Phân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam (Luận văn thạc sĩ)

Phân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt NamPhân lập gen mã hóa enzyme GDPDmannose3’.5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC \ THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn cán Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tơi tiến hành thí nghiệm đề tài Tơi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ gia đình bạn bè suốt thời gian học tập thực hiện đề tài luận văn Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh cao học Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại thực vật học đặc điểm sinh học quýt 1.1.1 Phân loại thực vật học quýt 1.1.2 Đặc điểm sinh học quýt 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng quýt 1.2 Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid thực vật 1.2.1 Ascorbic acid 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin C 1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền 11 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 17 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17 iii 2.2.2 Phương pháp xác định trình tự gen 17 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22 2.4 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận văn 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nhân giải trình tự gen GDP-D từ DNA giống quýt BS-LS 23 3.1.1 Kết nhân gen GDP-D kỹ thuật PCR 23 3.1.2 Kết tách dòng gen GDP-D 24 3.1.3 Đặc điểm trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS 25 3.2 Sự đa dạng trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 Kết luận 34 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh bp base pair CIAA 24 Chloroform: isoamylalcol CTAB Cetyl trimetyl amomnium bromide DEPC Diethyl Pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleotide acid DNTPs Deoxynucleotide triphosphate GDP-D GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase kb kilo base NCBI National Center for Biotechology Information PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris - Acetate - EDTA iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.2 Chu kì nhiệt phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT 20 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony - PCR 21 Bảng 3.1 Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 27 Bảng 3.2 Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy diễn gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 29 Bảng 3.3 Trình tự gen mang mã số GenBank sử dụng phân tích 30 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng hệ số phân ly trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS trình tự GenBank 31 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng hệ số phân ly BS-LS trình tự GenBank dựa trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D 32 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.1 Các dạng Ascorbic acid tự nhiên Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số mẫu quýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F GDP-D-R 23 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc 24 Hình 3.3 Đặc điểm trình tự nucleotide mẫu BS-LS thu máy xác định trình tự nucleotide tự động 25 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D GenBank mang mã số HQ224946 27 Hình 3.5 Kết phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống qt BS-LS với số trình tự gen cơng bố GenBank 28 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank 29 Hình 3.7 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ BS-LS với trình tự cơng bố GenBank dựa trình tự nucleotide gen GDP-D 31 Hình 3.8 Sơ đồ hình mô tả mối quan hệ BS-LS với trình tự cơng bố GenBank dựa trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D 32 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) giống ăn nhiều người biết đến với vị thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin, khoáng chất dinh dưỡng cần thiết cho người Quýt khuyến khích sử dụng ngày chuyên gia dinh dưỡng Quýt không nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà đóng vai trò tích cực phát triển kinh tế nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thu nhập cao cho hộ làm vườn so với nông nghiệp khác, trung bình từ 80 - 100 triệu đồng/ha/năm Cây quýt trồng lâu đời miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thích nghi sinh thái diện hẹp, đòi hỏi kỹ tính điều kiện canh tác, nơng hóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu Điều dễ nhận thấy loại quýt trồng phù hợp địa bàn đặc hữu với giống thường gặp quýt sen (Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt Quang Thuận (Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt Bắc Sơn (Lạng Sơn) [4] Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin C 100gram Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hệ thống miễn dịch cân trọng lượng thể Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khác nhau, điều ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua giống quýt Nghiên cứu đặc điểm trình tự gen tham gia tổng hợp vitamin C, tìm hiểu sự đa dạng trình tự gen giống quýt địa phương sở đề xuất sử dụng đa dạng hóa việc chọn giống cho vùng trồng chuyên canh Xuất phát từ những lý trên, lựa chọn đề tài: “Phân lập gen mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.” Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nhân giải trình tự gen GDP-D từ DNA giống quýt BS-LS 3.1.1 Kết nhân gen GDP-D kỹ thuật PCR Cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R thiết kế dựa trình tự đoạn mã hóa gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank Giống quýt BS-LS có chất lượng tốt, sinh trưởng khỏe sử dụng làm đối tượng phân lập gen GDP-D Tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng để phục vụ thí nghiệm tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết, gen GDP-D nhân kỹ thuật PCR với cặp mồi GDP-DF/GDP-D-R sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% ~1kb 0,75kb → Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số mẫu quýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F GDP-D-R; 1: mẫu BS-LS; M: thang chuẩn DNA 1kb Kết thu hình 3.1 cho thấy, mẫu quýt BS-LS cho sản phẩm PCR băng DNA với kích thước ước tính khoảng kb, phù hợp theo tính toán lý thuyết thiết kế mồi tương ứng với kích thước đoạn mã hố GDP-D cam mang mã số HQ224946 GenBank Tuy nhiên, để 23 khẳng định xác sản phẩm thu gen GDP-D chúng tơi tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide so sánh với trình tự GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank Sản phẩm PCR tinh Kit DNA extraction Kit K05013 hãng Fermentas nhân dòng PCR để thu lượng sản phẩm đủ lớn phục vụ giải trình tự nucleotide 3.1.2 Kết tách dòng gen GDP-D Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% tiến hành tinh gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α sốc nhiệt (42oC phút 30 giây) Tiến hành chọn dòng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu Chọn ngẫu nhiên đĩa ni cấy dòng tế bào khả biến E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen GDP-D phân lập từ mẫu BS-LS khuẩn lạc màu trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR Sản phẩm colony-PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% đệm TAE 1X, nhuộm gel Ethidium bromid 1% chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím Kết cho thấy, tất dòng khuẩn lạc kiểm tra dương tính với phản ứng PCR Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR chọn để tách plasmid tái tổ hợp đem giải trình tự Sản phẩm tách plasmid kiểm tra điện di gel agarose 0,8 % đệm TAE 1X, nhuộm gel Ethidium bromid 1% chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím ~1kb Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc (1, 2, 3, 4: GDP-D khuếch đại từ khuẩn lạc BS-LS; M: thang DNA chuẩn kb) 24 3.1.3 Đặc điểm trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS Kết xác định trình tự gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS máy xác định trình tự nucleotide tự động trình bày hình 3.3 Hình 3.3: Đặc điểm trình tự nucleotide mẫu BS-LS thu máy xác định trình tự nucleotide tự động 25 26 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D GenBank mang mã số HQ224946 Kết so sánh phần mềm BioEdit cho thấy, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81% So sánh trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D mã số HQ224946 GenBank sử dụng thiết kế mồi hình 3.4 cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, sai khác vị trí nucleotide, vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 Vị trí nucleotide 370 Gen GDP-D phân lập từ giống BS-LS - Gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank T 371 - T 984 - A TT 27 Ngồi ra, BLAST NCBI cho thấy trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR 99% Bên cạnh đó, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống qt BS-LS có tỷ lệ tương đồng với số trình tự khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 95%; FJ643600 87%; XM021440285, XM021440284 85% (Hình 3.5) Hình 3.5 Kết phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với số trình tự gen cơng bố GenBank Như vậy, chúng tơi tách dòng thành cơng giải trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập Bắc Sơn- Lạng Sơn với chiều dài 1083bp 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với protein suy diễn từ trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank phần mềm BioEdit thể hiện hình 3.6 Kết cho thấy, protein gen GDP-D mã hóa có 361 amino acid So với protein suy diễn từ trình tự gen mang mã số HQ224946 GenBank trình tự amino acid mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng 28 99% Tuy nhiên, trình tự amnio acid protein GDP-D có sự khác amino acid (Bảng 3.2) Hình 3.6 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank Bảng 3.2 Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy diễn gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 TT Vị trí amino acid Protein suy diễn từ Protein suy diễn từ gen gen GDP-D phân lập GDP-D mang mã số từ giống BS-LS HQ224946 GenBank 124 X F 328 X G 29 Từ hình 3.6 bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D giữa giống quýt BS-LS trình tự protein suy diễn gen GDP-D công bố GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống nhau, khác vị trí acid amin, vị trí 124, 328 3.2 Sự đa dạng trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D Tiến hành so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D cơng bố GenBank để xác định hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình để phân tích sự đa dạng mẫu qt thơng qua trình tự gen GDP-D Bảng 3.3 Trình tự gen mang mã số GenBank sử dụng phân tích Giống / Mã số TT Năm công bố Đối tượng GenBank XM_025101133 2018 Cam đỏ XM_006486355 2018 Cam đỏ FJ643600 2009 Quả Dương đào XM_006435547 2018 Cam đỏ XM_024064261 2007 Cam đỏ XM_021440284 2017 Cam đỏ XM_021440285 2017 Cam đỏ Các trình tự gen sử dụng để so sánh có mẫu (mang mã số XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, XM_024064261, FJ643600) mẫu BS-LS Kết bảng 3.4 cho thấy hệ số tương đồng giữa cặp so sánh dao động từ 69,0% đến 99,5%; hệ số sai khác từ 0,0% đến 40,1% 30 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng hệ số phân ly trình tự nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS trình tự GenBank Mối quan hệ di truyền mẫu quýt sở phân tích gen GDP-D thể hiện sơ đồ hình hình 3.7 Hình 3.7 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ BS-LS với trình tự cơng bố GenBank dựa trình tự nucleotide gen GDP-D Sơ đồ hình (Hình 3.7) dựa kết so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D cho thấy, mẫu phân thành hai nhóm chính, nhóm I gồm mẫu chia thành hai nhóm phụ, nhóm phụ gồm mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, BS-LS; nhóm phụ gồm mẫu XM_024064261 Nhóm phụ lại chia thành nhóm nhỏ: nhóm nhỏ gồm mẫu XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, BS-LS; nhóm nhỏ gồm mẫu XM_021440284, 31 XM_021440285; nhóm nhỏ chia thành nhánh: nhánh gồm mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355; nhánh gồm mẫu BSLS; nhánh chia thành nhánh nhỏ: nhánh nhỏ gồm mẫu: XM_006435547, XM_006486355; nhánh nhỏ gồm mẫu XM_025101133 Nhóm II gồm mẫu FJ643600 Như vậy, mẫu quýt BS-LS mà nghiên cứu thuộc nhóm I Tiếp tục phân tích mối quan hệ mẫu dựa trình tự amino acid suy diễn, kết thể hiện bảng 3.5 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng hệ số phân ly BS-LS trình tự GenBank dựa trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D Kết bảng 3.5 cho thấy, hệ số tương đồng giữa cặp so sánh dao động từ 94,8% đến 99,9%; hệ số sai khác từ 0,0% đến 3,1% Hình 3.8 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ BS-LS với trình tự cơng bố GenBank dựa trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D 32 Khoảng cách di truyền tính sở so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D giữa nhóm 30.5% (Hình 3.7), dựa trình tự amino acid khoảng cách di truyền giữa nhóm 1,4% (Hình 3.8) Kết phân tích cho thấy trình tự nucleotide gen GDP-D mẫu quýt khác tương đối nhiều, chúng mã hóa nhiều amino acid khác nhau, dẫn tới tổng hợp enzyme GDP-D có chức xúc tác khác Vì vậy, khả tổng hợp vitamin C mẫu khác 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS nhân thành công phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GDP-F/GDP-R có kích thước 1083bp 1.2 Trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81% 1.3 Trình tự nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS tương đồng với trình tự nucleotide gen GDP-D mang mã số HQ224946 99% tương đồng trình tự mang mã số FJ643600 87,3% 1.4 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D giống quýt BS-LS giống trình tự amino acid protein mang mã số ADV59923 (do HQ224946 mã hóa) 99% giống protein mang mã số ACN38266 (do FJ643600 mã hóa) 95,9% 1.5 Hệ số tương đồng trình tự gen GDP-D mẫu quýt nghiên cứu so với mẫu GenBank dao động từ 69,0% đến 99,5%, hệ số sai khác 0,1% đến 4,7% Hệ số tương đồng trình tự amino acid suy diễn mẫu so sánh dao động từ 98,4% đến 99,9% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu trình tự đoạn mã hóa gen GDP-D làm sở cho việc thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GDP-D phục vụ chuyển gen để cải thiện hàm lượng vitamin C quýt 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - Xã hội Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn Nguyễn Văn Được (2004), “Đa dạng sinh học giống có múi hụn Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”, Tạp chí Khoa học, số 1: 111-121 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên Trần Đình Long (1997), Chọn giống trồng, Nxb Nơng nghiệp Hồng Trọng Phán (2008), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Đại học Huế Hoàng Thị Sản (2004), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, Nhà xuất khoa học kĩ thuật Nguyễn Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật Lê Duy Thành (2003), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Nơng nghiệp 10 Quyền Đình Thi (2005), Những kỹ thuật phân tích DNA, Nhà xuất Bản Khoa học Kỹ thuật 11 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (2000), Phân loại học thực vật, Nxb ĐHQGHN 12 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2003), Công nghệ Enzym, Nxb Khoa học Kỹ thuật 13 Nguyễn Văn Uyển, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập (1995), Tập (1996), Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 14 Đào Thanh Vân, Ngơ Xn Bình (2003), Giáo trình ăn (Giáo trình Sau đại học), Nxb Nông nghiệp 15 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi - Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống, Nxb Nông nghiệp 35 II Tài liệu tiếng Anh 16 Mohd Anwar Ahmad, Rashmi Gaur (2012) “Comparative biochemical and RAPD analysis in two varieties of rice (Oryza sativa) under arsenic stress by using various biomarkers”, Journal of Hazardous Materials, Volumes 217218, Pages 141-148 17 Sadaf Altaf, Muhammad M K (2014), “Morphogenetic characterization of seeded and seedless varieties of Kinnow Mandarin (Citrus reticulata Blanco)”, Australian Jounal of Crop Science (AJCS, (11): 1542-1549 18 Goh Pik Seah ELCY , Mansor Clyde MAHANI, Yong-Jin PARK, Normah Mohd NOOR (2011), “Simple Sequence Repeat (SSR) profiling of ultivated Limau Madu (Citrus reticulata Blanco) in Malaysia”, Biotechnol Fac Sci Technol., Univ.Kebangsaan Malaysia, 43600UKM Bangi, Selangor, Malaysia, Fruits, 67-74 DOI:10.1051/fruits/2011070 19 Kinley Dorji, Chinawat Yapwattanaphun (2015), “Assessment of the genetic variability amongst mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions in Bhutan using AFLP marker”, BMC Genetics, 16:39 DOI 0.1186/s12863015-0198-8 20 Behrouz Golein, M Nazeryan, B Babakhani (2012), “Assessing genetic variability in male sterile and low fertile citrus cultivars utilizing simple sequence repeat markers (SSRs)”, African Journal of Biotechnology, 11(7), 1632-1638 21 Nicholas Smirnoff, Glen L.Wheeler (2000), “Ascorbic Acid in Plants Biosynthesis and Functio”, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology UK, 291-314 22 Xiao-Yan Yang Jin-Xia Xie, Fang-Fang Wang, Jing Zhong, Yong-Zhong Liu, Shu-Ang Peng (2011), “Comparison of ascorbate metabolism in fruits of 36 two citrus species with obvious difference in ascorbate content in pulp”, Journal of Plant Physiology, 168 (02) 2196-2205 23 Junjie Tao, Han Wu, Zhangyun Li, Chunhui Huang and Xiaobiao Xu (2018) “Molecular Evolution of GDP-D-Mannose Epimerase (GME), a Key Gene in Plant Ascorbic Acid Biosynthesis”, Front Plant Sci DOI: [10.3389/fpls.2018.01293] 24.Gilbert L, Alhagdow M, Nunes-Nesi A, Quemener B, Guillon F, Bouchet B, Faurobert M, Gouble B, Page D, Garcia V, Petit J, Stevens R, Causse M, Fernie AR, Lahaye M, Rothan C, Baldet P.(2009) “GDP-Dmannose 3,5-epimerase (GME) plays a key role at the intersection of ascorbate and non-cellulosic cell-wall biosynthesis in tomato”,Plant J, 60(3):499-508, DOI: 10.1111/j.1365-313X.2009.03972 III Trang web tham khảo 25 https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C 26.http://khoahoc.tv/tim-ra-bi-an-cua-co-che-tong-hop-vitamin-c-o-thuc-vat15341 27.http://thegioicaygiong.vn/san-pham/giong-cay-quyt-ngot.html/ 28.http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thucpham/239-vitamin-c.html 29 http://suckhoedoisong.vn/vo-quyt-vi-thuoc-da-nang-n115235.html 37 ...ĐẠI H C THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI H C SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ C Y QUÝT MIỀN NÚI PHÍA B C VIỆT NAM Ngành:... tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C mẫu quýt khu vư c miền núi phía B c Việt Nam Nội dung nghiên c u 3.1 Khuếch đại, tách dòng x c định trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C mẫu... trên, lựa chọn đề tài: Phân lập gen mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ quýt miền núi phía B c Việt Nam. ” M c tiêu nghiên c u Đánh giá đ c điểm trình