các tỉnh đến năm

2014

(ha)

Diện tích thu hoạch (ha)

Sản lượng (tấn/triệu trái)

Từ bảng 1.3 cho thấy diện tích trồng dừa và sản lượng dừa thu hoạch được tại tỉnh Bến tre là lớn nhất, kế đến là Tiền Giang, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa Riêng tỉnh Phú Yên, diện tích và sản lượng dừa ở một số địa phương tính đến năm 2014 được thể hiện tại bảng 1.4 [61]

Bảng 1.4 Diện tích trồng và sản lượng dừa thu được của tỉnh Phú Yên năm

2014

trồng (ha)

Diện tích thu hoạch (ha)

Sản lượng (tấn/triệu trái)

Như vậy, dựa số liệu thống kê (bảng 1.4) cho thấy Thị Xã Sông Cầu có diện

tích trồng dừa và sản lượng thu hoạch lớn nhất tỉnh Phú Yên

Hình 1.4 Quả dừa già khi thu hoạch

Trên thế giới, theo số liệu của FAO (2011), có khoảng 11,86 triệu ha đất canh tác dừa Cây dừa được phân bố nhiều nhất ở vùng Đông Nam Á (60,89%); Nam Á

(19,74%); Châu Đại Dương (4,6%) Các quốc gia có diện tích canh tác dừa lớn là Indonesia, Philippines và Ấn Độ chiếm 3/4 diện tích dừa thế giới, Việt Nam chỉ chiếm xấp xỉ 1% diện tích dừa thế giới

Bảng 1.5 Bảng Diện tích, sản lượng dừa các nước [61]

(ha)

Sản lượng (triệu trái/năm)

Từ bảng 1.5 cho thấy sản lượng dừa thế giới tùy thuộc vào khả năng thâm canh

ở mỗi quốc gia Hai nước có diện tích lớn là Indonesia và Philippines nhưng sản lượng dừa thu được lại thấp, trong khi một vài nước khác như Ấn Độ, Sri Lanka Đặc biệt, tại Việt Nam diện tích trồng dừa thấp nhưng sản lượng thu được cao hơn nhiều

1.1.3 Các nghiên cứu bảo quản nước dừa

Ở nước ta đang có một số giải pháp bảo quản quả dừa tươi như ”phương pháp

lạnh sâu nhanh” (ở âm 35 đến 40 độ C, và bảo quản ở âm 18 độ C), giải pháp này đáp

ứng được yêu cầu bảo quản quả dừa tươi để phục vụ xuất khẩu, tuy nhiên hạn chế là giá thành khá cao và quả dừa không còn chất tươi mà đã là sản phẩm đông lạnh Một

giải pháp khác là ”bơm thẳng hóa chất bảo quản vào bên trong quả dừa”, hạn chế của

giải pháp này là làm thay đổi chất lượng bên trong quả dừa (có sự hiện diện của hóa chất trong nước dừa)

Khắc phục hạn chế của hai phương pháp trên, Trần Yên Thảo (2006) - Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, đã khảo sát và phát hiện chất metabisulfit natri - loại hóa chất được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm - có thể dùng để xử lý bề mặt bên ngoài gáo dừa (dừa đã bóc lớp vỏ bên ngoài) Nghiên cứu khảo sát cho thấy với một liều lượng sử dụng và thời gian xử lý thích hợp, metabisulfit natri chỉ tồn tại bên ngoài vỏ quả dừa, vừa có tác dụng làm trắng vừa có khả năng tiêu diệt vi sinh vật bên

ngoài gáo dừa Do hóa chất không ngấm vào bên trong, cơm và nước dừa giữ được tính tự nhiên Sau khi được xử lý bề mặt bằng hóa chất metabisulfit natri, quả dừa sẽ tiếp tục được bao bọc bằng một màng bao (chuyên dùng bảo quản trái cây) và bảo quản ở khoảng 50C Với hướng xử lý này quả dừa sẽ giữ được mức độ tươi nguyên (màu sắc bên ngoài quả dừa vẫn trắng, không bị hóa nâu) trong khoảng từ 4 ÷ 6 tuần lễ [16], [62]

Wijeratnam và cộng sự (2006) đã tiến hành các nghiên cứu bảo quản dừa ở nhiệt

độ thấp và quan sát thấy rằng quả dừa bảo quản tốt nhất ở nhiệt độ 13,50C trong 28 ngày với phương pháp nhúng trong sáp, trong khi quả dừa được bảo quản ở 28 ± 20C, cho thấy sự xấu đi hoàn toàn sau 7 ngày [58]

Theo Jackson và cộng sự (2004), Walter và cộng sự (2009), nước dừa tươi cho phép bảo quản không quá một tuần ở nhiệt độ làm lạnh [36], [57]

Theo Chowdhury M G F và cộng sự (2009) nước dừa thanh trùng ở nhiệt độ

1000C trong 10 phút được bảo quản trong chai thủy tinh cho chất lượng tốt nhất sau 6 tháng cất giữ ở nhiệt độ phòng [24]

Theo Đống Thị Anh Đào và cộng sự (2007) đã tạo ra sản phẩm nước dừa đóng lon có thành phần dinh dưỡng hầu như không đổi so với nguyên liệu ban đầu, đặc biệt

là vẫn giữ được hương vị đặc trưng của nước dừa tươi với thời gian bảo quản trên 3 tháng [5]

Theo L.A.Nakano và cộng sự (2012), nước dừa còn được bảo quản bằng phương pháp siêu lọc và tiệt trùng Siêu lọc được tiến hành trong một đĩa và bộ khung bao gồm màng 20 kDa, quy trình được tiến hành ở áp suất 5 bar và 150C, dòng thấm được đo dọc theo quy trình, lưu lượng thấm trung bình trong siêu lọc là 13 L/hm2 Sau đó được tiệt trùng ở 960C trong 20 giây [39]

1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN

1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm men

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau hình tròn, hình trứng như

Sacharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh

như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigu hoặc hình ống dài như Pichia Một số tế bào nấm men có hình dài, nối tiếp nhau tạo thành

dạng sợi gọi là khuẩn ty giả như Endomyces, Endomycopsis, Candida Nhiều loài nấm

men chỉ tạo khuẩn ty giả khi sống trong môi trường thiếu oxy [13] Nói chung hình dáng của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác nhau, trong cùng một loài hình dáng của tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy

và tuổi của tế bào Tế bào nấm men có kích thước trung bình 3 ÷ 5 × 5 ÷10µm, kích thước của tế bào nấm men thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, giống và điều kiện của môi trường sống Trong môi trường lỏng có nhiều loài nấm men có khả năng sinh ra

một lớp màng bao như tấm voan mỏng như ở Saccharomyces Trên môi trường đặc,

khuẩn lạc nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nẩy chồi vẫn dính với nhau tạo thành chuỗi [13]

1.2.2 Giới thiệu về chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) 1.2.2.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S cerevisiae

Phân loại:

Bộ: Saccharomycetales

Họ: Saccharomycetaceae

Giống: Saccharomyces

Loài: Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae thuộc nhóm vi sinh vật rất phổ biến trong tự nhiên

Đây là loài nấm men được sử dụng lâu đời trong lên men cồn và sản xuất bánh mì Chúng có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5 ÷ 14μm, khuẩn lạc của chúng dạng bột nhão, màu trắng

S cerevisiae lên men hầu hết các loại đường trừ lactose và cellobiose Tuy nhiên,

khả năng tăng trưởng của S cerevisiae trên các loại đường khác nhau là khác nhau [23] S cerevisiae sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi nhưng cũng có thể sinh sản hữu tính S cerevisiae là loài có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, ở

điều kiện hiếu khí sinh trưởng tăng sinh khối nhanh, điều kiện yếm khí chủ yếu lên men tạo cồn; pH để nấm men phát triển trong khoảng 4 ÷ 6,8, tối ưu ở pH 5,8; nhiệt độ nấm men phát triển trong khoảng 27 ÷ 350C, tối ưu ở 320C

Nguồn dinh dưỡng carbohydrate chính là các loại đường, thích hợp nhất là đường fructose, có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ lẫn hữu cơ

1.2.2.2 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của nấm men, tế bào nấm men sẽ tăng kích thước và tăng nhanh khối lượng tế bào Tuy nhiên, sinh trưởng và phát triển không phải lúc nào cũng diễn ra đồng thời, nhất là trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tế bào nấm men vẫn có khả năng sinh sản nhưng kích thước tế bào nhỏ hơn nhiều so với điều kiện đầy đủ dinh dưỡng

Hình 1.5 Hình dạng tế bào nấm men Hình 1.6 Tế bào nấm men nẩy chồi để

lại sẹo lồi

Sự sinh trưởng của tế bào nấm men trong môi trường đủ chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy thích hợp thì nấm men vừa tăng nhanh về kích thước, đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều

Nấm men sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi, nên trong dịch nuôi cấy luôn có

tế bào già Khi chồi non tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập thì nơi đó để lại vết sẹo (hình 1.6) và ở đó không có khả năng tạo thành chồi mới nữa, có như thế tế bào mẹ chuyển thành già

Khi tiến hành nuôi cấy nấm men theo phương pháp tĩnh tế bào thường phát triển qua 5 giai đoạn:

- Giai đoạn tiềm phát là khoảng thời gian tế bào làm quen với môi trường và điều kiện mới, chưa sinh sản mà chỉ tăng dần kích thước Pha này được tính từ khi nuôi cấy đến khi tế bào sinh trưởng và phát triển Pha này dài hay ngắn tùy thuộc vào tuổi sinh

lý nấm men đưa vào nuôi và chất lượng môi trường

- Giai đoạn logarit là khoảng thời gian tế bào phát triển nhanh nhất, sinh khối tăng mạnh kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ thành phần dung dịch nuôi Hầu hết tế bào ở trạng thái trẻ, có hoạt tính sinh học cao

- Giai đoạn chậm dần là khoảng thời gian tốc độ sinh trưởng còn nhưng tốc độ sinh sản của tế bào bị giảm xuống, lượng sinh khối có tăng nhưng ít cho đến khi bước vào thời kỳ sinh trưởng cân bằng của tế bào nấm men

- Giai đoạn ổn định là khoảng thời gian được đánh giá bằng chỉ số về số lượng tuyệt đối của tế bào trong dịch nuôi sinh ra gần bằng số tế bào chết đi, tuy nhiên vẫn

có tế bào nẩy chồi, tế bào chết nhưng rất ít Chất dinh dưỡng trong môi trường giảm đi

rõ rệt, các chất tạo ra do quá trình trao đổi chất lớn nhất, lượng sinh khối nói chung đạt cao nhất

- Giai đoạn chết hay pha tử vong là khoảng thời gian tốc độ chết của tế bào cao hơn tốc độ sinh sản do lượng tế bào chết tăng nhanh, tế bào sống giảm dần và tổng lượng sinh khối còn giảm do hiện tượng tự phân của tế bào Nguyên nhân của hiện tượng này là do nguồn dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, tế bào bắt đầu giai đoạn già và sản phẩm trao đổi chất nhiều gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào

1.2.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của S cerevisiae

Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của S.cerevisiae Tùy

theo mục đích nuôi cấy mà đảm bảo các yếu tố về nồng độ các chất và áp suất thẩm

thấu của môi trường, nhiệt độ, oxy, pH môi trường, …

Nồng độ các chất và áp suất thẩm thấu của môi trường: Áp suất thẩm thấu của môi trường phụ thuộc vào hàm lượng đường và các chất hòa tan khác Hàm lượng các chất này trong môi trường nuôi cao hơn trong tế bào Sự chênh lệch này là do chất dinh dưỡng hòa tan hơn trong môi trường dễ thấm vào tế bào qua màng Độ chênh càng lớn thì sự tích tụ nấm men càng nhanh Tuy nhiên, nếu áp suất trong môi trường quá cao sẽ xảy ra hiện tượng làm co nguyên sinh chất của tế bào Vì vậy phải nghiên cứu thành phần nuôi của môi trường thích hợp để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men được tốt nhất

Nhiệt độ: Các phản ứng sinh hóa diễn ra trong tế bào nấm men đều chịu sự chi phối bởi nhiệt độ Nhiệt độ tối thích của sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong khoảng 25 ÷ 300C Khi nhiệt độ giảm, tốc độ phát triển sinh khối của nấm men giảm dần và hoàn toàn bị ức chế ở nhiệt độ 2 ÷ 50C Khi nhiệt độ tăng quá cao, sinh trưởng của nấm men sẽ bị ức chế, ở nhiệt độ lớn hơn 400C các enzyme trong nấm men

bị giảm 50% hoạt tính, sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ngừng lại, khi đó nấm men bắt đầu chết Ở nhiệt độ khoảng 60 ÷ 640C nấm men sẽ chết [1]

Nhu cầu oxy: Đối với nấm men, nhu cầu oxy trong từng giai đoạn sinh trưởng là khác nhau, thời kỳ sinh khối còn ít mà hàm lượng oxy hòa tan còn lớn thì không cần thông khí nhiều Mức độ thông khí sẽ tăng dần theo sự tích lũy sinh khối trong môi trường nuôi Oxy tham gia trực tiếp vào quá trình tổng hợp protein của tế bào, tạo sinh khối và là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi Sinh sản của nấm men đủ mạnh nếu môi trường đủ oxy, làm tăng các phản ứng tổng hợp protein của tế bào Lượng oxy cho vào đều và nhanh thì sinh khối tế bào lớn, ít tổn thất đường do quá trình lên men rượu hay sản phẩm phụ khác tạo thành

pH của môi trường: Trong quá trình nuôi nếu pH thay đổi thì sinh trưởng, phát triển của tế bào nấm men biến đổi theo Vì vậy, khi nuôi cấy nấm men phải có sự điều chỉnh pH cho phù hợp pH phù hợp cho nấm men phát triển trong khoảng 4 ÷ 5, Ở khoảng pH<2 hoặc pH>7,5, nấm men bị ức chế và ngừng phát triển

Tuy nhiên, nấm men lại không có khả năng tăng trưởng trong môi trường có

chứa lipit Vì thế, nếu trong môi trường có lipit thì S cerevisiae không tăng trưởng

được [34], [39], [56]

1.3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU ETHANOL VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

1.3.1 Quá trình lên men rượu ethanol

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người

ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí (kị khí) và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình hô hấp kị khí, trong đó đường bị phân thành rượu ethanol và CO2 dưới tác dụng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm men

Phương trình phản ứng tổng quát:

C6H12O6 nấm men 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4 KJ

1.3.1.1 Các giai đoạn lên men rượu [28], [47]

Có thể chia quá trình lên men rượu thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn tăng sinh khối nấm men: giai đoạn này nấm men nảy chồi và phát triển mạnh để tăng sinh khối vì trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng và có mặt của oxy Giai đoạn lên men: Khi thiếu oxy, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống biến đổi đường thành rượu, CO2 và sản phẩm phụ là glyceryl, acid succinic, một số aldehyde, rượu cao phân tử,… Quá trình này thực chất rất phức tạp, gồm nhiều phản ứng hóa học liên tiếp để tạo thành ethanol [28], [47]

+ Quá trình phân giải yếm khí bắt đầu từ phosphorin hóa đường Dưới tác dụng của enzyme hexokinase, một nhóm phosphat của ATP được xúc tác chuyển đến glucose và tạo thành glucose-6-phosphat

+ Dưới tác dụng của glucosephosphatisomerase sẽ chuyển glucose-6-phosphat thành fructose-6-phosphat

+ Tiếp đến giai đoạn phosphorin hóa mới, dưới tác dụng của enzyme phosphofructokinase cơ chất fructose-6-phosphat được chuyển hóa thành fructose - 1,6-diphosphat

+ Tiếp đến giai đoạn phân hủy fructose-1,6-diphosphat dưới tác dụng của

enzyme aldolase thành hai phân tử phosphotrimose là: phosphoglyceraldehyd (PGA)

Dưới tác dụng của enzyme glyceraldehyde phosphatdehydrogenase, 3-phosphat bị oxy hóa và phosphorin hóa để tạo thành acid-1,3-diphosphoglyceric

glyceraldehyd-+ Giai đoạn tạo thành ATP và acid 3-phosphoglyceric Giai đoạn này được xúc tác của enzyme phosphoglycerickinase

Năng lượng được giải phóng ra trong phản ứng này lập tức được dự trữ trong ATP do phosphat chưa liên kết cao năng được chuyển từ acid-1,3-diphosphoglyceric đến ADP và tạo thành ATP

+ Giai đoạn tiếp theo, acid 3-phosphoglyceric được chuyển hoá thành acid phosphoglyceric

2-+ Giai đoạn tạo thành acid phosphoenolpyruvic (PEP) như enzyme enolase Do mất một phân tử nước nên acid 2-phosphoglyceric phân bố lại năng lượng nội phân tử

và chuyển hoá thành acid phosphoenolpyruvic này chưa liên kết cao năng

+ Tạo thành ATP và enolpyruvic

Dưới tác dụng của phosphotransferase (hay pyruvatphosphokinase) gốc acid phosphoric có liên kêt cao năng, được chuyển từ acid phosphoenolpyruvic đến ADP và tạo thành ATP và acid enolpyruvic

+ Sự tạo thành acid enolpyruvic là hợp chất không bền vững và sẽ chuyển thành acid pyruvic bền vững hơn

+ Dưới tác dụng của enzyme pyruvat decarboxylase phân tử acid pyruvic sẽ bị khử CO2 và tạo thành acetaldehyde

+ Sau đó acetaldehyde được khử thành ethanol dưới tác dụng của enzyme alcohol dehydrogenase

1.3.1.2 Sự tạo thành các sản phẩm phụ trong quá trình lên men rượu ethanol

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là ethanol và CO2 còn tạo ra nhiều chất khác Bằng phân tích sắc kí người ta phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, ester, aldehyde và alcol cao phân tử

* Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu, luôn luôn có sự tạo thành các acid hữu cơ: acetic, lactic, citric, pyrovic và succinic nhưng nhiều nhất là acetic và lactic

Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic:

CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH

Acid lactic được tạo thành bởi pyruvat dehydronase theo phản ứng:

CH3CO – COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc

CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4

Glycerine và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu

Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu ethanol, người ta khống chế pH của dịch lên men trong giới hạn 4,5 ÷ 5,2 Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 ÷ 0,45% dịch sau lên men

Glycerine chỉ được tạo thành trong giai đọan cảm ứng khi mà lượng acetaldehyde tạo thành còn ít, hydro từ NADH2 được chuyển đến glyceraldehyde-3-phosphat để tạo thành glycerin-3-phosphat Sau dó glycerin-3-phosphat bị mất gốc phosphat và tạo thành glycerin

Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng glycerin tạo thành tăng tới 23,4% [5] Trong điều kiện này thì acetaldehyde không bị khử thành ethanol như trước Khi dó, chất nhận hydro từ NADH2 là dihydroxyacetonphosphat và kết quả cuối cùng là tạo thành glycerin theo phản ứng:

* Sự tạo thành alcol cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai Các rượu này tuy ít nhưng nếu có lẫn vào sản phẩm sẽ gây những ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm Đó là các rượu propylic, izobutylic,… Hàm lượng của chúng chỉ chiếm khoảng 0,4 ÷ 0,5%

so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi hôi khó chịu

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sự tạo thành alcol cao phân tử chỉ phụ thuộc vào cấu trúc và hàm lượng acid amin có trong dịch lên men Theo giáo sư Vexelop, việc tạo thành alcol cao phân tử xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn sinh trưởng của nấm men Trong giới hạn pH từ 3,0 ÷ 5,0, alcol cao phân tử tích tụ trong dịch lên men sẽ nhiều hơn, nhưng nếu tiếp tục tăng pH thì hàm lượng alcol cao phân tử sẽ giảm Sục khí vào dịch lên men sẽ làm tăng sự tạo thành alcol cao phân tử, bổ sung acid amin vào dịch lên men cũng làm tăng hàm lượng alcol cao phân tử [7]

R1CHO + R2CHO R1COO-CH2R2

Hàm lượng ester càng nhiều thì rượu càng thơm ngon Trong quá trình lên men hàm lượng ester được tạo ra còn phụ thuộc vào giống men cũng như khả năng sinh trưởng, tạo khối nấm men

* Sự tạo thành acetoin, diacetyl và 2,3 butadiol

Ba hợp chất này được tạo thành trong công đoạn lên men chính bởi hoạt động sống của tế bào nấm men Trong ba chất này độc hại và nguy hiểm nhất là diacetyl, đây là chất lỏng không màu đến màu vàng nhạt, có mùi hôi cực mạnh, vị đắng gắt rất khó chịu, tác động mạnh đến hệ thần kinh con người Nếu xem acid pyruvic là điểm xuất phát thì cơ chế tạo thành ba chất này như sau:

CH3-CO-COOH CH3-CHO + CO2

Acid pyruvic acetaldehyde

CH3-CHO + CH3-CHO CH3-CO-CHOH-CH3

Trong giai đoạn lên men phụ hàm lượng aldehyde giảm đi rất nhiều

Cụ thể như sau:

2H+ + CH3CHO CH3CH2OH

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu ethanol

1.3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Hàm lượng đường có ảnh hưởng rất lớn đến năng lực lên men Hàm lượng đường thích hợp nhất là 13 ÷ 15% tương đương với nồng độ chất khô từ 16 ÷ 18% Nếu hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Nếu hàm lượng đường thấp sẽ không đủ cơ chất cho quá trình lên men diễn ra Theo Lê Xuân Phương (2001), sự lên men bị đình chỉ ở hàm lượng đường 30 ÷ 35% [14], [28], [47]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian tiến hành lên men chính là yếu tố rất quan trọng trong quá trình lên men rượu vang Với một nồng độ đường nhất định trong dịch lên men thì khoảng thời gian thích hợp cho lên men chính là yếu tố rất cần thiết trong quá trình công nghệ Nó

quyết định khả năng lên men kiệt đường hay không của nấm men Hoặc nói cách khác

nó quyết định hiệu suất lên men

Tuy nhiên thời gian lên men chính thích hợp không chỉ phụ thuộc vào nồng độ dịch ban đầu mà còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ lên men

Chính vì vậy mà tuỳ theo khu vực, theo mùa vụ có khí hậu và nhiệt độ khác nhau

mà người ta đã có những quy trình công nghệ thích hợp Ở nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trong năm thay đổi theo 2 mùa rõ rệt Do đó với mùa đông hay mùa hè cần xác định rõ khoảng thời gian thích hợp cho lên men rượu vang

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ lên men có ảnh hưởng lớn đến tốc độ lên men, độ cồn đạt được và sự tạo thành các sản phẩm phụ Do đó, nó ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm Nhiệt độ tối thích thay đổi tuỳ theo mỗi loại, chủng men và còn tuỳ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của nấm men Nhiệt độ càng cao lên men càng sớm bắt đầu, tốc độ nhanh và kết thúc sớm, nhưng hàm lượng đường còn lại với một lượng khá lớn Điều này làm ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm do quá trình hình thành acid

lactic từ hàm lượng đường sót bởi vi khuẩn lactic [13] Ngoài ra nhiệt độ còn ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp và các sản phẩm phụ Nhiệt

độ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm phụ ngày càng nhiều, điều này không

có lợi cho sản phẩm chính [11] Theo kết quả nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang cho thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho lên men là 15 ÷ 300C và nhiệt độ càng thấp càng có tác dụng giữ hương cho sản phẩm [28], [47]

Đối với nấm men rượu vang, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của nó trong dịch quả là 20 ÷ 300C Ở nhiệt độ 40C, nấm men vẫn có thể sinh trưởng được nhưng rất chậm Nếu nhiệt độ tăng lên đến 30 ÷ 350C, nấm men khó hoạt động Trên 380C hầu hết nấm men sinh trưởng rất yếu và có thể bị chết nếu nhiệt độ vượt quá 400C [14] Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm men mà còn ảnh hưởng đến độ cồn đạt được và sự tạo thành sản phẩm phụ Do đó nó góp phần quan trọng quyết định chất lượng của rượu vang

1.3.2.4 Ảnh hưởng của oxy

Lên men rượu là một quá trình yếm khí nhưng ở giai đoạn đầu tế bào nấm men cần oxy để sinh trưởng và phát triển số lượng tế bào Nếu lượng oxy cung cấp không

đủ, số tế bào bị hạn chế sẽ ảnh hưởng đến khả năng lên men và cho độ cồn thấp Ở giai đoạn sau, nấm men có thể lên men trong điều kiện thiếu oxy là vì trong tế bào nấm men còn có những chất chứa peroxyt có thể nhường lại oxy cho tế bào nấm men Nếu tăng oxy ở giai đoạn sau, hiệu suất lên men giảm đồng thời trong rượu vang sẽ tạo ra nhiều aldehyt, rượu bậc cao, acid bay hơi, làm giảm chất lượng của sản phẩm [14], [28], [47]

1.3.2.5 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường có ảnh hưởng đối với sinh trưởng của nấm men Các ion H+ và

OH- là 2 ion hoạt động lớn nhất trong các ion Những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ các ion này cũng có thể có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh trưởng của nấm men Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và việc duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của nấm men rất quan trọng pH môi trường không những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến quá trình trao đổi chất Trong lên men rượu vang, pH có ảnh hưởng đến khả năng sống và tăng trưởng của nấm men [30], [32] Với quá trình kiểm soát pH ban đầu của dịch lên men là 4,5 thì sau quá trình lên men pH của rượu vang là 3,5 ÷ 3,8 Giá trị pH này có thể cải thiện được độ

ổn định của rượu, ức chế sự phát triển của vi khuẩn và tạo điều kiện tốt cho quá trình lên men đường Tuy nhiên, nếu điều chỉnh dịch lên men ban đầu cao hơn 4,5 thì pH của rượu vang sau lên men khá cao (4,2 ÷ 4,5), ở pH này sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển nhanh chóng và dẫn đến quá trình lên men không mong muốn, rượu vang có chất lượng kém [38] Nhìn chung nấm men ưa pH acid (pH = 4 ÷ 6)

1.3.2.6 Ảnh hưởng của nồng độ cồn và khí CO 2

Cồn là sản phẩm chính của quá trình lên men Nhưng khi lượng cồn được tích tụ tăng dần trong quá trình lên men sẽ ức chế hoạt động của nấm men nên cũng sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men của rượu vang Khả năng chịu đựng và hoạt động được trong môi trường chứa cồn của mỗi loài nấm men là khác nhau Đa số nấm men chỉ lên men được tới nồng độ cồn 13 ÷ 14%, chỉ có một số ít lên men ở nồng độ cồn 17 ÷ 20% Do đó, muốn lên men rượu vang đạt tới độ cồn cao, cần lựa chọn được các chủng nấm men chịu được độ cồn cao

Khí CO2được hình thành trong quá trình lên men làm ức chế sự lên men rượu, do vậy cần phải tạo điều kiện để khí CO2 được thoát ra ngoài Đồng thời, trong quá trình

thoát khí CO2 sẽ làm cho môi trường luôn bị khuấy động, kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm men do đó làm tăng nhanh sự lên men Qua đó ta thấy chính sản phẩm của sự trao đổi chất khi đạt tới một nồng độ nào đó sẽ có tác dụng ức chế đối với bản thân vi sinh vật đó [14], [28], [47]

1.3.2.7 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Ngoài các yếu tố kể trên, nấm men còn chịu ảnh hưởng của một vài yếu tố khác

có mặt trong quá trình lên men

Chất khoáng cũng rất cần thiết cho nấm men nhất là trong giai đoạn sinh trưởng tăng hàm lượng sinh khối Thường những nước quả tốt có chứa đầy đủ các chất khoáng để lên men Tuy nhiên, khi sử dụng nguyên liệu từ các loại quả có chất lượng không cao, người ta có thể bổ sung các chất khoáng từ ngoài vào như: KH2PO4, MgSO4, NaCl, nhưng chỉ với hàm lượng nhỏ đủ cho nhu cầu hoạt động sống của nấm men

Ngoài ra, nấm men còn chịu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng như các vitamin Nấm men vừa sử dụng vừa tổng hợp được vitamin nên nếu sử dụng các loại nước quả tốt sẽ cho sản phẩm đạt chất lượng cao hơn

Sự có mặt của các chất ức chế cũng gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hoạt động của nấm men Các sản phẩm phụ trung gian xuất hiện trong quá trình lên men nếu được tích tụ dần có thể ức chế hoạt động của nấm men Sự khuyếch tán của CO2vào môi trường gây kìm hãm sự trao đổi chất Thêm vào đó, nếu có mặt các chất sát trùng như: SO2, acid sorbic,… cũng kìm hãm hoạt động của nấm men [28], [47]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH VỰC SẢN XUẤT RƯỢU VANG TRÁI CÂY

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Theo Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu [60], nhằm tận dụng phụ phẩm trong công nghiệp chế biến dừa như nước dừa già, bã cơm dừa, để làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, Viện đã nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất probiotic từ nước dừa già, và chất tiền sinh (probiotic) Các sản phẩm này có hiệu quả tốt đối với gia súc và gia cầm, cạnh tranh được với sản phẩm nhập nội

Trong luận văn “Nghiên cứu sản xuất rượu vang từ mít” của tác giả Đỗ Vĩnh

Long (năm 2004) đã xác định được điều kiện lên men tối ưu như sau: thời gian lên men

chính 120 giờ, nồng độ chất khô 180Bx, pH = 4,5, tỷ lệ giống nấm men 10% Nguồn nguyên liệu được sấy 900C trong 8 giờ, dịch mít được trích ly với tỷ lệ 1:10 [10]

Tác giả Huỳnh Ngọc Châu (2004) đã nghiên cứu sử dụng nguyên liệu lên men là nguyên liệu chuối hột cắt lát, sấy 1600C, thời gian 60 phút Thông số tối ưu cho quá trình lên men: hàm lượng chất khô hòa tan 220Bx, tỷ lệ nấm men sử dụng 5%, pH 4,5,

bổ sung thêm (NH4)2SO4 100mg/l và dùng Na2SO3 50mg/l để khử trùng dịch lên men

Độ cồn đạt theo tác giả là 11,8 [9]

Lê Văn Nhất Hoài (2004) với đề tài “Nghiên cứu sản xuất rượu vang từ dâu tằm”

đã xác định được nguồn nguyên liệu cho kết quả lên men tốt đó là quả dâu tằm tươi Với thông số tối ưu của quá trình lên men để sản xuất rượu vang từ dâu tằm là pH=3,75, nồng độ chất khô 210Bx và tỷ lệ giống 6,78%, thời gian lên men chính là 7 ngày, kết quả thu được rượu có độ cồn là 10 độ [8]

Luận văn “Nghiên cứu sản xuất rượu vang từ bưởi” của tác giả Phạm Trần Tố

Như (2008) đã xác định được thời gian lên men chính là 8 ngày, nồng độ cồn đạt được

là 11 độ, mật độ tế bào nấm men đạt cao nhất vào ngày thứ 5, nồng độ chất khô sau lên men là 50Bx [12]

Tác giả Nguyễn Minh Thủy và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ảnh

hưởng của mật số nấm men, chất khô hòa tan và pH của dịch lên men đến chất lượng rượu vang thốt nốt” Nghiên cứu được thực hiện trên nấm men Saccharomyces đã

được phân lập từ nước thốt nốt và nấm men thương mại trong quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt Sau 12 ngày lên men, kết quả cho thấy dòng nấm men thuần chủng

Saccharomyces lên men tốt hơn so với nấm men thương mại, hàm lượng ethanol cao

(13,67% v/v) và hàm lượng đường sót thấp (2,57%) Với dịch lên men có số lượng tế bào nấm men 103CFU/ml, hàm lượng chất khô hoà tan 240Bx và pH 4,0 Hàm lượng ethanol thấp hơn (12,33%) và hàm lượng đường sót cao hơn (3,42%) thể hiện với rượu lên men từ nấm men thương mại [17]

Những chai rượu vang dừa đầu tiên của Việt Nam mang nhãn hiệu rượu dừa Bến Tre, cũng đã xuất hiện trên thị trường vào cuối năm 2005 Sản phẩm này được sản xuất tại cơ sở của ông Mai Thanh Bá ở xã An Thạnh, huyện Mỏ Cày, Bến Tre Rượu dừa Bến Tre không gây nhức đầu, giữ được mùi thơm của nước dừa và còn có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe Tuy nhiên, loại sản phẩm này mới chỉ tận dụng nước dừa bỏ lãng phí, chưa mang tính độc đáo và gây ấn tượng mạnh với người sử dụng

Hiện nay ở một số thị trường như Quảng Ninh, Thanh Hóa, Đà Lạt hay một số tỉnh ở Tây Nam Bộ cũng đã có loại rượu trái dừa Nhưng đây không phải là rượu vang được lên men từ nước quả Người ta làm ra chúng bằng cách rót rượu gạo đã lên men

từ ngoài vào trong trái dừa, rồi ủ trong một thời gian ngắn để có được hương vị đặc trưng của cơm dừa Do đó sản phẩm này không tận dụng được những công dụng rất hữu hiệu từ thành phần nước dừa

Với nguyên liệu là nước dừa non 7 ÷ 8 tháng tuổi, tác giả Nguyễn Văn Sĩ (2006)

đã thực hiện luận văn “Nghiên cứu sản xuất sản phẩm rượu vang dừa”, điều kiện lên

men tối ưu như sau: pH=4,0, nồng độ chất khô 190Bx, nhiệt độ lên men 290C, thời gian lên men chính là 8 ngày, lên men phụ là 15 ngày [15]

Như vậy hiện nay, tại Việt Nam chưa có bất kỳ tác giả nào công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất rượu vang trái cây từ nước dừa già 12 tháng tuổi

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, công nghệ sản xuất rượu vang trái cây đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều quốc gia

Sliva M E và cộng sự (2007) đã nghiên cứu lên men quả điều: quá trình lên men rượu và acetic, theo phương pháp lên men chìm có khuấy trộn, thời gian lên men là 48 giờ lượng alcohol được sinh ra là 102,9g/l và nồng độ đường 7,12g/l Nồng độ methanol chiếm 1,39mg/100ml, thấp hơn mức tiêu chuẩn trong sản phẩm đồ uống có cồn được qui định tại Brazil Quá trình lên men từ quả điều được tối ưu hóa đạt được nồng độ ethanol từ 4,8 đến 6,0% và acid acetic từ 1,0 ÷ 1,3% Năng suất tối đa 0,55g/l.h và sản lượng trên 75% [43]

Attri B L và cộng sự (2009) cũng đã nghiên cứu lên men quả điều [21] Kết quả

cho thấy dịch điều được lên men bằng nấm men S cerevisiae ở nhiệt độ từ 280C đến

300C và pH 4,0 thu được rượu có độ cồn 6% đến 10,6% (v/v)

Năm 2011, nhóm tác giả Idise và Okiemute Emmanuel, đã thu dịch chiết từ sữa dừa và lên men theo các công thức: A (1,5 lít dịch chiết sữa dừa + 6,0 lít nước); B (1,5 lít dịch chiết sữa dừa + 6,0 lít dung dịch đường); C (1,5 lít dịch chiết sữa dừa + 6,0 lít dung dịch đường + nấm men bánh mì); D (7,5 lít dung dịch đường + nấm men bánh mì) Khi lên men trong 120 giờ, giá trị thu được tương ứng là: pH là 4,68 ± 0,191; 4 ± 0,029; 4,08 ± 0,023; 3,65 ± 0,058, nhiệt độ (0C) là 28,75 ± 0,61; 27,75 ± 0,26; 28,25 ±

0,43; 27,5 ± 0,58, trọng lượng riêng là 1,003 ± 0,0006; 1,012 ± 0,00171; 1,001 ± 0,0006; 0,99 ± 0,0023, mật độ quang phổ là 0,6918 ± 0,019; 0,715 ± 0,017; 0,774 ± 0,0023; 0,752 ± 0,005 % Alcohol (v/v) là 1,359 ± 0,002; 1,371 ± 0,006; 1,357 ± 0,007; 1,354 ± 0,008 % các giá trị độ acid có thể định lượng là 0,16 ± 0,001; 0,809 ± 0,044; 0,302 ± 0,002; 0,382 ± 0,015, giá trị Rf là 4,7 ± 0,017; 4,9 ± 0,058; 4,25 ± 0,052; 4,95 ± 0,058 và tổng lượng hiếu khí là 7,308 ± 0,036; 7,183 ± 0,067; 6,72 ± 0,046; 7,175 ± 0,014 Thử nghiệm hương vị cho thấy sự khác biệt rất ít trong rượu vang từ Công A đến C Công thức D không phù hợp sản xuất rượu vang mà có thể được sử dụng để sản xuất rượu nhân tạo vì nó tạo ra rượu vang có màu sắc, hương vị, sủi bọt và cặn phù hợp với rượu nhân tạo [35]

Năm 2013, nhóm tác giả Sunil S Joshi và cộng sự, đã thu 5 lít nước dừa từ 22 trái dừa Nồng độ đường Brix ban đầu xác định là 1%, để được Brix cuối cùng lên men

là 18% phải bổ sung thêm 850gram đường, sau đó khử trùng ở nhiệt độ 800C trong 5 phút, được làm mát và cho vào 0,1g kali bisulphate meta 0,5 g nấm men được kích hoạt trong nước nóng nhiệt độ 400C cho vào lên men Quá trình lên men được thực hiện trong hai giai đoạn: Lên men hiếu khí: bằng cách dùng vải sạch đậy kín lên miệng bình, thời gian lên men chính là 5 ngày ở nhiệt độ 19 đến 220C; Lên men kỵ khí: duy trì ở nhiệt độ 19 đến 220C và thực hiện đến khi nồng độ chất khô hòa tan dịch lên men

có Brix bằng 0 Sau đó được trữ lạnh tại nhiệt độ 4 ÷ 5 0C để loại bỏ các tế bào nấm men chết Sau 15 ngày rượu được lọc bằng cách sử dụng miếng vải Kết quả sau quá trình lên men thu được rượu vang có tỉ lệ rượu 12,2% [51]

Và theo đó, từ các điều kiện giống như lên men từ nước dừa, tác giả cũng đã cho lên men từ dịch chiết sữa dừa nhưng kết quả không thành công vì tại khoảng nhiệt độ

19 ÷ 220C làm giảm hoạt động của enzyme chuyển từ glucose thành ethanol, mà nhiệt

độ thích hợp phải là 28 ÷ 300C [51]