KHẢO sát các điều KIỆN bảo QUẢN và lưu TRỮ OLIGONUCLEOTIDE (PRIMER) sản XUẤT tại CÔNG TY SINH hóa PHÙ SA ỨNG DỤNG TRONG kĩ THUẬT PCR

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN VÀ LƯU TRỮ OLIGONUCLEOTIDE (PRIMER) SẢN XUẤT TẠI CÔNG TY SINH HÓA PHÙ SA, ỨNG DỤNG TRONG KĨ THUẬT PCR Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU THANH Người thực hiện: NGUYỄN DUY PHƯƠNG Lớp Khố THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 : 14060302 : 2014 - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ tận tình tất người Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học Ứng Dụng tạo điều kiện cho thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị nhân viên cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa anh chị ban quản lý phòng thí nghiệm tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến thầy Nguyễn Hữu Thanh chị Huỳnh Thị Hồng Phượng tận tình hướng dẫn, dạy, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình tiến hành làm đề tài hoàn thành báo cáo cách tốt Đồng thời xin cảm ơn bạn khóa (2014 – 2019) ln đồng hành, giúp đỡ chia sẻ khó khăn suốt q trình thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn đến người thân yêu gia đình tơi, người ln quan tâm, theo dõi, động viên giúp đỡ cảm thấy mệt mỏi chán nản Họ nguồn động lực giúp tơi hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực Nguyễn Duy Phương CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hữu Thanh; Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường Đại học Tơn Đức Thắng khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền tơi gây q trình thực (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2019 Tác giả Nguyễn Duy Phương TÓM TẮT Với mục đích kiểm tra chất lượng Oligonucleotide (Primer) kỹ thuật PCR sau thời gian sử dụng đưa khoảng điều kiện bảo quản khác nhằm đảm bảo giữ chất lượng tốt nên đề tài “Khảo sát điều kiện bảo quản lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất cơng ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng kĩ thuật PCR” khảo sát điều kiện với hàm lượng phần trăm GC 32% (GC thấp), GC 50% (GC trung bình), GC 68% (GC cao): Khảo sát điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (Nhiệt độ môi trường, nhiệt độ oC, nhiệt độ -20 oC; Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (pH=5, pH=7, pH=9) so với điều kiện bảo quản thông thường TE 1X (pH=8.5) Ba cặp mồi GCF/R với trình tự: GC32.Fw: AAAATCTGACTTTAGCACTAGATTC GC32.Rw: TCAAACGAAACATTGTTACTGATGA GC50.Fw: GCGAGCTTACTCATCACCAATCTG GC50.Rw: GCTAACAGGACATTGCTACGTGAG GC68.Fw: GGCGAGCTGACCCAGCACCCGATCT GC68.Rv: GCTAGCAGGACGGTGCGCAGTGAGC Cặp mồi GC32F/R có nhiệt độ gắn mồi thích hợp 54,2 0C, cặp mồi GC50F/R có nhiệt độ gắn mồi thích hợp 60,2 0C, cặp mồi GC68F/R có nhiệt độ gắn mồi thích hợp 69 0C Ba cặp mồi với chu kỳ nhiệt Biến tính ban đầu: 95 0C phút Khuếch đại 35 chu kỳ gồm bước: Biến tính 95 0C 30 giây; Gắn mồi nhiệt độ phù hợp với GC32F/R, GC50F/R, GC68F/R 30 giây; Kéo dài 72 0C 45 giây Kéo dài cuối 72 0C phút Ủ bảo quản 25 0C phút Ba cặp mồi GCF/R phát mẫu DNA với kích thước 550 bp dòng hóa vào Plasmid PUC19 (kích thước 2686bp) MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT cs PCR qPCR DNA EDTA TAE TNHH MTV TE GC32.Fw/Rv GC50.Fw/Rv GC68.Fw/Rv Tm Taq kb bp ng/µL Bi.H2O t0 Số thứ tự Cộng Polymerase Chain Reaction Real-time Polymerase Chain Reaction Deoxyribonucleotic Acid Ethylenediaminetetraacetic acid Tris – acetate - EDTA Trách nhiệm hữu hạn thành viên “TE” có nguồn gốc từ thành phần nó: Tris, EDTA phân tử Mg2+ Primer có Hàm Forward/Reverse Melting temperature Thermus aquaticus Kilobase Base pair Nano gam/micro Lit Nước khử ion Nhiệt độ lượng GC 32%, 50%, 68% DANH MỤC HÌNH ẢNH 35 Hình phụ lục 1e, 1f, 1g, 1h .36 Hình phụ lục 1i, 1j, 1k, 2a 37 Hình phụ lục 2b, 2c, 2d, 2e 38 Hình phụ lục 2f, 2g, 2h, 2i 39 Hình phụ lục 2j, 2k, 3a, 3b 40 Hình phụ lục 3c, 3d, 3e, 3f .41 Hình phụ lục 3g, 3h, 3i, 3j 42 Hình phụ lục 3k 43 DANH MỤC BẢNG CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Năm 1953, James Watson Francis Crick mô tả cấu trúc sợi đôi DNA [9] đạt giải Nobel năm 1962 [3] Hai ông mở kỷ nguyên cho nhà Khoa học sau tìm hiểu nghiên cứu kỹ trình tự DNA Người loại sinh vật khác Sự công nhận James Watson Francis Crick chuỗi acid nucleic chiếm phần lớn kiểm soát chức phân tử sinh học dẫn đến cách mạng sinh học phân tử Ngày nay, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử biết đến như: lai tạo gen, PCR, Real-time PCR (qPCR),… sử dụng Oligonucleotide làm đầu dò phân tử, đoạn mồi (Primer) sử dụng PCR, qPCR nhằm khuếch đại đoạn gen mong muốn Nhắc đến PCR khơng thể thiếu Oligonucleotide (Primer), chúng có vai trò lớn kỹ thuật sinh học phân tử chúng thường tổng hợp phương pháp hóa học Việc áp dụng Oligo tổng hợp trình tự tương tự chúng trọng phát triển tiến gần tổng hợp hóa học Oligo [10] Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu tổng hợp hóa học Oligo giới nghiên cứu chế tạo thành cơng máy tổng hợp hóa học Oligo tự động [16], Cơng ty Sinh Hóa Phù Sa nghiên cứu phát triển thành công chất mang rắn HIGH PERFORMANCE Frit nhằm tối ưu hóa thời gian gia tăng chất lượng Oligo Bên cạnh việc ứng dụng oligo kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt kỹ thuật PCR, làm cách để trì chất lượng sử dụng Oligo cách tốt khoảng thời gian định? Với đề tài “Khảo sát điều kiện bảo quản lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng kĩ thuật PCR” thực với mục đích đưa điều kiện bảo quản tối ưu Primer cung cấp cho khách hàng thơng tin sử dụng bảo quản thích hợp để sử dụng chúng với chất lượng tốt nhất, làm tiền đề cho hướng nghiên cứu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát điều kiện bảo quản khác ảnh hưởng đến chất lượng Oligo kiểm tra, so sánh kết phương pháp PCR 1.3 Đối tượng nghiện cứu Các đoạn Primer có hàm lượng GC khác nhau, DNA tổng hợp cơng ty Sinh Hóa Phù Sa 1.4 Nội dung nghiên cứu Các đoạn Oligonucleotide ban đầu khảo sát có hàm lượng GC khác • Khảo sát điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide • Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu vấn đề nghiên cứu 2.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu đề tài liên quan đến bảo quản Oligonucleotide (Primer) Tuy nhiên, có vài công ty phát triển công nghệ tổng hợp Oligo dựa thành tựu khoa học nước ngồi Cơng ty Sinh Hóa Phù Sa họ dừng lại mức so sánh đựa dự đoán cách thức bảo quản thời gian dự trữ, chưa có hướng nghiên cứu chi tiết, họ đưa cách bảo quản Oligonucleotide (Primer) dạng khô dạng ướt dung dịch TE 1X (pH = 8.5) nhiệt độ từ -10 0C đến 0C sử dụng vòng tháng kể từ ngày sản xuất [11] Kế công Công ty Primer Diagnosis Healthcare (PDH) BIO khuyến cáo nên bảo quản -20 0C dạng ướt (trong nước không chứa enzyme phân giải Nucleic, dung dịch TE), lưu trữ 18 tháng, 0C lưu trữ tháng (trừ bảo quản nước không chứa enzyme phân giải Nucleic), nhiệt độ mơi trường lưu trữ tháng [12] 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Trên giới có nghiên cứu liên quan đến phương pháp bảo quản điều kiện lưu trữ Oligo Nhưng trước dựa theo hướng nghiên cứu bảo quản DNA kiểm tra phương pháp real-time PCR, với đề tài “Tác động phương pháp lưu trữ lâu dài đến ổn định DNA chuẩn Acid nucleic” (Barbara Roder, Karin Fruhwirth, Claus Vogl, Martin Wagner, Peter Rossmanith năm 2010) với DNA chuẩn trích ly từ vi khuẩn Listeria monocytogenes lưu trữ khảo sát 100 ngày với nồng độ DNA 10 copies lưu trữ dung dịch glycerol-nước dung dịch 50 % glycerol buffer 1X (20 mM TrisHCl, pH 8.4, 50 mM KCl,), với mức nhiệt độ oC -20 oC Kết nghiên cứu Trong đó: - Hình phụ lục a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k: kết hàm lượng GC 32% sau điện - di theo tuần (10 tuần) Hình phụ lục a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k: kết hàm lượng GC 50% sau điện - di theo tuần (10 tuần) Hình phụ lục a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k: kết hàm lượng GC 68% sau điện di theo tuần (10 tuần) Kết xử lý số liệu từ kết điện di Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh chất lượng Primer theo thời gian (Hàm lượng GC 32%) pH to Phòng oC -20 oC Lặp lại / tuần 10 11 10 11 pH = pH = TE 1X (pH = 8.5) pH = I II III I II III I II III I II III x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 10 x x x x x x x x x x x x 11 x x x x x x x x x x x x Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh chất lượng Primer theo thời gian (Hàm lượng GC 50%) pH to Phòng oC -20 oC Lặp lại / tuần 10 11 10 11 pH = pH = TE 1X (pH = 8.5) pH = I II III I II III I II III I II III x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 2 3 4 x x 4 3 4 4 5 2 3 4 x x 2 3 4 4 5 2 3 4 x x 2 3 4 4 4 2 3 3 3 4 2 3 4 4 5 2 2 3 3 3 4 2 3 4 4 5 2 2 3 3 3 4 2 3 4 4 5 2 2 3 3 4 2 3 4 4 5 2 2 3 3 4 2 3 4 4 5 2 2 3 3 4 2 3 4 4 5 2 x x x 3 3 3 3 x x x 3 3 3 3 x x x 4 4 4 4 x x x 4 4 4 4 x x x 4 4 4 4 x x x 4 4 4 4 10 x x x 4 4 4 5 11 x x x 4 4 4 5 Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh chất lượng Primer theo thời gian (Hàm lượng GC 68%) pH to Phòng oC Lặp lại / tuần 10 11 10 pH = pH = TE 1X (pH = 8.5) pH = I II III I II III I II III I II III x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 2 2 5 x 2 3 4 2 2 5 x 2 3 4 2 2 5 x 2 3 4 2 2 4 2 3 4 4 2 2 4 2 2 3 4 4 2 2 4 3 2 3 4 4 2 2 4 2 3 4 4 2 2 4 4 2 3 4 4 2 2 4 2 3 4 4 11 10 11 -20 oC x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 2 3 4 4 2 3 4 4 x 2 x 3 4 4 4 2 2 3 3 2 2 3 3 2 2 3 3 2 2 3 3 3 2 3 3 3 2 2 3 3 3 Trong đó: Kết so sánh dựa theo điều kiện pH (Theo cột) - 1, 2…n độ sáng band giảm dần x: khơng có band Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh điều kiện lưu trữ Primer (Hàm lượng GC 32%) pH to Phòng Lặp lại / tuần 10 11 pH = pH = TE 1X (pH = 8.5) pH = I II III I II III I II III I II III 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 oC -20 oC Trung bình 10 11 Trung bình 10 11 Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh điều kiện lưu trữ Primer (Hàm lượng GC 50%) pH to Lặp lại / tuần pH = I II pH = III I II TE 1X (pH = 8.5) pH = III I II III I II III Phòng 10 11 Trung bình o C 10 11 Trung bình -20 oC 10 11 Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 3 3 9.3 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11.0 1 2 2 3 3 1 1 2 2 24.0 2 1 1 1 2 3 3 2 13.3 0 0 0 0 0 1 2 2 3 3 2 3 3 2 2 2 3 3 2 2 3 3 24.3 1 1 2 2 16.0 2 3 3 2 2 2 2 2 27.0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22.0 2 2 3 3 2 1 2 2 2 1 2 2 18.0 2 1 2 2 Bảng phụ lục Kết số liệu sau điện di – so sánh điều kiện lưu trữ Primer (Hàm lượng GC 68%) pH pH = pH = TE 1X (pH = 8.5) pH = to Lặp lại / tuần Phòng 10 11 Trung bình o C 10 11 Trung bình o -20 C I II III I II III I II III I II III 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 2 1 1 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 3 2 2 2 3 2 2 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10.7 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 17.0 1 1 1 1 3 2 2 12.0 0 1 1 2 2 2 24.7 2 2 2 3 3 2 3 23.0 1 2 2 2 3 2 3 3 3 2 2 3 27.3 2 2 3 2 3 10 11 Trung bình Trong đó: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 12.7 2 2 2 22.0 Kết so sánh dựa theo tuần (Theo hàng) - 0, 1, 2…n độ sáng band tăng dần (0: khơng có band) 2 2 2 2 2 3 2 28.3 3 2 Bảng phụ lục kết xử lý thống kê TN2.1 Descriptives Kết_quả N Mean 32 11 1.00 50 11 7.64 68 11 8.55 Total 33 5.73 Between Groups Within Groups Total 95% Confidence Interval for Mean Std Std Lower Deviation Error Bound Upper Bound 000 000 1.00 1.00 1.286 388 6.77 8.50 688 207 8.08 9.01 3.511 611 4.48 6.97 ANOVA Sum of Mean Squares df Square F 373.273 186.636 263.205 21.273 30 709 394.545 32 Min Max 1 10 10 10 Sig .000 Bảng phụ lục Kết xử lý thống kê TN2.2 Descriptives Kết_quả to N o C 11 -20 oC 11 37 oC 11 Total 33 Mea Std n Deviation 7.18 1.471 7.55 1.214 6.64 1.804 7.12 1.516 95% Confidence Interval for Mean Std Lower Upper Error Bound Bound 444 6.19 8.17 366 6.73 8.36 544 5.42 7.85 264 6.58 7.66 ANOVA Min Max 6 5 Kết_quả Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 4.606 68.909 73.515 df 30 32 Mean Square 2.303 2.297 F 1.003 Sig .379 10 10 10 10 Bảng phụ lục Kết xử lý thống kê TN2.3 Descriptives Kết_quả 5.0 7.0 8.5 9.0 Total N 11 11 11 11 44 Mea Std Std n Deviation Error 1.00 000 000 7.45 1.293 390 7.55 1.214 366 8.00 1.183 357 6.00 3.103 468 95% Confidence Interval for Mean Min Lower Upper Bound Bound 1.00 1.00 6.59 8.32 6.73 8.36 7.21 8.79 5.06 6.94 Max ANOVA Kết_quả Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 368.545 45.455 414.000 df 40 43 Mean Square F 122.848 108.107 1.136 Sig .000 10 10 10 10 ... chất lượng sử dụng Oligo cách tốt khoảng thời gian định? Với đề tài Khảo sát điều kiện bảo quản lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng kĩ thuật PCR thực với... Oligonucleotide (Primer) sản xuất công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng kĩ thuật PCR khảo sát điều kiện với hàm lượng phần trăm GC 32% (GC thấp), GC 50% (GC trung bình), GC 68% (GC cao): Khảo sát điều kiện. .. chất lượng Oligonucleotide (Primer) kỹ thuật PCR sau thời gian sử dụng đưa khoảng điều kiện bảo quản khác nhằm đảm bảo giữ chất lượng tốt nên đề tài Khảo sát điều kiện bảo quản lưu trữ Oligonucleotide