XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ ACID AMIN ĐẠM FORMOL AMONIAC TRONG THỰC PHẨM

I. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ TRONG THỰC PHẨM 2 1. Ý nghĩa của chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2. Các phương pháp phân tích chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2.1. Phương pháp Kjeldahl 3 2.2. Phương pháp Dumas 6 II. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG THỰC PHẨM 11 1.Ý nghĩa của chi tiêu acid amin 11 2. Các phương pháp định lượng acid amin 11 2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng HPLC 11 2.2. Phương pháp quang phổ 17 2.3 Phương pháp sử dụng phản ứng Ninhidrin 18 III. Xác đinh hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 1.Ý nghĩa của việc phân tích chỉ tiêu đạm formol trong thực phẩm 19 2. Các phương pháp xác định hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 2.1. Phương pháp Sorensen 19 2.2. Phương pháp hỗn hợp chỉ thị: sử dụng Phenolphathalein và Bromthymol blue 21 I. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ TRONG THỰC PHẨM 2 1. Ý nghĩa của chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2. Các phương pháp phân tích chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2.1. Phương pháp Kjeldahl 3 2.2. Phương pháp Dumas 6 II. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG THỰC PHẨM 11 1.Ý nghĩa của chi tiêu acid amin 11 2. Các phương pháp định lượng acid amin 11 2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng HPLC 11 2.2. Phương pháp quang phổ 17 2.3 Phương pháp sử dụng phản ứng Ninhidrin 18 III. Xác đinh hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 1.Ý nghĩa của việc phân tích chỉ tiêu đạm formol trong thực phẩm 19 2. Các phương pháp xác định hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 2.1. Phương pháp Sorensen 19 2.2. Phương pháp hỗn hợp chỉ thị: sử dụng Phenolphathalein và Bromthymol blue 21 I. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ TRONG THỰC PHẨM 2 1. Ý nghĩa của chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2. Các phương pháp phân tích chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm 2 2.1. Phương pháp Kjeldahl 3 2.2. Phương pháp Dumas 6 II. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG THỰC PHẨM 11 1.Ý nghĩa của chi tiêu acid amin 11 2. Các phương pháp định lượng acid amin 11 2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng HPLC 11 2.2. Phương pháp quang phổ 17 2.3 Phương pháp sử dụng phản ứng Ninhidrin 18 III. Xác đinh hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 1.Ý nghĩa của việc phân tích chỉ tiêu đạm formol trong thực phẩm 19 2. Các phương pháp xác định hàm lượng đạm formol trong thực phẩm 19 2.1. Phương pháp Sorensen 19 2.2. Phương pháp hỗn hợp chỉ thị: sử dụng Phenolphathalein và Bromthymol blue 21

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TIỂU LUẬN MƠN: PHÂN TÍCH HĨA LÝ THỰC PHẨM Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ - ACID AMIN - ĐẠM FORMOL - AMONIAC TRONG THỰC PHẨM GVHD: Nguyễn Thị Hải Hòa Nhóm thực hiện: 09 1.Nguyễn Thị Hà 2022150022 Phạm Thị Hoài Xinh 2022150117 Trương Thị Tường Quyên 2022150192 Tp HCM, ngày tháng 11, năm 2017 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Protein tạo thành chủ yếu từ amino acid qua lien kết peptide Cho đến ta thu nhiều loại protein dạng tinh khiết, kết tinh xác định thành phần nguyên tố hóa học, gồm ngun tố C, H, O, N với tỉ lệ C: 50 – 55%; H: 6,5 – 7,3%; O: 21 – 24%; N: 15 – 18% lượng nhỏ S: – 0,24% Ngoài ra, chứa lượng nhỏ nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca,… Trong thực phẩm protein tồn nhiều dạng khác đạm hữu (acid amine, peptide, polypeptide, acid nucleic,…); đạm vô ( amoniac, muối amoni, muối nitrate, nitrit, ) Chúng tồn thực phẩm với hàm lượng định đến giá trị dinh dưỡng an toàn cho thực phẩm Để xác định chúng, có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng mục đích phân tích mà lựa chọn phương pháp phù hợp Bài tiểu luận sau nêu phương pháp cách sử dụng chúng I XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ TRONG THỰC PHẨM Ý nghĩa tiêu protide thô thực phẩm Về phương diện hóa học, protide thơ chất hữu mà thành phần cấu tạo gồm: C, H, O, N có thêm P S Protide bao gồm acid amine (amino acid) hợp chất (peptit, protein) thủy phân cho nhiều loại acid amine Peptide số giới hạn acid amine kết hợp với liên kết peptit (-CO-NH-) (nhóm chức acid acid amine kết hợp với nhóm chức amine acid amine kia) Protein tên gọi để chung protide, chia làm nhóm: holoprotein heterprotein Holoprotein thủy phân cho acid amine Heterprotein thủy phân ngồi acid amine có chất khơng phải protide (gọi chất phi protide) thí dụ như: lipide, acid nucleic,… Xác định hàm lượng protide xác định thành phần liên quan đến chất lượng dịnh dưỡng thực phẩm (xác định hàm lượng protide thô, xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng acid amine, xác định hàm lượng amoniac,…) Ở đây, với việc phân tích tiêu protide thơ thực phẩm, đặc biệt nước mắm, dùng để phân hạng nước mắm định đến giá thành sản phẩm lượng protide thơ bao gồm protein hợp chất chứa nitơ khác amoniac, acid nucleic,…hay gọi tổng lượng nitrogen Đây tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng thực phẩm, Nguyên tắc xác định: định lượng cách xác định lượng nitơ toàn phần kết nhân với 6,25 Điều có nghĩa protide thơ ln chứa 16%N Ở protide thô động vật, hàm lượng nitơ toàn phần thường cao 16% (16 – 17%), thực vật hàm lượng lại thấp 16% Hệ số 6,25 hệ số trung bình thơ Các phương pháp phân tích tiêu protide thơ thực phẩm Hiện nay, có phương pháp dùng phổ biến dùng để phân tích tổng nitrogen hay hàm lượng protide thô thực phẩm sữa, thức ăn chăn ni, phương pháp Dumas phương pháp Kjedahl Cả hai phương pháp quốc tế cơng nhận tiêu chuẩn hóa thành TCVN 2.1 Phương pháp Kjeldahl Phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng đạm hữu (acid amine, peptide, polypeptide, acid nucleic,…) amoni 2.1.1 Nguyên tắc Khi đốt nóng mẫu thực phẩm với H2SO đậm đặc, chất hữu bị oxyl hóa tạo thành SO2, CO2, H2O Còn nitơ sau giải phóng dạng NH kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch Protein, polypeptide, peptone H2SO4 đặc, t0 hợp chất chứa nitơ xúc tác (NH4)2SO4 + SO2 + CO2 + H2O Đẩy NH3 khỏi muối (NH4)2SO4 base mạnh (NaOH) (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3+2H2O + Na2SO4 Định lượng NH3 bay acid (phương pháp trực tiếp): 2NH3 + H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 4H3BO3 + 2NH4Cl Hoặc sử dụng H2SO4 0,1N dư, chuẩn độ lượng dư H 2SO4 dung dịch NaOH 0,1N (phương pháp gián tiếp): 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 2NaOH + H2SO4 dư Na2SO4 + 2H2O 2.1.2 Phạm vi áp dụng Áp dụng cho tất loại thực phẩm theo TCVN 8099-2:2009 2.1.3 Dụng cụ - hóa chất – thiết bị - Dụng cụ thủy tinh thơng thường phòng thí nghiệm Bình Kjedahl dung tích 500ml Bộ cất đạm Kjedahl Dung dịch H2SO4 đậm đặc Hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1: 10 Dung dịch H3BO3 4%; pH = 5,5; điều chỉnh pH NaOH 0,1N Dung dịch Hcl 0,1N Dung dịch NaOh 0,1N Dung dịch H2SO4 0,1N Dung dịch Phenolphthalein 1% Dung dịch Tashiro Alirazin natri sunfonat Giấy quỳ tím 2.1.4 Các bước tiến hành - Bước 1: Vơ hóa mẫu + Cân xác khoảng 2-4g mẫu V(ml) dung dịch mẫu cho vào bình Kjeldahl + + + + dung tích 500ml Chú ý khơng dính mẫu lên thành bình Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4=1;10 vào bình Rót từ từ theo thành bình 10-20ml H2SO4 đậm đặc Lấy nhẹ bình để acid trộn vào mẫu Đậy bình phễu thủy tinh cặp vào giá đỡ đặt nghiêng góc 45 bếp điện + Đung nóng tủ hút cho đếnkhi dung dịch suốt khơng màu có màu xanh Trong q trình đun lắc nhẹ, tráng khéo cho khơng vệt + + + + + + + đen mẫu chưa bị phân hủy sót lại thành bình Để nguội Chuyển tồn dung dịch vào cất đạm Vơ hóa mẫu phá mẫu nhiều ống: Cân xác khoảng 2-4g mẫu V(ml) dung dịch mẫu cho vào ống phá mẫu Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4=1:10 Rót từ từ theo thành bình 10ml H2SO4 đậm đặc Đặt ống vào phá mẫu Mở máy cài đặt nhiệt độ Tiến hành phá mẫu tủ hút thu dung dịch có màu xanh suốt - Bước 2: Tiến hành cất đạm + Lắp ráp cất đạm rửa cất đạm + Cho vào bình tam giác hứng 50ml H 3BO4 4% giọt thị Tashiro, dung dịch có màu xám bẩn + Nhúng đầu ống sinh hàn cất đạm ngập hẳn dung dịch bình tam giác hứng + Chuyển dung dịch vơ hóa vào bình cầu máy cất đạm, rửa bình Kjeldahl lần với nước cất chuyển tất nước rửa vào bình cầu Trung hòa NaOH 30% với Tashirolafm thị màu (hoặc với thị Alizarin natri sulfonate), sau cho thêm 5ml NaOH 30% + Mở nước vào ống simh hàn + Tiến hành cất kéo nước 15-30 phút + Nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi mặt dung dịch bình tam giác, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục cất thêm phút Kiểm tra nước chảy đầu ống sinh hàn không làm thay đổi màu giấy quỳ - Bước 3: Chuẩn độ + Lấy bình hứng chuẩn độ dung dịch dung dịch HCl 0,1N dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu tím Ghi thể tích dung dịch HCl 0,1N tiêu tốn Chú ý: Rửa cất đạm HCl 10% nhiều lần nước cất - Chỉ sử dụng loại thuốc thử loại tinh khiết phân tích Nước sử dụng phải nước cất khơng chứa amoni nước có độ tinh khiết tương đương - Đối với hàm lượng nitơ biết trước thấp, sử dụng nồng độ acid đậm đặc để thu độ xác cao - Trong q trình phân tích sinh khí SO2 độc 2.1.5 Tính tốn biểu thị kết Hàm lượng nitơ tồn phần tính theo cơng thức Đối với mẫu rắn Nitơ toàn phần (g/100g) = Đối với mẫu lỏng Nitơ tồn phần (g/l) = Trong đó: V: thể tích HCl 0.1N (ml) N: đương lượng dung dịch HCl Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lượng mẫu thử (g) Nếu chuẩn độ lượng NH3 sinh phương pháp gián tiếp trình bày Đối với mẫu rắn: Nitơ toàn phần (g/100g) = Đối với mẫu lỏng: Nitơ toàn phần (g/l) = Trong đó: V1: thể tích dung dịch NaOH 0.1N (ml) V2: thể tích dung H2SO4 0.1N (ml) N: đương lượng dung dịch H2SO4 0.1N Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lượng mẫu thử (g) F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0.1N Hàm lượng protide thô xác định cách lấy kết nitơ toàn phần nhân với hệ số 6.25 (hay hệ số tương đương trường hơp cụ thể) 2.2 Phương pháp Dumas Phương pháp Dumas xác định nitrogen tất dạng liên kết thực phẩm, hữu vô cơ, nitrate nitrite Được sử dụng lần cách 150 năm gọi “phương pháp đốt cháy” có tính xác cao đo mẫu nhanh Phương pháp thừa nhận tổ chức quốc tế như: AOAC, AACC, ASBC, ISO, OIV 2.2.1 Nguyên tắc Mẫu đốt cháy nhiệt độ cao, khoảng 900 0C tạo thành oxide, hợp chất bị đốt cháy bao gồm muối nitrate nitrite để tạo thành N-oxides N 2.Với có mặt Cu (đồng), oxide nitrogen khử thành nitrogen.Trong đó, CO 2; H2O vài oxide khác tách loại bỏ hoàn toàn cách bẫy hấp thụ hấp phụ Khí nitrogen sinh đo đầu dò dẫn nhiệt (thermal conductivity detector – TCD) Một máy tính kết nối với máy Dumas phần mềm điều khiển tính nồng độ nitrogen có mẫu từ tín hiệu đầu dò TCD khí nitrogen từ khối lượng mẫu Hàm lượng protide thơ tính cách nhân hàm lượng nitrogen với hệ số chuyển đổi thích hợp, thực phẩm nói chung 6,25 Protide thơ [%] = 6,25× N [%] 2.2.2 Phạm vi áp dụng: loại hạt có dầu thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8133 – 1:2009 2.2.3 Dung cụ - Hóa chất – Thiết bị - Khí mang: CO2; He; O2 99,99% thể tích - Chất hấp phụ sulfua dioxide halogen, dùng để loại sulfua khỏi mẫu Ví dụ, chì cromat PbCrO4 búi thép - Chất xúc tác Platin đồng oxide (vật liệu nhồi cho ống sau đốt) Chất xúc tác Platin 5% Pt alumin Al2O3 pha trộn với CuO với tỷ lệ 1:7 1:8 theo dẫn nhà sản xuất - Bông bạc đồng: cần tách rời trước nạp vào ống sau đốt ống khử - Bông thạch anh thủy tinh - Đồng (dây, đoạn cắt, vụn bột) volfram dùng cho ống khử làm tăng độ chụm kết phân tích mẫu chứa hàm lượng nitơ thấp (khoảng 1% khối lượng) - Diphospho pentoxide magiesium peclorat hạt Mg(ClO 4)2 chất mang khác thích hợp để nhồi ống làm khơ - Các hạt khống oxide nhơm hình cầu rỗng dùng cho ống đốt - CuO làm vật liệu nhồi cho ống đốt - NaOH, chất hỗ trợ - Acid aspartic C4H7NO4 acid atylen diamin tetraacetid C 10H16N2O8 haợc acid glutamic C5H9NO4 acid hippuric chuẩn C9H9NO3 mẫu chuẩn thích hợp khác biết trước có hàm lượng nitơ khơng để xác nhận - Dầu nhẹ, có điểm sơi khỏang 30oC đến 60oC aceton ethanol - Cân phân tích, gân xác đến 0,0001g - Máy nghiền phòng thử nghiệm, thích hợp với chất mẫu - Sàng thử nghịem, có lỗ 800mm 1mm làm vật liệu không chứa sắt - Chén nung (thép không gỉ, thạch anh, gốm platin) ống thiếc, giấy lọc khơng chứa nitơ, thích hợp để sử dụng cho thiết bị Dumas - Thiết bị Dumas có lò nung trì nhiệt độ lớn 850 oC, detector dẫn nhiệt có thiết bị thích hợp để phân tích tín hiệu * Tính tốn biểu thị kết Hàm lượng nitơ tổng số WN, biểu thị phần trăm khối lượng thơng thường có sẵn từ liệu in từ thiết bị Hàm lượng protide thô WP, biểu thị phần trăm khối lượng theo cơng thức sau: Wp = WN×F Trong đó, F hệ số chuyển đổi (bằng 5,7 lúa mì sản phẩm nghiền chúng, 6,25 sản phẩm khác) Hệ thống phân tích đạm Dumas 2.2.4 Cách tiến hành •Phần thử mẫu Cân 0,1g mẫu thử xác đến 0,0001g cho vào chén nung ống thép Đối với mẫu chứa hàm lượng protein thấp (17% •Kiểm sốt nhu cầu oxy Một vài loại thiết bị Dumas đòi hỏi ước tính nhu cầu oxy phần mẫu thử.Đối với số thiết bị có kiểm sốt tự động điều chỉnh lưu lượng oxy, đòi hỏi lượng oxy lại từ – 8% Thực phép thử trắng mơi trường khơng khí, lần sử dụng lượng sacaroza tương đương thay cho mẫu, với xác định protein nitơ để thay mẫu thử Mẫu trắng sacaroza cho biết lượng nitơ khơng khí đưa vào bị giữ lại vật liệu hữu nghiền bột Sử dụng giá trị trung bình lần thử trắng 10 Các phương pháp định lượng acid amin 2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 2.2.1.Nguyên tắc HPLC phương pháp sắc ký phát triển dựa phương pháp ghi sắc ký cột, chất phân tích qua cột sắc ký có lực khác với pha động (dung môi) pha tĩnh (các hạt nhồi cột) mà chúng khỏi cột với thời gian khác nhau,chất có lực với pha tĩnh lớn giữ cột lâu hơn, chất có lực nhỏ với pha tĩnh khỏi cột với pha động sớm Thay để dung mơi nhỏ giọt qua cột ghi sắc ký tác dụng trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để dịch chuyển xảy nhanh Phương pháp cho phép sử dụng hạt có kích thước nhỏ cột hấp phụ làm tăng bề mặt tiếp xúc pha tĩnh phân tử chất phân tích qua Điều tăng cường khả phân tích chất có hỗn hợp 2.1.2 Dụng cụ hóa chất • Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl phenol cho vào ml hcl • Bình khí nitơ • Chất tạo dẫn xuất Phenylisothiocyanate ( PITC) , • Triethylamine (TEA) • Ethanol loại dùng cho HPLC • Nước cất lần • Dụng cụ thiết bị hỗ trợ cho sắc ký 2.1.3 Các bước tiến hành  Chuẩn bị xong mẫu, cho dung môi pha động vào bình chứa pha động  Đưa mẫu vào thiết bị kim tiêm mẫu  Điều chỉnh thơng số cho máy sắc kí: nhiệt độ, vận tốc dòng, bước sóng đầu dò Khởi động máy tiến hành chạy sắc ký, sau xử lý số liệu tính tốn kết  2.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch acid amin chuẩn Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin chuẩn cho vào ống 14 nghiệm làm dẫn xuất dung dịch mẫu Chú ý Sấy khô mẫu tạo dẫn xuất để loại bỏ vết cuối PITC Cần chuấn bị tạo dẫn xuất lần phân tích Ở nhiệt độ phòng,các mẫu pha lỗng cho kết ổn định vòng 10 giờ.Còn mẫu chưa pha lỗng giữ 60 giờ,Vì khơng nên lưu trữ mẫu chưa pha lỗng.Những mẫu khơ để nhiều tuần tủ đông 2.1.2.2 Xử lý mẫu  Thủy phân protien, peptide Có nhiều cách thủy phân : axit, kiềm, enzim tùy vào loại thực phẩm thành phần protien Thứ tự thủy phân sau: - Đốt nóng lò 105 ÷ 112oC khoảng 20 -30 phút trước thủy phân - Cân mẫu làm giàu protein (tùy vào loại thực phẩm) - Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có phenol để ngăn cản halogel hóa tyrosin )  Tạo dẫn xuất Tăng độ nhạy q trình phân tích người ta thường tạo dẫn xuất acid amin, có axit amin phản ứng với tiền chất để mang lại khả hấp thụ mạnh tia UV/Vis tạo hợp chất huỳnh quang Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien như: - o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), carbamate 6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) Ứng với dẫn xuất chọn detector có bước sóng khác - Việc tạo dẫn xuất phải thực qua nhiều bước + Quy trình sấy khơ • • • Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khơ lại Cho vào bình định mức Tiến hành sấy khô hút chân không khô + Chuẩn bị dung dich dẫn xuất • Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ chất tùy vào phương pháp dn xut +To dn xut Rỳt 20àl hn hp dung dịch tạo dẫn xuất pha trên, cho vào ống mẫu sấy 15 • • • khô Lắc vài giây Để yên 20 phút nhiệt độ 20-25oC Sấy khô a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA OPA o-phthalaldehyde ortho-phthalaldehyde (OPA) hợp chất hóa học với cơng thức C6 H4 (CHO)2 Thường viết tắt OPA, phân tử dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl (CHO) gắn liền kề vòng benzene.Là chất rắn màu vàng nhạt dùng việc tổng hợp hợp chất dị vòng thuốc thử phân tích acid amin Ortho-phthalaldehyde (OPA) hòa tan ổn định dung dịch nước pH 2,0 pha lỗng mẫu (1/5 1/10) đường sáng truyền ngắn (2mm) đọc nằm khoảng 0,5 đến 1,5 19 Bước 4: Lặp lại bước bước sóng 260nm Bước 5: Tính tỉ số hấp thu 260nm/280nm Tỉ số nên nhỏ 0,6 Nếu lớn 0,6 protein khơng có lẫn tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic 2.2.3 Tính kết Nồng độ protein = độ hấp thu bước sóng 280nm/hệ số tắt 280nm Với hỗn hợp protein với loại protein mà hệ số tắt tính sau: Nồng độ protein = (1,55 × độ hấp thụ 280nm) – (0,77 × độ hấp thu 260nm) (mg/l) Có thể đốn lượng acid nucleic đưa vào (độ hấp thu bước sóng 280nm/độ hấp thu bước sóng 260nm) 2.2.4 Độ nhạy khả ứng dụng Đây phương pháp đơn giản để đo nồng độ protein dung dịch Phương pháp không dùng cho dung dịch có nồng độ protein (dưới 0,05 – 0,1 mg/ml) có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ vùng cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic số chất béo) protein dung dịch huyền phù) 2.3 Phương pháp sử dụng phản ứng Ninhidrin Đây phản ứng màu đặc trưng quan trọng để định tính định lượng axitamin Tất α-axit amin protein phản ứng với nidirin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng iminoaxit prolin tạo thành màu vàng.Phản ứng nhạy, phát đến microgram axitamin, dùng nhiều phân tích định tính định lượng axitamin (trong phương pháp sắc ký điện di).Cơ chế phản ứng phức tạp có nhiều chỗ chưa thống Có thể nêu số phản ứng sau: + Dưới tác dụng nindirin nhiệt độ cao, axitamin tạo thành NH 3, CO2 aldehit tương ứng có mạch cacbon ngắn axitamin cacbon; ninhidrin chuyển thành diextooxyhindriden 20 + Dixetooxyhindrinden NH3 tạo thành, tiếp tục phản ứng với phân tử ninhidrin khác tạo thành hợp chất màu xanh tím có cơng thức sau: Để định lượng axitamin dùng phương pháp so màu, đo cường độ màu phản ứng dùng phương pháp đo thể tích khí CO NH3 tạo thành Phương pháp so màu sử dụng nhiều Ngoài axitamin, peptit, protein, muối amon, amoniac, tạo màu với thuốc thử ninhidrin Vì muốn xác định xác axitamin, phải loại bỏ chất Để xác định aixtamin liên kết peptit protein phải thủy phân chất để tạo thành axitamin tự thực phản ứng với ninhidrin III XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM FORMOL TRONG THỰC PHẨM 1.Ý nghĩa việc phân tích tiêu đạm formol thực phẩm Protein đại phân tử có đơn phân acid amin, vốn thành phần vô quan trọng cho thể sinh vật Xác định hàm lượng đạm formol định lượng acid amine muối amoni có thực phẩm.Tuy nhiên, đa phần thực tế, lượng muối amoni nên nói xácđịnh nitơ formol ta hiểu xác định lượng acid amine mà Các phương pháp xác định hàm lượng đạm formol thực phẩm 2.1 Phương pháp Sorensen 2.1.1 Nguyên tắc Trong acid amine có nhóm –COOH (tính acid) –NH (tính bazơ), ta cho tác dụng với formol để nhóm –NH2 tạo thành nhóm –N=CH2 làm tính base Từ 21 ta chuẩn độ trung hòa NaOH chất thị Phản ứng xảy acid amine formol 2.1.2 Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị - Dụng cụ thủy tinh thơng thường phòng thí nghiệm - Formol trung tính - Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa - BaCl2 khan - Dung dịch Na2HPO4 Alirazin natri sunfonat - Giấy lọc 2.1.3 Cách tiến hành Xử lý mẫu: Cân xác P(g) chất thử xay nhuyễn (hoặc V ml dung dịch thử) cho vào bình định mức 100ml, với 50ml nước cất, lắc mạnh 10 phút để hòa tan Cho thêm 5ml dung dich PP, 2g BaCl2, giọt Ba(OH)2 đến dung dịch có màu hồng nhạt Sau thêm 5ml Ba(OH)2 để kết tủa muối phosphate carbonate Cho nước cất vừa đủ, lắc lọc Tiến hành Bước 1:Xác định lại nồng độ NaOH dung dịch chuẩn gốc H 2C2O4 0,1N với thị phenolphtalein Bước 2: Chuẩn độ Hút 20ml dung dịch xác định co vào bình tam giác 250ml Thêm 20ml dung dịch formol trung tính Chuẩn độ NaOH 0,2N màu đỏ tươi 2.1.4 Tính tốn biểu thị kết Đối với mẫu rắn: X(g/100g) = *100 Đối với mẫu lỏng: X(g/100g) = *100 Trong đó: 0,0028 số (g) nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,2N 22 n: số ml NaOH 0,2N sử dụng m, V: số g hay số ml mẫu thử 2.1.5 Lưu ý − Các muối amoni, thí dụ NH 4Cl dung dịch trung tính, gặp formol làm cho dung dịch trở thành acid nên ảnh hưởng đến kết phân tích − Đây trường hợp acid yếu chuẩn độ kiềm mạnh nên điểm tương đương pH kiềm (pH = – 9,5) phản ứng kết thúc PP chuyển màu đỏ tươi màu hồng (pH = 8,3 thơng thường) − Nếu chất thử có muối phosphate carbonate, muối làm cho dung dịch trở thành dung dịch đệm pH khó tăng đến – 9,5, làm ảnh hưởng đến kết quả, cần phải loại bỏ cách kết tủa với BaCl2 Ba(OH)2 − Điểm chuyển màu khó nhận khó xác định lúc chuyển sang màu đỏ tươi Do nên có dung dịch màu để so sánh Người ta dùng 100ml dung dịch Na 2HPO4 0,1N (pH = 9,3) trộn với 0,5ml PP 1% để có màu đỏ tươi làm mẫu so sánh màu điểm tương đương 2.2 Phương pháp hỗn hợp thị: sử dụng Phenolphathalein Bromthymol blue Xử lý mẫu Nếu sản phẩm đặc: nghiền nhuyễn, cân xác 3-5g (G) cho vào bình định mức 100ml (Vo), thêm 50ml nước cất, lắc mạnh cho tan hết, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều, để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc Nếu sản phẩm lỏng: dùng pipet lấy xác 10ml (Vm) cho vào bình định mức 100ml, cho nước cất đến vạch định mức Trung hòa mẫu Dùng pipet lấy 10ml chuẩn bị cho vào bình tam giác 250ml, thêm 15 giọt Bromthymol blue 0,04% Nếu dung dịch có màu vàng nhỏ thêm giọt NaOH đến xuất màu xanh Nếu dung dịch có màu xanh nhỏ giọt HCl 0,1N đến có màu vàng lấy lại màu xanh vài giọt NaOH 0,1N Chuẩn độ Cho tiếp giọt PP 0,1%, 5ml formol, chuẩn độ NaOH 0,05N đến màu dung dịch chuyển từ xanh sang tím Tính tốn biểu thị kết 23 Đối với mẫu rắn: X(g/100g) = *100 Đối với mẫu lỏng: X(g/100g) = *100 Trong đó: 0,0007 số (g) nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,05N n: số ml NaOH 0,2N sử dụng m, V: số g hay số ml mẫu thử IV XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMONIAC TRONG THỰC PHẨM 1.Ý nghĩa phân tích tiêu amoniac thực phẩm Trong nguyên liệu, thường chứa loại nitơ dạng vô (muối amonium hay amin dễ bay hơi) Đây dạng nitơ tạo thành phân hủy protein (bị lên men thối trình khử carboxyl aminoacid) Trong sản xuất nước mắm hàm lượng NH đạt 35% so với lượng nitơ tồn phần nước mắm đạt chất lượng.Vì vậy, việc xác định hàm lượng amoniac quan trọng đặc biệt thực phẩm Phương pháp xác định hàm lượng amoniac thực phẩm Xác định hàm lượng NH3 phương pháp cất kéo nước 2.1 Nguyên tắc Đẩy amoniac khỏi mẫu dung dịch kiềm chưng cất đạm Dùng nước kéo NH3 tự khỏi mẫu, cho hấp thu vào dung dịch H2SO4 dư định lượng dung dịch chuẩn NaOH 0,1N với thị Tahiro, dung dịch chuyển từ màu tím sang màu xanh (sử dụng kĩ thuật chuẩn độ ngược) Phương trình phản ứng: NH4+ + OH-NH3↑ + H2O 2NH + H2SO4(NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O 2.2 Phạm vi áp dụng Áp dụng cho tất loại thực phẩm 24 Tài liệu trích dẫn: TCVN 3706 – 90 2.3 Yêu càu kĩ thuật Dụng cụ, thiết bị Hóa chất Bộ chưng cất đạm Dung dịch NaOH 0,2N Dụng cụ thủy tinh thông thường Dung dịch NaOH 0,1N phòng thí nghiệm Dung dịch H2SO4 0,1N Giấy quỳ tím Dung dịch Tahiro alirazin sodium sunfonate 1% 2.4 Cách tiến hành Xử lý mẫu Chưng cất Chuẩn độ Xử lí mẫu: Cân khoảng 10g mẫu xay nhuyển vào cốc thủy tinh 100ml Pha loãng mẫu nước cất, chuyển vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch lọc qua giấy lọc Dung dịch lọc sử dụng cho bước 25 Chưng cất: Lắp cất đạm hình sau, khớp nối bôi môt lớp mỏng vaselin − Rửa cất đạm cách chưng cất đến dung dịch chảy đầu ống sinh hàn trung tính ( khơng làm đổi màu giấy quỳ tím) Sau đó, giảm áp đột ngột bình cầu (tắt điện, thêm nước trùm khăn lạnh vào bình cầu) để rút tồn dung dịch từ bình cất bình rửa xả bỏ − Bình hấp thu chứa sẵn 20ml dd H2SO4 0,1N, thêm giọt Tahiro đầu ống sinh hàn phải ngập dung dịch − Cho V (ml) dung dịch vào bình cất, tráng phễu nước cất hai lần để tránh mẫu, thêm giọt phenolphtalein thêm từ từ dung dịch NaOH 0,2N dung dịch chuyển sang màu hồng, tiếp tục thêm khoảng 5ml dung dịch NaOH 2N 26 Tráng rửa phễu, khóa phễu, giữ nước cất phễu − Chưng cất khoảng 15 – 30 phút, tiến hành thử xem NH hết chưa cách dùng quỳ tím hứng vài giọt dung dịch chảy ống sinh hàn (tráng rửa đầu ống sinh hàn trước kiểm tra), quỳ tím khơng đổi màu kết thúc q trình chưng cất Nếu quỳ tím chuyển sang màu xanh tiếp tục chưng cất quỳ tím khơng đổi màu − Rửa cất đạm sau kết thúc trình chưng cất Chuẩn độ: Lấy bình hấp thu ra, chuẩn độ dung dịch chuẩn NaOH 0,1N vói thị Tahiro đến có màu xanh Ghi thể tích dung dịch chuẩn tiêu tốn Tiến hành tương tự mẫu trắng (thay dunh dịch mẫu nước cất hai lần) 4.5 Tính kết Hàm lượng amoniac (X) tính phần trăm tính theo cơng thức: Trong đó: 0,0017: Lượng NH3 tương ứng với 1ml dd H2SO4 0,1N m: khối lượng mẫu lấy phân tích (g) V1: thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng (ml) V2: thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử (ml) F (=Vđm/Vxđ): hệ số pha lỗng 100: hệ số tính phần trăm Kết cuối trung bình cộng hai kết thử song song, tính xác đến 0,1% Sai lệch hai kết thử song song nhỏ 0,5% 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nhóm tác giả, Phân tích hóa lý thực phẩm 1, trường Đại học Cơng nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, 2016 Lê Ngọc Tú, Giáo trình Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học Kĩ thuật, 2010 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam, Các phương pháp định lượng prơtêin *Tài liệu Internet 1.http://learningall.net/hoa-phan-tich/kien-thuc-co-ban/phan-tich-nitrogen-sanhphuong-phap-dumas-va-phuong-phap-kjeldahl.html 28 ... phi protide) thí dụ như: lipide, acid nucleic,… Xác định hàm lượng protide xác định thành phần liên quan đến chất lượng dịnh dưỡng thực phẩm (xác định hàm lượng protide thô, xác định hàm lượng. .. vật Xác định hàm lượng đạm formol định lượng acid amine muối amoni có thực phẩm. Tuy nhiên, đa phần thực tế, lượng muối amoni nên nói xác ịnh nitơ formol ta hiểu xác định lượng acid amine mà Các... protein, xác định hàm lượng acid amine, xác định hàm lượng amoniac, …) Ở đây, với việc phân tích tiêu protide thô thực phẩm, đặc biệt nước mắm, dùng để phân hạng nước mắm định đến giá thành sản phẩm lượng