KHẢO sát THÀNH PHẦN HOÁ học PHÂN đoạn IV CAO ETHYL ACETATE cây LAN một lá (NERVILIA ARAGOANA)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC PHÂN ĐOẠN IV - CAO ETHYL ACETATE CÂY LAN MỘT LÁ (NERVILIA ARAGOANA) 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EtOH: Ethanol DM: Dung môi nH: Hexane EA: Ethyl acetate C: Chloroform Me: Methanol Aq: Nước IC 50: Nồng độ ức chế 50% gốc tự SKC: Sắc kí cột SKLM: Sắc kí lớp mỏng UV: Tia cực tím H2SO4: Sulfuric acid DMSO: Dimethyl Sulfoxide Me: Methanol NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H1) (Hydro (1) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon (C13) (Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) DEPT: Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) δ: Độ dịch chuyển hóa học HSQC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HMBC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) %: phần trăm 2 g: gam mg: miligam mm: milimeter mL: mililiter PTLC: Sắc ký lớp mỏng điều chế MS: Khối phổ (Mass Spectrometer) ppm: Một phần triệu (Part per Million) Hz: Hertz MHz: Mega Hertz µm: Micrometer d: Mũi đôi (Doublet) dd: Mũi đôi đôi (Doublet of Doublet) m: Mũi đa (Multiplet) s: Mũi đơn (Singlet) 3 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] C.-L L H.-S W a X.-S Y Guang-Xiong Zhoua, “An acetyl flavonol from Nervilia fordii (Hance) Schltr,” 2009 [2] E D Kumar, “Antidiabetic and regenerative effects of alcoholic corm extract of Nervilia aragoana gaud in streptozotocin-nicotinamide induced NIDDM rats,” 2013 [3] G J E.K Dilip Kumar, “Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Nervilia plicata in streptozotocin-nicotinamide induced type diabetic rats,” 2010 [4] Y P Y.-J Z Y.-F W a C.-R Y Li-Wen Tian, “7-O-Methylkaempferol and -quercetin Glycosides from the Whole Plant of NerWilia fordii,” 2009 [5] Z.-X Z C.-Z L C.-C Z L G Li Zhang, “Three new flavonol glycosides from Nervilia fordii,” 2011 [6] J.-M C W.-C Y X.-S Y & G.-X Z Liu-Bin Wei, “Three new cycloartane glycosides from Nervilia fordii,” 2012 [7] L.-B W C.-L L & G.-X Z Jin-Man Chen, “A flavonoid 8-C-glycoside and a triterpenoid cinnamate from Nervilia fordii,” 2013 [8] Y J J.-Z X G.-K H S.-L Q J.-H M & X.-S Y Li Qiu, “Five new flavonoid glycosides from Nervilia fordii,” 2014 [9] Q L J Y X J.-z Z L.-h HUANG Gui-kun, “A new labdane diterpenoid glycoside from Nervilia fordii,” 2014 [10] Đ H Bích, “Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam,” p Tập NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 2004 [11] P S a O R K Himakar Reddy, “A comparative in vitro study on antifungal and antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla,” 2010 [12] X Y.-l L X.-p L L X Y.-j L J.-j C X.-p HUANG Ming-qing, “Protection of Total Flavonoid Fraction from Nervilia fordii on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung 4 Injury in Rats,” 2012 [13] K P P NGUYỄN, “PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP HỢP CHẤT HỮU CƠ,” 2007 [14] A T P D G T R A ELIZABETH THOMAS, “GC-MS ANALYSIS OF PHYTOCHEMICAL COMPOUNDS PRESENT IN THE RHIZOMES OF Nervilia aragoana GAUD,” 2013 [15] A M C.-I C T Y Stephan W Gale, “Inter-specific relationships and hierarchical spatial genetic structuring in Nervilia nipponica, an endangered orchid in Japan,” 2009 [16] A T P D G T ELIZABETH THOMAS, “NERVILIA ARAGOANA GAUD, A TERRESTRIAL ORCHID,” 2013 [17] M M Hossain, “Therapeutic orchids: traditional uses and recent advances — An overview,” 2010 [18] H.-E Y J.-M C Q.-Q W H W W.-C Y a G.-X Z Liu-Bin Wei, “Five New Cycloartane-Type Triterpenoid Saponins from Nervilia fordii,” 2013 [19] V V Chi, “Tra Cứu Tên Cây Cỏ Việt Nam,” p NXB Giáo Dục, 2007 5 ĐẶT VẤN ĐỀ MỞ ĐẦU Đời sống xã hội ngày phát triển, mức sống cải thiện rõ rệt qua từng năm Tuy nhiên, không thể phủ nhận thực tế đáng buồn đó người dần tách rời khỏi thiên nhiên Nhiều bệnh khơng ngừng xuất mà nền khoa học đại khơng thể tìm nguyên nhân Từ xa xưa, người trên khắp giới biết sử dụng cây thuốc để chữa bệnh Các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên có cơng dụng tốt, tác dụng phụ Chính mà ngành nghiên cứu khai thác hợp chất thiên nhiên ứng dụng vào thuốc chữa bệnh trở thành xu hướng phát triển chung ngành y học nhân loại Rất nhiều hợp chất có tác dụng sinh học tìm ứng dụng rộng rãi thực phẩm, dược phẩm Giá trị nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà có thể dùng làm các nguyên mẫu các cấu trúc dẫn đường cho phát triển phát nhiều dược phẩm có chứa thuốc chữa cho tất các bệnh Những giá trị tiềm tàng cây thuốc chưa khám phá Bằng cách xem xét giá trị các cây thuốc phải sử dụng nhiều thời gian nguồn lực để phát triển các loại thuốc từ cây thuốc Nhận thức về các tác dụng phụ phản ứng thuốc không mong muốn yếu tố chi phí, y học cổ truyền nâng cao Y học cổ truyền bao gồm kiến thức, kỹ thực hành dựa trên lý thuyết, niềm tin kinh nghiệm dân gian sử dụng để trì sức khỏe, ngăn ngừa, chuẩn đoán, cải thiện điều trị bệnh lý về thể chất tinh thần MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn IV - cao Ethyl acetate Lan (Nervilia aragoana)” nhằm khảo sát thành phần hóa học tìm hoạt tính sinh học tác dụng dược lý tiêu biểu cây Lan lá, giúp có hiểu biết về khía cạnh hóa học các hợp chất thiên nhiên, góp phần cho nghiên cứu sâu hơn về khả sử dụng cây cỏ làm thuốc, từ đó hạn chế việc sử dụng kháng sinh chữa bệnh NỘI DUNG VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu: Thực quy trình chiết tách các hợp chất hóa học có phân đoạn IV cao Ethyl acetate cây Lan lá Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập Xác định hoạt chất sinh học có cây Lan lá Đối tượng nghiên cứu: Cây Lan lá Nervilia aragoana Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN Ý nghĩa khoa học: Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần hóa học, cấu tạo số hợp chất hoạt tính sinh học có cây Lan lá Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích cách khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho việc nghiên cứu, ứng dụng vào ngành công nghiệp dược phẩm phát triển thuốc CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN MỘT LÁ 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố loài Cây Nervilia đầu tiên nhà khoa học Roptrostemom phát vào năm 1828 Sở dĩ cây có tên Nervilia chữ Nerve nói về đường gân trên lá Dưới đây cây thường thấy ở vùng Đông Nam Á 1.1.1.1 Phân loại khoa học Lớp: Monocotyledoneae Bộ: Bộ măng tây (Asparagales) Họ: Họ lan (Orchidaceae) Giới: Gastrodieae Chi: Nervilia Loài: Nervilia aragoana Tên khoa học: Nervilia aragoana Gaudich Tên đồng nghĩa: Nervilia carinata Tên nước ngoài: Tiếng Anh: Tall shield orchid; Malayalam: Orilathamara, Kalthamara, Nilathamara ; Trung Quốc (Flora of China): yu-lan = Du-lan Tên Việt Nam: Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh, dân gian có tên đơn giản hơn Lan lá Việt Nam có loài: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata Nervilia prainiana 1.1.1.2 Phân bố loài Năm 1829, nhà thực vật người Pháp Charles Gaudichaud Beaupre (1789-1854) đặt tên cây Nervilia aragoana Nervilia aragoana tìm thấy nhiều ở các vùng rừng Darrjeeling Hymalaya với độ cao ở vào khoảng 400 – 1000 m, ở vùng núi Mcllwraith ở Queensland nước Úc Đặc biệt các khu vực rừng nhiệt đới đồi núi Ở khu vực Đông Nam Á, các quốc gia Lào, Thái lan, Malaysia, Myanma, Indonesia,…đều tìm loại cây Loài Nervilia loài cây mọc sát mặt đất, có vùng phân bố khá rộng, gần các châu lục đều có thể tìm loại cây Ở Việt Nam ta, các tỉnh có phân bố loài cây chủ yếu các vùng núi các tỉnh Tây Bắc vùng Tây Nguyên Cao Bằng, Lào Cai hay Lâm Đông, Kon Tum,… 1.1.2 Mô tả đặc điểm thực vật tổng quát Lan lá loài cây địa lan nhỏ, cây địa sinh, sồng nhiều năm, cao 10 – 20 cm bao gồm phát hoa, mọc thành từng cụm Chỉ có lá nhất, thân ngắn Rễ tròn, to, dạng củ, đường kính 1.5 – 3.5 cm Lá mọc thẳng, cuống lá dài khoảng 15 – 20 cm Phiến lá to mỏng, hình tam giác, rộng khoảng – 8cm, lõm hình chảo, màu lục nhạt Gân lá nổi, toả đều từ cuống, cuống lá dài 10 – 20 cm, mép lượn sóng Hoa thường xuất trước mọc lá Hoa màu trắng, đốm tím hồng, phiến hoa hình dầm, dài cm, mơi tam giác, thuỳ nhọn tròn, có lơng dày, cột cao – mm Phát hoa ở cuối cành, dài 200 – 350 mm, màu xanh lục Cuống hoa dài – 10 mm Hoa – cái, lộn ngược, vươn ra, hình sao, kích thứơc 35 – 40 mm x 30 – 35 mm, màu xanh lục nhạt, cánh môi hơi vàng hay xanh lá cây Đài hoa cánh hoa có đầu nhọn, dẹp, dàn rộng Phần lưng đài hoa thẳng đứng, kích thuước 17 – 24 mm x – 2.5 mm Cánh hoa xoè rộng 14 – 22 mm x mm Cánh môi 17 – 22 mm x – 12 mm với các sợi lơng tím mảnh gân xanh, có thuỳ Thuỳ bên uốn cong vào, thuỳ có mép không đều gợn sóng có chóp rậm lông Quả nang, hình thon dài có cuống, rủ xuống, tự nứt già Hình 1.1 Nervilia aragoana Hình 1.2 Nervilia fordii Hình 1.3 Nervilia plicata Tương tự Tannin, Flavonoid hợp chất phổ biến có trên thực vật Flavonoid biết với tác dụng hạ đường huyết, chống oxy hoá, kháng khuẩn, chống thoái hoá thần kinh phục hồi tế bào tuyến tuỵ Phương pháp nghiên cứu các chất có hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường type phương pháp ưu tiên sử dụng bởi cơ chế đơn giản, an toàn, xảy phân tiêu hoá không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay ảnh hưởng đến hoạt động insulin các phương pháp khác Trong nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase luận này, sử dụng Acarbose làm chất đối chứng dương quy trình thử CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 CƠ QUAN THỰC HIỆN Phòng Cơng Nghệ các chất có Hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hoá học, thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Địa chỉ: Số 1, Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh 2.2 NỘI DUNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nội dung Mẫu cây định danh khoa học điều chế cao ethanol toàn phần các cao phân đoạn cao Petroleum ether, cao Ethyl acetate, cao nước Tách chiết, phân lập xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập từ các loại cao Thử hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập 2.2.2 Nguyên liệu Nguyên liệu cây Lan lá Nervilia aragoana, thu hái tại tỉnh Kon Tum, Việt Nam 2.3 THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 2.3.1 Thiết bị - dụng cụ 2.3.1.1 Thiết bị Cân phân tích Tủ sấy Máy sấy Bếp điện Máy đánh siêu âm Máy cô quay Đèn UV 2.3.1.2 Dụng cụ Cột sắc ký đường kính – cm Giá đỡ cột Kẹp mỏng Ly giải ly Lọ bi Bình chứa dung mơi Bình quay Phễu Ống đong Ống hút chất Bóp cao su 10 mL, 100 mL 2.3.2 Hoá chất Silica gel: Silica gel 60 (0.063 – 0.200 mm), Merck dùng cho sắc ký cột Bản mỏng loại 25 Aluminium sheets 20 x 20 cm, Kiesel gel 60F254 Dung mơi: Methanol, chlorofom, ethyl acetate, hexane,… Thuốc thử hình cấu tử trên sắc ký lớp mỏng: H2SO4 10% Hình 2.6 Silica gel dùng SKC Hình 2.7 Bản mỏng TLC 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Phương pháp điều chế loại cao 2.4.1.1 Nguyên tắc Sử dụng phương pháp ngâm dầm chiết lỏng – lỏng Ngâm dầm: Nguyên liệu bột cây ngâm dầm với cồn 96° sau đó chiết lọc dịch mang quay thu hồi dung mơi, phần lại cao Ethanol thô Dung môi thu hồi tái sử dụng để ngâm dầm tiếp tục Trích ly lỏng – lỏng ( Liquid – liquid extraction ): Phương pháp gọi chiết dung môi Cao thô ban đầu hay dung dịch ban đầu đều chứa nhiều hợp chất hữu cơ mà độ phân cực khác đó khó để tiến hành khảo sát Trích ly lỏng – lỏng dùng để phân chia cao ban đầu thành phân đoạn có tính phân cực riêng biệt để dàng cho các phân đoạn khảo sát Từ cao thô ban đầu đem hồ tan với dung mơi chọn, lắc đều thu phần chất hồ tan dung mơi đó phễu chiết [12] Phương pháp chủ yếu dựa trên nguyên tắc pha lỏng phân biệt không hồ tan vào dung mơi khơng phân cực hồ tan tốt các hợp chất khơng phân cực Dung mơi có độ phân cực trung bình hồ tan hợp chất có độ phân cực trung bình dung mơi phân cực hồ tan hợp chất phân cực mạnh Quá trình chiết lỏng – lỏng tiến hành từ dung môi phân cực đến dung mơi phân cực mạnh Điển ether dầu hoả hay hexane đến ethyl ether, chloroforrm, ethyl acetate,… Trong quá trình chiết với từng loại dung mơi, đều tiến hành chiết nhiều lần, lần với lượng nhỏ dung mơi để tránh hoa phí dung mơi hồ tan triệt để các hợp chất [12] 2.4.1.2 Quy trình Cây Lan lá sau thu hái tiến hành ngâm rửa, phơi sấy khô, sau đó nghiền nhỏ thu kg bột cây mang ngâm dầm với cồn 96° bình chứa thuỷ tinh có nắp đậy Thời gian ngâm khoảng ngày, sau đó rót lượng chất lỏng lọc qua giấy lọc mang cô quay thu hồi dung môi thu lượng cao đầu tiên ( cao Ethanol thô ) Tiến hành trích ly lỏng – lỏng với trình tự các dung môi petroleum ether, ethyl acetate Cao Ethanol thơ hòa tan với dung mơi ethanol nước Hỗn hợp cho vào phễu trích ly, sau đó cho PE vào lắc PE không tan với nước, ethanol tan nước, nên phân tách thành hai lớp PE nước Thu lớp dịch PE, mang cô quay thành cao PE dịch nước tiếp tục lắc với PE tới chất khơng hòa tan thay PE thành EA lặp lại tiến trình Cao thu cao PE, cao Ethyl acetate cao nước Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế loại cao từ bột BỘT CÂY kg Ngâm dầm với cồn 96° Lọc cô quay đuổi dung môi Chiết lỏng lỏng lần CAO ETHANOL 280 g lượt với PE, EA CAO PE CAO EA 90 g 25 g CaO NƯỚC 45 g 2.4.2 Phương pháp phân lập hợp chất Tiến hành khảo sát cao Ethyl acetate cây Lan lá Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp sắc ký lớp mỏng để phân lập các hợp chất tinh khiết có cao phân đoạn 2.4.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập sắc ký lớp mỏng Nguyên tắc cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó có hỗn hợp các chất Pha tĩnh chất hấp phụ trải thành lớp mỏng đồng cố định trên bề mặt kim loại Pha động hệ dung môi đơn hay đa dung môi Sắc ký lớp mỏng (kí hiệu TLC theo tên tiếng anh: Thin Layer Chromatography) Sắc ký lớp mỏng thực trên mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F 254 (Merck 1.05715), RP18 F254s (Merck) Phát chất đèn UV ở hai bước sóng 254 mm 366 mm nhúng thuốc thử H2SO4 FeCl3 [12] 2.4.2.2 Phương pháp sắc ký cột Sắc ký cột (SKC) phương pháp đơn giản sử dụng phổ biến có khả phân lập các chất khỏi hợp chất cách nhanh chóng, thường tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Trong cột, pha tĩnh thường hạt có kích thước lớn hơn 60 µm, gọi chất hấp thu Chất hấp thu phổ biết sử dụng silica gel Nếu sử dụng hạt silica gel có đường kính hạt nhỏ hơn dung môi khỏi cột chậm Đảm bảo vận tốc cột dung môi đạt – 50 giọt/phút – cm/phút Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường pha đảo Silica gel pha thường có đường kính hạt vào khoảng 0.040 – 0.063 mm (240 – 430 mesh) Silica gel pha đảo ODS hay YMC (30 – 50 µm, Fujisilisa Chemical Ltd.) [12] 2.4.2.3 Tiến hành Sử dụng sắc ký cột để phân lập các chất trên phân đoạn cao Ethyl acetate Tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel nhiều lần trên phân đoạn thu để cô lập hợp chất có cao Tồn quá trình sắc ký cột từ giai đoạn khảo sát dung môi đến phát chất tinh khiết quan sát bởi sắc ký lớp mỏng với thuốc thử H2SO4 10% đun nóng Từ phân đoạn E4, quá trình sắc ký cột tiến hành với các hệ dung môi lần khác Sử dụng thuốc thử H2SO4 10% để cho hình các vết trên mỏng sắc ký Các phân đoạn cho vết giống gom lại thành phân đoạn Thu phân đoạn đầu tiên từ E4.1 – E4.5 Từ phân đoạn E4.4, tiếp tục tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu 20 C: Me Chấm mỏng dùng thuốc thử hình H 2SO4 10% để khảo sát, vết giống tiếp tục gom lại, thu phân đoạn từ E4.4.1 – E4.4.4 Chọn tiếp tục phân đoạn E4.4.2 để sắc ký cột silica gel pha thường, lặp lại nhiều lần với các hệ dung môi giải li C : Me khác thu hợp chất NA – 19 Sơ đồ 2.2 Quy trình khảo sát phân đoạn E4 Phân đoạn Tên mã hoá E4.1 SKLM Cao EA 90 g Nhiều vết E4.2 Nhiều vết Không khảo sát E4.3 Nhiều vết Không khảo sát E1 E4.1 Phân đoạn E4.2 Tên mã hoá E4.3 SKLM E4.4.1 E4.4.1 E4.4.2 E4.4.3 Nhiều vết E4.4.4 E4.4.2 Nhiều vết E4.4.2.3 E4.4.2 Không khảo sát E4.4 Rõ vết Khảo sát E2 E3 E4 E5 E4.5 Nhiều vết Không khảo sát Bảng 2.1 Kết SKC phân đoạn E4 Ghi E4.4 Nhiều vết E4.4.2 Rõ vết Ghi E4.5 Không khảo sát E4.4.3 Khảo sát E4.4.4 Không khảo sát Không khảo sát E4.4.2 E4.4.2 Bảng 2.2 Kết SKC phân đoạn E4.4 Phân đoạn Tên mã hố SKLM Ghi E4.4.2.1 Nhiều vết Khơng khảo sát E4.4.2.2 Nhiều vết Không khảo sát E4.4.2.3 Rõ vết Khảo sát E4.4.2.4 Nhiều vết Không khảo sát E4.4.2.5 Nhiều vết Không khảo sát Bảng 2.3 Kết SKC phân đoạn 4.4.2 Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát phân đoạn E4.4.2.3 thu chất NA - 19 E4.4.2.4 A1 A2 A3 A4 A2.1 A2.2 A2.3 A2.4 A2.3.1 A2.3.2 NA - 19 A2.3.4 Từ phân đoạn E4.4.2.4 tiếp tục SKC silica gel pha thường với với hệ dung môi chạy cột ban đầu 10C : 1Me Theo dõi quá trình SKC SKLM, các phân đoạn giống gom lại chung với nhau, thu phân đoạn A1, A2, A3 A4 Trong đó phân đoạn A2 cho vết rõ Phân đoạn tiếp tục mang SKC silica gel pha thường với hệ dung môi 20C : 1Me Với quá trình theo dõi SKLM tương tự ta thu phân đoạn A2.1, A2.2, A2.3 A2.4 Phân đoạn A2.3 cho vết rõ tiếp tục tiến hành SKC với hệ dung môi 10C : 1Me Sau quá trình SKC theo dõi SKLM ta thu phân đoạn A.2.3.1, A.2.3.2, A.2.3.3, A.2.3.4 đó có phân đoạn cho chất sạch NA - 19 A.2.3.3 Vết thu bởi SKLM có màu vàng, khối lượng chất thu mg Tên má hố phân Hệ dung mơi đoạn SKLM Ghi A1 10C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A2 10C:1Me Rõ vết ( Giải li hệ Khảo sát 5C:1Me ) A3 5C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A4 3C:1Me Nhiều vết Không khảo sát Bảng 2.4 Kết SKC phân đoạn E4.4.2.3 Tên má hoá phân Hệ dung môi đoạn SKLM Ghi A2.1 20C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A2.2 20C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A2.3 20C:1Me Rõ vết ( Giả li hệ Khảo sát 5C:1Me ) A2.4 10C:1Me Nhiều vết Không khảo sát Bảng 2.5 Kết SKC phân đoạn A2 E4.4.2.3 Tên má hố phân Hệ dung mơi đoạn SKLM Ghi A2.3.1 10C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A2.3.2 10C:1Me Nhiều vết Không khảo sát A2.3.4 10C:1Me Rõ vết (giải li hệ Chất sạch NA - 19 3C:1Me ) A2.3.4 5C:1Me Nhiều vết Không khảo sát Bảng 2.6 Kết SKC phân đoạn A2.3 thu chất NA – 19 2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Có nhiều phương pháp để tiến hành xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ, nghiên cứu sử dụng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt NMR ( Nuclear Magnetic Resonance ) phương pháp vật lý đại sử dụng để xác định cấu trúc hợp chất hữu đặc biệt các hợp chất với cấu trúc phức tạp các hợp chất hữu cơ thiên nhiên Phương pháo NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử cách tương tác xạ điện từ tần số radio với các hạt nhân đặt từ trường mạnh Nếu phổ hồng ngoại ( IR ) phát nhóm chức có mặt phân tử chất cần đo, NMR có thể cho biết số lượng nguyên tử mang khác biệt về mặt từ tính nghiên cứu Các loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H- NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Brucker Advance AV500 MHz DRX500 (500 MHz) Quy trình thực đo phổ NMR tiến hành tại Viện Hoá học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội 2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase 2.4.4.1 Nguyên tắc Việc xác định hoạt tính enzyme α - glucosidase tiến hành theo phương pháp Sigma Aldrich Sử dụng p – nitrophenyl - α - glucopyranoside (pNP – G) làm cơ chất bị enzyme α - glucosidase thuỷ phân thành p – nitrophenol D – glucose Sử dụng bước sóng 400 – 401 nm để đo độ hấp thu quang học từ đó định lượng p – nitrophenol Lượng glucose sinh tỉ lệ thuận với p – nitrophenol sinh ra, từ đó ta có thể xác định lượng D - glucose giải phóng sử dụng chất ức chế không sử dụng chất ức chế Tiến hành so sánh trên mẫu để lập đường biểu diễn độ tương quan nồng độ chất ức chế phần trăm ức chế, từ đó xác định số IC 50 Mẫu có hoạt tính cao giá trị IC 50 thấp 2.4.4.2 Chuẩn bị Cơ chất p – nitrophenyl - α - glucopyranoside (pNP – G): Dung dịch nền pNP – G 3.0 mM Cân xác 18.26 mg cơ chất, hồ tan dung dịch đệm, định mức 20 mL fiol Dung dịch sau pha phải che ánh sáng mặt trời Dung dịch đệm: Dung dịch photphate có pH = ( 0.01 M ) Dùng 20 mL dung dịch Na2HPO4 0.2 M 12 mL dung dịch NaH2PO4 0.5 M Chỉnh đệm đến pH = cách thêm nước cất Dùng fiol định mức đến 1000 mL Dung dịch Na2CO3 0.1M: Cân 10.62 g muối Na 2CO3 khan, hoà tan nước cất sau đó định mức đến 1000 mL fiol Dung dịch enzyme α-glucosidase 0.2 U mL-1 : dung dịch gốc pha cách hoà tan dung dịch đệm photphate mg enzyme α-glucosidase mL fiol Khuyến khích bảo quản mát dun dịch vừa pha nên sử dụng ngày Mẫu thử: Pha dung dịch đệm phosphate ở nồng độ 500 µM (đối với mẫu chất tinh khiết) 2.4.4.3 Tiến hành Hoà tan mẫu thử dung dịch đệm photphate có pH = Thêm 50 µL dung dịch enzyme 0.1 U mL-1 Lắc đều, ủ phút ở nhiệt độ khoảng 37°C Thêm 50 µL dung dịch nền 1.5 mM vào ủ khoảng 30 phút ở nhiệt độ tương tự Sau đó cho thêm 375 µL Na2CO3 0.1 M vào dung dịch trên để dừng phản ứng Tiến hành đo quang tại bước sóng 401 nm Mẫu hiệu chỉnh tiến hành pha tương tự mẫu thử, khác thay dung dịch mẫu dung dịch đệm photphate Mỗi mẫu thử ở nồng độ khác (250, 100, 50, 25, 10 µg mL -1 µM), nồng độ đo lần (tương ứng với nồng độ mẫu thử ta làm mẫu trắng (blank), mẫu trắng tương tự mẫu thử thay dung dịch enzyme dung dịch đệm phosphate) Từ đó tính giá trị phần trăm ức chế (I%) với từng nồng độ khảo sát trung bình cộng giá trị mật độ quang đo ở nồng độ giá trị IC50 2.4.4.4 Cách tính kết Khả ức chế enzyme α - glucosidase tính dựa trên phần trăm ức chế ( I% ) Phần trăm ức chế tính theo cơng thức: I%: Phần trăm ức chế As : Giá trị mật độ quang chất mẫu có chứa chất ức chế A0 : Giá trị mật độ quang mẫu không chứa chất ức chế IC50 : Nồng độ mẫu khảo sát mà tại đó có thể ức chế 50 % enzyme α-glucosidase CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ... tài Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn IV - cao Ethyl acetate Lan (Nervilia aragoana) nhằm khảo sát thành phần hóa học tìm hoạt tính sinh học tác dụng dược lý tiêu biểu cây Lan lá,... thành phố Hồ Chí Minh 2.2 NỘI DUNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nội dung Mẫu cây định danh khoa học điều chế cao ethanol toàn phần các cao phân đoạn cao Petroleum ether, cao Ethyl acetate, ... dược phẩm phát triển thuốc CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN MỘT LÁ 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố loài Cây Nervilia đầu tiên nhà khoa học Roptrostemom phát vào năm