Chuẩn bị dịch chiết:
- Dịch chiết ether:
Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết cồn:
Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nĩng bằng cồn 960 trong bể siêu âm đến khi dịch gần khơng màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết nƣớc:
Bã sau khi chiết bằng cồn 960, đem chiết nĩng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50ml.
Xác định các nhĩm hợp chất:
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch ether:
Chất béo Anthraglycosid
Triterpenoid tự do Alkaloid
Flavonoid Coumarin
Tinh dầu Carotenoid
Acid hữu cơ
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch cồn:
Alkaloid Antraglycosid
Tanin Đường khử
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch nƣớc: Alkaloid Antraglycosid Saponin Flavonoid Tanin Polyuronic Đường khử Phương pháp định tính:
Acid hữu cơ:
Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha lỗng với 1 ml nước cất, thêm một ít tinh thể NaCO3. Nếu cĩ bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO3 - Cĩ acid hữu cơ.
Alkaloid:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đĩ các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là cĩ alkaloid:
Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt Bertrand : Tủa trắng
Bouchardat : Tủa đỏ nâu Dragendorff : Tủa đỏ cam
Antraglycosid:
Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đĩ NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm cĩ màu từ hồng tới đỏ - Cĩ anthraglycosid.
Carotenoid:
Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đĩ vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hịa trong CHCl3). Dung dịch cĩ màu đỏ - Cĩ carotenoid.
Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch cĩ màu xanh dương - Cĩ carotenoid.
Chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung mơi, hết mùi tinh dầu (nếu cĩ). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Cĩ chất béo.
Đƣờng khử:
Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hịa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu cĩ tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Cĩ các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
Coumarin:
Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đĩ hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khơ. Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa khơng bị che – cĩ coumarin.
Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hịa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một cĩ huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai - cĩ coumarin.
Flavonoid:
Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khơ. Hịa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đĩ một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch cĩ màu từ hồng tới đỏ - cĩ flavonoid.
Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl
10 %, nếu dung dịch cĩ màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hĩa bằng dung dịch NaOH 10 % - Cĩ anthocyanosid.
Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl
10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch cĩ màu hồng tới đỏ - cĩ proanthocyanidin.
Polyuronic:
Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm cĩ chứa 10 ml cồn 950 . Nếu cĩ nhiều tủa bơng được tạo thành - cĩ polyuronid.
Saponin:
Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hịa cắn với 5 ml cồn 250 trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu cĩ bọt bền - cĩ saponin.
Tanin:
Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm:
Ống 1: Pha lỗng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %, lắc đều. Nếu dung dịch cĩ màu xanh rêu hay xanh đen - cĩ polyphenol.
Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu cĩ tủa bơng trắng - cĩ tanin.
Tinh dầu:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn cĩ mùi thơm nhẹ cho vào đĩ một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn cĩ mùi thơm nhẹ đặc trưng – cĩ tinh dầu.
Triterpenoid:
Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hịa cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl3, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vịng ngăn cách cĩ màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - cĩ triterpennoid tự do (phytosterol).
Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật FeCl3 TT Fehling A, B Nguyên liệu Mg/HClđđ Chiết bằng ether Bã nguyên liệu Dịch Ether KOH 10% Chiết bằng cồn Lớp kiềm Lớp ether Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch cồn Dịch ether Dịch acid Bã nguyên liệu Dịch acid H2SO4 10% vết trên giấy lọc KOH 10% Flavonoid Acid béo Anthraglycosid Cắn cĩ mùi thơm Liebermann H2SO4đđ Tinh dầu Phytosterol Carotenoid
TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft
Alkaloid KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na2CO3 Na Acetat + FeCl3 3% Mg/HClđđ KOH 10% Liebermann Anthraglycosid Sterolic Flavonoid Tanin Acid hữu cơ Alkaloid Đường khử Anthocyan Saponin Tạo bọt Cồn cao độ TT Mayer, Bouchardat H2SO4 1% H/c uronic Đường khử Tanin Alkaloid Saponin
3.4. Phƣơng pháp cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
3.4.1. Điều chế các loại cao
3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa.
3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3
Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3.
3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol
Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol.
3.4.1.4. Điều chế cao nƣớc
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thơ từ lá Xuân Hoa
Lá khơ 500 g
- Xay nhỏ, đun Soxhlet 72h với EtOH 70 %; 4lít, lọc
Bã Dịch trích EtOH
- Cơ dưới áp suất thấp cịn 1 lít, thêm 1 lit nước cất
- Tận trích với ete dầu hỏa 1,5 lít.
Pha nước Dịch trích CHCl3
Cao ete dầu hỏa
Pha nước Dịch trích
Ete dầu hỏa
Cao CHCl3 Dịch trích n - Butanol Cao n - Butanol Pha nước Cao nước Tận trích với CHCl3; 2 lít - Làm khan với Na2SO4, Lọc
- Cơ cạn dưới áp suất thấp
- Lọ c
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
- Làm khan với Na2SO4 - Lọc
- Cơ cạn dưới áp suất
thấ p
- Lọ c
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
Tận trích với n-Butanol - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
-Làm khan với Na2SO4, lọc - Cơ cạn dưới áp suấtthấp
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
3.4.2. Cơ lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa
Thực hiện sắc ký cột trên cao ete dầu hỏa, chất hấp phụ silicagel, dung mơi giải ly là ete dầu hỏa, EtOAc và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dần.
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi giải ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là dung dịch H2SO4 10 %/EtOH.
Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký cột tiếp theo các phân đoạn giống nhau, kết tinh thu được hợp chất sạch.
3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cơ lập đƣợc
Sử dụng phương pháp phổ nghiệm IR, MS, 1
H-NMR, 13C-NMR…để xác định cấu trúc.
3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn[12],[23],[24],[25]26],[28]
Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha lỗng liên tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa đã cơ lập được cĩ khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ cơng ty Nam
Khoa.
Mơi trường nuơi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là mơi trường BHI.
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước.
Dung mơi sử dụng để hịa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO)
3.5.1. Chuẩn bị mơi trƣờng
Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để mơi trường tan đều. Cho vào 2 bình tam giác, làm nút bơng đậy lại. Sau đĩ tiến hành hấp vơ trùng mơi trường ở điều kiện 1210C trong vịng 20 phút bằng Autoclave.
3.5.2. Pha lỗng cao Xuân Hoa
Pha lỗng cao chloroform
Cân 0,04 g cao chloroform bằng cân điện tử cho vào 1 ống nghiệm chứa 2ml dung mơi DMSO. Đun nhẹ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để cao hịa tan hồn
tồn vào dung mơi. Lúc này nồng độ của cao chloroform trong ống nghiệm là 0,02 g/ml.
Tiến hành pha lỗng dung dịch cao với mơi trường dinh dưỡng theo tỉ lệ 1 ml dung dịch cao : 9 ml mơi trường dinh dưỡng lỏng BHI. Lúc này ta thu được dung dịch cao hịa tan trong mơi trường dinh dưỡng với nồng độ 0,002 g/ml (2000 μg/ml)
Lấy 12 ống nghiệm, chia làm 2 nhĩm, đánh số thứ tự từ 1C đến 6C mỗi nhĩm. Cho vào các ống nghiệm dung dịch cao chloroform đã pha lỗng trên lần lượt:
- Ống nghiệm 1C, 100 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 2C, 200 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 3C, 300 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 4C, 400 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 5C, 500 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 6C, 600 μl mỗi ống.
Dùng pipette hút hút mơi trường dinh dưỡng BHI đã chuẩn bị ở trên cho vào 6 ống nghiệm ở trên theo thứ tự:
- Ống số 6C 400 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1200 μg/ml.
- Ống số 5C 500 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1000 μg/ml.
- Ống số 4C 600 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 800 μg/ml.
- Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 600 μg/ml.
- Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 400 μg/ml.
-Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 200 μg/ml.
Pha lỗng các loại cao cịn lại
Tiến hành tương tự như qui trình pha lỗng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao nước.
3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục
Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối BaSO4.2H2O. a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M) BaCl2.2H2O 11,75 g Nước cất vừa đủ 1000 ml b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N) H2SO4 1% c. Dung dịch chuẩn độ đục: Dung dịch A 0,5 ml Dung dịch B 99,5 ml
Chia vào các tube nút vặn cĩ cùng kích cỡ với tube nuơi cấy hay pha cấy mầm mỗi ống 4 – 6 ml, vặn chặt nút. Giữ trong tối ở nhiệt độ phịng.
Trước khi dùng lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn trên máy rung. Hằng tháng phải thay các tube độ đục chuẩn.
3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy
Tiêu chuẩn cần đạt được là 5x105 CFU/ml.
Hai chủng vi sinh vật: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium được cấy sang ống nghiệm chứa mơi trường thạch TSA, ủ ở 370C qua đêm.
Sau khi vi khuẩn mọc đều trên mặt thạch, tiến hành cấy chuyền vào mơi trường lỏng đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 370C trong vịng 16-24 giờ.
Điều chỉnh độ đục của canh vi khuẩn cấy ngang với độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0.5 (tương đương 108 CFU/ml) bằng nước muối sinh lí 0,85 %.
Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn BHI Đ/C Huyền dịch Salmonella Dung dịch Mc Farland 0,5 Huyền dịch E. coli
Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml mơi trường lỏng BHI. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và mơi trường BHI.
Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha lỗng ở trên cho vào 3 ống nghiệm chứa 9 ml mơi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn
và mơi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là 106 CFU/ml.
Tiến hành pha lỗng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC
25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha lỗng ta thu được 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 106 CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella 106
CFU/ml.
3.5.5. Thử nghiệm
Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung mơi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 0,06 ml dung mơi DMSO và 0,94 ml mơi trường BHI. Sau đĩ cho vào ống thứ nhất 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, cho vào ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella.
Dùng 2 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1ml mơi trường BHI. Cho vào ống thứ nhất 1ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, ống thứ hai 1ml huyền dịch vi
khuẩn Salmonella.
Chia các ống nghiệm đã pha lỗng các loại cao trên thành 2 nhĩm giống nhau, mỗi nhĩm dùng để thử nghiệm một chủng vi khuẩn.
Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ nhất, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli đã pha lỗng 106
CFU/ml.
Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ hai, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn
Salmonella đã pha lỗng 106 CFU/ml.
Như vậy trong mỗi ống nghiệm mật độ vi khuẩn là 5 x 105 CFU/ml. Nồng độ của các loại cao trong ống nghiệm lần lượt là 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml đối với mỗi nhĩm..
Cao nước Cao ete dầu hỏa