Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh

Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ sinh thành, đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người. Em xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban chủ nhiệm, Thầy và Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Em xin trân trọng biết ơn: - TS. Phan Phước Hiền. - ThS. Mai Đình Trị. đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quí báu cho luận văn. - Cô Nguyễn Thị Huyên, phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Khoa Công Nghệ Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. - Ths. Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh Trần Kim Hùng Nguyên iv TÓM TẮT TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)". Đề tài được tiến hành tại - Phòng Hóa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và Phòng Hóa Lý-Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. - Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Khoa Công Nghệ Môi Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN PHƯỚC HIỀN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Nhằm khẳng định một phần những công dụng dân gian trên một cách có khoa học và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Những kết quả đạt được: - Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin… - Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung môi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol. Sau khi chiết tách tiến hành loại dung môi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung môi. - Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Kết quả thu cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là MICSalmonella = 340 μg/ml MICE. coli = 330 μg/ml - Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol. v MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các từ viết tắt ix Danh sách các bảng x Danh sách các hình xi Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xii Phần I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 3 2.1.1.Đặc điểm thực vật học 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái . 3 2.1.3.Thành phần hoá học . 4 2.1.4.Tính chất dược lý . 4 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian . 4 2.1.4.2. Tác dụng sinh học . 5 2.2. Vi khuẩn đường ruột 9 2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột . 9 2.2.1.1. Định nghĩa . 9 2.2.1.2. Hình thể . 9 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy 9 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học . 9 2.2.1.5. Sức đề kháng . 10 vi 2.2.1.6. Độc tố 10 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên . 11 2.2.1.8. Phân loại 12 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh . 13 2.3. Salmonella . 13 2.3.1. Đặc điểm sinh học . 14 2.3.1.1. Hình thái 14 2.3.1.2. Tính chất nuối cấy . 14 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học 15 2.3.1.4. Sức đề kháng . 15 2.3.1.5. Độc tố 15 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên . 15 2.3.1.7. Phân loại 16 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh . 16 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh . 16 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thương hàn 17 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn . 18 2.3.3. Miễn dịch 18 2.3.4. Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thương hàn 18 2.3.4.1 Cấy máu . 18 2.3.4.2. Cấy phân . 19 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp 19 2.3.5. Phòng bệnh 20 2.3.5.1. Phương pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu . 20 2.3.5.2. Phương pháp phòng bệnh đặc hiệu . 20 2.3.6. Điều trị 20 2.4. Escherichia coli 21 2.4.1. Đặc điểm sinh học . 21 2.4.1.1. Hình thái 21 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy . 21 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh . 22 vii 2.4.1.4. Sức đề kháng . 22 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên . 22 2.4.1.6. Phân loại 23 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh . 23 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật 24 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp . 24 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp 24 2.4.4. Phòng bệnh 24 2.4.5. Chữa bệnh . 24 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26 3.1. Vật liệu 26 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.1.1.1. Nguyên liệu . 26 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu . 26 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết . 26 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 27 3.2. Phương pháp nghiên cứu . 28 3.2.1. Xử lý nguyên liệu . 28 3.2.2. Xác định độ ẩm 28 3.2.3. Xác định tro toàn phần 28 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật 28 3.3.1. Nguyên tắc 28 3.3.2. Cách tiến hành . 28 3.4. Phương pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa 34 3.4.1. Điều chế các loại cao . 34 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa . 34 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 . 34 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol . 34 3.4.1.4. Điều chế cao nước . 34 3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa 36 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập được 36 viii 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn . 36 3.5.1. Chuẩn bị môi trường 36 3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa . 36 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục . 38 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy . 38 3.5.5. Thử nghiệm 39 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 41 4.1. Nguyên liệu 41 4.1.1. Xác định độ ẩm . 41 4.1.2. Xác định độ tro 41 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật . 41 4.3. Cô lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa 43 4.3.1. Điều chế các loại cao . 43 4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa . 43 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 . 43 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol . 43 4.3.1.4. Điều chế cao nước . 43 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa . 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S . 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 I. Kết luận 51 5.1. Khảo sát thành phần hóa học . 51 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn 51 II. Đề nghị . 51 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S 52 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S 53 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S . 54 Phụ lục 4: Phổ 13C của hợp chất S 55 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol 56 ix CÁC TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer. IR : Infrared, hồng ngoại. MS : Mass Spectrometry, khối phổ. J : Hằng số ghép cặp. s : Singlet, mũi đơn. d : Doublet, mũi đôi. t : Triplet, mũi ba. q : Quartet, mũi bốn. m : Multiplet, mũi đa. SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase. SGPT : Glutamic pyruvic transaminase. LD50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể. x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa . 4 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa 6 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol 8 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa . 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) . 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl3 trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml . 50 Bảng 4.6: Kết luận 50 [...]... nguồn vật liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiêu hoá nói riêng an toàn và hiệu quả hơn Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đƣờng ruột của cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)" 1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1... quyết định độc lực của vi khuẩn này 2.2.1.7 Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K - Kháng nguyên O: Kháng nguyên O là kháng nguyên thân của vi khuẩn Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào Kháng nguyên O là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên; poliozid... của kháng nguyên H kia Dựa vào kháng nguyên H người ta chia Salmonella thành các serotyp (typ huyết thanh) Kháng nguyên H lai được chia thành hai phase: phase 1 đặc hiệu và phase 2 không đặc hiệu Thường các chủng Salmonella đều có cả hai phase này (trừ S typhi và S paratyphi) Kháng nguyên K: Kháng nguyên K chỉ có ở S typhy và S paratyphi C và còn được gọi là kháng nguyên Vi (Virulence) Kháng nguyên Vi. .. vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn - Kháng nguyên K: Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường... sơ bộ thành phần hóa thực vật các cấu tử hữu cơ có trong lá Xuân Hoa - Chiết tách hợp chất hữu cơ từ lá Xuân Hoa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng - Khảo sát khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa 2 1.2.1 Yêu cầu - Định tính sơ bộ một số cấu tử hữu cơ có trong lá cây Xuân Hoa theo phương pháp phân tích của trường Đại Học Dược... nhất có trong môi trường Simmons Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta có thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đó vào họ này Ngoài các tính chất đó, nhiều tính chất sinh vật hóa học khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae 2.2.1.5 Sức đề kháng Vì không có khả năng sinh nha bào nên các thành vi n của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hoá lý... khó tan Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bởi kháng nguyên này Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để 12 phân loại vi khuẩn Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông Kháng nguyên H có... yếu tố kháng nguyên O của E coli Kháng nguyên K: Là kháng nguyên bề mặt Khoảng 100 loại yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và chia làm 3 loại dựa vào độ nhạy cảm của của kháng nguyên này với nhiệt độ: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử Kháng nguyên H: Là kháng. .. tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ) Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, dể chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong Nội độc tố không bị mất tính độc ở 1000C trong 30 phút Nội độc tố là chất có khả năng gây sốt Một số thành vi n của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngọai độc tố như S.shiga, E.coli loại ETEC (enterotoxigenic E.coli) Ngoại... Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 1000C và bởi các hóa chất sát khuẩn thông thường Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền 11 2.2.1.6 Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố Bản chất hóa học của nội độc tố là lipopolysaccharid (LPS) . NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN. KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG