Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha lỗng liên tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa đã cơ lập được cĩ khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ cơng ty Nam
Khoa.
Mơi trường nuơi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là mơi trường BHI.
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước.
Dung mơi sử dụng để hịa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO)
3.5.1. Chuẩn bị mơi trƣờng
Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để mơi trường tan đều. Cho vào 2 bình tam giác, làm nút bơng đậy lại. Sau đĩ tiến hành hấp vơ trùng mơi trường ở điều kiện 1210C trong vịng 20 phút bằng Autoclave.
3.5.2. Pha lỗng cao Xuân Hoa
Pha lỗng cao chloroform
Cân 0,04 g cao chloroform bằng cân điện tử cho vào 1 ống nghiệm chứa 2ml dung mơi DMSO. Đun nhẹ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để cao hịa tan hồn
tồn vào dung mơi. Lúc này nồng độ của cao chloroform trong ống nghiệm là 0,02 g/ml.
Tiến hành pha lỗng dung dịch cao với mơi trường dinh dưỡng theo tỉ lệ 1 ml dung dịch cao : 9 ml mơi trường dinh dưỡng lỏng BHI. Lúc này ta thu được dung dịch cao hịa tan trong mơi trường dinh dưỡng với nồng độ 0,002 g/ml (2000 μg/ml)
Lấy 12 ống nghiệm, chia làm 2 nhĩm, đánh số thứ tự từ 1C đến 6C mỗi nhĩm. Cho vào các ống nghiệm dung dịch cao chloroform đã pha lỗng trên lần lượt:
- Ống nghiệm 1C, 100 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 2C, 200 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 3C, 300 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 4C, 400 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 5C, 500 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 6C, 600 μl mỗi ống.
Dùng pipette hút hút mơi trường dinh dưỡng BHI đã chuẩn bị ở trên cho vào 6 ống nghiệm ở trên theo thứ tự:
- Ống số 6C 400 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1200 μg/ml.
- Ống số 5C 500 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1000 μg/ml.
- Ống số 4C 600 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 800 μg/ml.
- Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 600 μg/ml.
- Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 400 μg/ml.
-Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 200 μg/ml.
Pha lỗng các loại cao cịn lại
Tiến hành tương tự như qui trình pha lỗng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao nước.
3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục
Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối BaSO4.2H2O. a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M) BaCl2.2H2O 11,75 g Nước cất vừa đủ 1000 ml b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N) H2SO4 1% c. Dung dịch chuẩn độ đục: Dung dịch A 0,5 ml Dung dịch B 99,5 ml
Chia vào các tube nút vặn cĩ cùng kích cỡ với tube nuơi cấy hay pha cấy mầm mỗi ống 4 – 6 ml, vặn chặt nút. Giữ trong tối ở nhiệt độ phịng.
Trước khi dùng lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn trên máy rung. Hằng tháng phải thay các tube độ đục chuẩn.
3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy
Tiêu chuẩn cần đạt được là 5x105 CFU/ml.
Hai chủng vi sinh vật: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium được cấy sang ống nghiệm chứa mơi trường thạch TSA, ủ ở 370C qua đêm.
Sau khi vi khuẩn mọc đều trên mặt thạch, tiến hành cấy chuyền vào mơi trường lỏng đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 370C trong vịng 16-24 giờ.
Điều chỉnh độ đục của canh vi khuẩn cấy ngang với độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0.5 (tương đương 108 CFU/ml) bằng nước muối sinh lí 0,85 %.
Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn BHI Đ/C Huyền dịch Salmonella Dung dịch Mc Farland 0,5 Huyền dịch E. coli
Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml mơi trường lỏng BHI. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và mơi trường BHI.
Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha lỗng ở trên cho vào 3 ống nghiệm chứa 9 ml mơi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn
và mơi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là 106 CFU/ml.
Tiến hành pha lỗng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC
25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha lỗng ta thu được 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 106 CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella 106
CFU/ml.
3.5.5. Thử nghiệm
Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung mơi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 0,06 ml dung mơi DMSO và 0,94 ml mơi trường BHI. Sau đĩ cho vào ống thứ nhất 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, cho vào ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella.
Dùng 2 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1ml mơi trường BHI. Cho vào ống thứ nhất 1ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, ống thứ hai 1ml huyền dịch vi
khuẩn Salmonella.
Chia các ống nghiệm đã pha lỗng các loại cao trên thành 2 nhĩm giống nhau, mỗi nhĩm dùng để thử nghiệm một chủng vi khuẩn.
Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ nhất, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli đã pha lỗng 106
CFU/ml.
Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ hai, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn
Salmonella đã pha lỗng 106 CFU/ml.
Như vậy trong mỗi ống nghiệm mật độ vi khuẩn là 5 x 105 CFU/ml. Nồng độ của các loại cao trong ống nghiệm lần lượt là 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml đối với mỗi nhĩm..
Cao nước Cao ete dầu hỏa
Cao n-butanol Cao CHCl3
Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào
Sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào, ủ các ống nghiệm của hai nhĩm, 2 ống nghiệm đối chứng và 2 ống nghiệm thử dung mơi ở nhiệt độ 370C . Sau 16-20 giờ tiến hành đọc kết quả.
Quan sát sự thay đổi độ đục của mơi trường, sự tạo thành cặn ở đáy của ống nghiệm và sự tạo thành váng ở bề mặt mơi trường.
Sau khi ủ, xác định hai nồng độ kế cận nhau mà vi khuẩn làm đục và khơng làm đục mơi trường. Chia nhỏ hai nồng độ trên thành nhiều khoảng nồng độ và tiến hành thử nghiệm như trên.
Sau quá trình thử nghiệm ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của các loại cao đối với vi khuẩn thử nghiệm.
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khơ, sấy ở 500C đến trọng lượng khơng đổi, sau đĩ xay thành bột.
4.1.1. Xác định độ ẩm
Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào chén sứ, sấy ở 1050C trong 2 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đĩ cân thu được 1,1 g. Như vậy độ ẩm của mẫu là:
Độ ẩm mẫu = (10 - 1,1 ) x 100 % = 89 %
4.1.2. Xác định tro tồn phần
Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lị nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro cịn lại được 1,2 g. Như vậy hàm lượng tro của mẫu là:
Hàm lượng tro = 1,2/10 x 100 % = 12%
4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật của lá cây Xuân Hoa được thu nhận ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tĩm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học lá cây Xuân Hoa: Tên hợp chất Thuốc thử Kết quả Loại dung dịch
Ete Cồn Nước Antraglycosid KOH 10% Dung dịch màu đỏ - + -
Flavonoid HClđđ+Mg kim loại Màu đỏ - + - Acd béo Nhỏ dd lên giấy lọc Để vết mờ +
Alkaloid
Mayer Tủa - + -
Dragendorf Tủa - + -
Bouchardat Tủa - + -
Carotenoid H2SO4 Màu xanh nhạt +
Phytosterol Anhydric acetic+H2SO4
Chỗ tiếp xúc cĩ màu nhạt
++
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Mùi thơm nhẹ + Coumarin Soi UV Phát huỳnh quang +
Polyphenol FeCl3 2% Màu xanh đen ++ +
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt +
Đường khử Thuốc thử Fehling Đỏ gạch ++ +
Antracyanosid HCl, NaOH Khơng màu +
Saponin Lắc mạnh Tạo bọt Bền Bền Liebermann Cĩ vịng tím nâu chuyển sang đỏ ++ + Hợp chất uronic Pha lỗng EtOH 90%
Tủa bơng nhiều ++
Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: khơng cĩ Nhận xét:
- Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu, coumarin, acid hữu cơ.
- Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid, alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin.
- Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử, saponin và hợp chất uronic.
4.3. Cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
4.3.1. Điều chế các loại cao
4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa 5,6 g.
4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3
Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3 9,8 g.
4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol
Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol 15,2 g.
4.3.1.4. Điều chế cao nƣớc
Phần nước cịn lại tiến hành cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao H2O 25,7 g. Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi được tính theo cơng thức:
H = 500
A
x 100 %
Trong đĩ:
- H : hiệu suất chiết suất. - A : Khối lượng cao thu được. - 500 : khối lượng mẫu ban đầu.
Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi
Loại dung mơi Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%)
Ete dầu hỏa 5,6 1,12
Chloroform 9,8 1,98
n-butanol 15,2 3,04
0 1 2 3 4 5 6
Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước
%
Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi 4.3.2. Cơ lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa
Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp phụ là silicagel, dung mơi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực tăng dần.
Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn
Ở phân đoạn 9 với dung mơi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cơ cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g). Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho hai vết màu nâu đen, một vết đậm Rf = 0,23 và một vệt mờ Rf= 0,17.
Kết quả sắc ký cột silicagel trên 3g cao ete dầu hỏa được tĩm tắt ở bảng 4.3 Hiệu suất chiết suất (%)
Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước
1,12
5,14
3,04 1,98
Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) Phân đoạn Dung ly Thể tích (ml) Trọng lượng cặn (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú 1 E(100%) 100 2 E:EtOAc 99:1 200 75 Vệt dài 3 E:EtOAc 98:2 200 86 Vệt dài 4 E:EtOAc 97:3 200 98 Vệt dài 5 E:EtOAc 96:4 200 112 Nhiều vết 6 E:EtOAc 95:5 200 153 Nhiều vết 7 E:EtOAc 94:6 200 256 Nhiều vết 8 E:EtOAc 93:7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 92:8 400 116 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 10 E:EtOAc 90:10 400 119 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 11 E:EtOAc 85:15 600 142 Nhiều vết 12 E:EtOAc 80:20 600 155 Nhiều vết 13 E:EtOAc 70:30 200 120 Nhiều vết 14 E:EtOAc 60:40 600 114 Nhiều vết 15 E:EtOAc 50:50 400 250 Nhiều vết
Ghi chú: E = Ete dầu hỏa; EtOAc = ethylacetate; EtOH = ethyl alcol
Ở phân đọan 9,10 tiếp tục quá trình sắc ký cột lần 2 với hệ dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 tới 85 : 15 thu được 5 phân đọan sau khi cơ cạn dung mơi phân đoạn 2 và 3 và kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim màu trắng (64mg) đặt tên S. Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho một vết màu nâu Rf = 0,23.
Sơ đồ 4.1: Tĩm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa
Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S
Cao ete dầu hỏa Hợp chất S
Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 90 : 10 → 85 : 15 Cao ete dầu hỏa (3 g)
Sắc ký cột silicagel
E : EtOAc 100 % → 50 : 50 Thu đđược 15 phân đoạn
Phân đoạn 9, 10 (0,235 g)
Thu được 5 phân đoạn 1 – 5
Bay hơi dung mơi và rữa sạch phân đoạn 2 và 3, kết tinh thu được hợp chất sạch S (64 mg)
4.3.3. Khảo sát cấu trúc hĩa học của hợp chất S
* Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung mơi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 1100C cho một vết duy nhất màu nâu cĩ giá trị Rf = 0,23.
*Nhiệt độ nĩng chảy 154-1560C (MeOH).
* Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1)
m/z: 414 (M+); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2)
ν, cm-1:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hịa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O).
* Phổ 1H-NMR, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 3)
5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhĩm –CH3.
* Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –)
Biện luận cấu trúc S:
S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller.
Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm-1); 1H-NMR (3,52ppm); 13C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S cĩ nhĩm – OH.
Phổ 13
C-NMR và 1H-NMR cho thấy S cĩ hai nối đơi, trong đĩ 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết cịn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S cĩ 3 carbon bậc bốn (>C<), 11 carbon bậc 3 (>CH –), 9 carbon bậc hai (– CH2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH3), từ đĩ cơng thức phân tử của S là C29H48O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M+= 414).
Độ bất bão hồ của S là 6, như vậy cấu trúc S cĩ 4 vịng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid.
Phổ 1H-NMR cho biết nối đơi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz).
Các nhận định ban đầu cho thấy S cĩ thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị