BÀI GIẢNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THỰC PHẨM

Do nhận thức ngày càngđược nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sựtăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng,yêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

(Dành cho hệ CĐNKN)

Biên soạn : Nguyễn Thúy Hương

Tp.HCM 09/ 2011

MỤC LỤC

Chương 1: Đối tượng vi sinh vật và các chỉ tiêu trong thực phẩm………….3 Chương 2: Kỹ thuật cơ bản trong phân tích vi sinh vật……… 17 Chương 3: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống 39 Chương 4: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại…… 85 Chương 5:Đánh giá vệ sinh công nghiệp……….95

Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủyhải sản, thực phẩm Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm

và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc

Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một

số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị Do nhận thức ngày càngđược nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sựtăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng,yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinhvật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạttiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩmđạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biếnthực phẩm nội địa quan tâm thực hiện Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thựcphẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụthực phẩm được thuyên giảm

Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặcnhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hoá học hoặcchứa các vi sinh vật gây bệnh Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi visinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu làcác triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễmbệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ănchứa các vi sinh vật gây bệnh Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm cònbao gồm trường hợp thức ăn có chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mức độ rấtthấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chếbiến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức

độ gây ngộ độc

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệuchứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhauphụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người Cáctriệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đaunhức người, sốt, đau đầu Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tuỳthuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vâtk tạo ra và tiếtvào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tếbào vi sinh vật (nội độc tố)

Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các

người khi bị đào thải khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bịnhiễm phân này Nước trở thành môi trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho ngườikhi sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách Nước là môi trường sống, môitrường nuôi trồng của các loài thuỷ sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh vật gâybệnh có thể nhiễm vào các loài thuỷ hải sản, làm nhiễm nguồn nguyên liệu của cácthực phẩm thuỷ hải sản chế biến Đó là một trong những con đường nhiễm vi sinh vậtgây bệnh vào thực phẩm Mặt khác, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, visinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặtthiết bi, công nhân Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh vật hiện diệnhoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn Tuy mật

độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rấtthấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của

vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật đượcnhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại Dovậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong

đa số các trường hợp là bằng không

1.2 TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở

TP HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm

Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.

 Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã

có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong Nguyênnhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất(24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định đượcnguyên nhân 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấymẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xétnghiệm

………

 Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộđộc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tửvong Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tửvong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 ngườinhập viện So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi việngiảm 186 người Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người Số vụ ngộ độc thựcphẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, sốngười đi viện giảm 174 người

Theo TS Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, CụcATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xácđịnh nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xáchơn Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực Mặc dùvậy, TS Hùng cho hay, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ

ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm Do đó,người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp

ăn của gia đình mình

Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 70%) thì tới năm 2010, ngộ độc vi sinh vật thấp đi (<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tới trên 60% Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn

từ 30 người trở lên Xu thế ngộ độc cho hóa chất càng ngày càng tăng lên, ngộ độc do

vi sinh vật có xu hướng kiểm soát tốt hơn nhưng không có nghĩa là nguy cơ giảm đi

So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi việngiảm 174 người

Năm 2010, số vụ ngộ độc do hóa chất là chủ yếu, chiếm trên 60%.

TS Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP - nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và

xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực Đặc biệt, thời gian vừa qua, không

có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn ra Đại lễ 1.000 năm Thăng Long –

đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008 Theo đó, nhận thức của người sản

thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm tăng từ38,3% lên 48,65%

Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng

đã bắt đầu có chiều hướng giảm Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảmgần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%

Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạtyêu cầu Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở

Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65%

(2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên 84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4% (2009) lên 79,4% (2010) Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện

Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những điểm sáng của công tác VSATTP

 Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010)

Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442 người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người So với cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321 người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%) Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với 1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong Nguyên nhân gây ngộ độc do vi sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)

1.3 ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT–TÁC NHÂN CHÍNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Các quá trình hư hỏng của thực phẩm thường do vi sinh vật gây nên Trong đórất nhiều trường hợp các vi sinh vật này còn tạo ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sứckhỏe con người Chính vì vậy việc tìm hiểu về các vi sinh vật gây bệnh để từ đó tìm racác biện pháp khống chế chúng là việc làm cần thiết

Có 2 dạng gây bệnh có nguồn gốc từ vi sinh vật:

- Vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của các độc tố này trong thực phẩm là

nguyên nhân gây bệnh Ví dụ: Clostridium botulinum tiết ra độc tố gây nên bệnh botulism (chứng ngộ độc thịt); Staphylococcus aureus gây nên bệnh tụ cầu khuẩn

- Vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người

Sự hiện diện của chúng hoặc của các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các

chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh Ví dụ: Salmonella spp., Vibrio

parahaemolyticus, Escherichia coli,…

Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả 2 dạng gây bệnh này Ví dụ

Clostridium perfringens và Bacillus cereus.

1.3.1.Tổng vi khuẩn hiếu khí:

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật chỉ sinh trưởng trong điều kiện có oxy.Tổng

số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oCtrong khoảng 3 ngày

Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như:

- Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count _ APC)

- Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count _ TPC)

- Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count _ TVC)

- Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count _ SPC)

1.3.2.Tổng nấm men, nấm mốc:

Nấm mốc là vi nấm có khả năng tạo sợi nấm, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn tyNấm men là những tế bào đơn tính sinh sản chủ yếu dạng vô tính theo kiểu nảychồi

Aspergillus

Aspergillus flavus và A parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các

loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tốmycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung làaflatoxin có khả năng gây ung thư Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7-

400C và tối ưu ở 24-280C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc,nông sản (gạo, lúa, đậu phộng, bắp…) Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố cóthể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người

Hình 9 Asperillus flavus (Chụp qua kính

hiển vi điện tử)

1.3.3 Salmonella

Nếu phân loại theo mức độ gây bệnh của Salmonella ta cĩ các loại sau:

- Loại chỉ gây bệnh cho người (vd: S typhi gây sốt thương hàn tại người)

- Loại chỉ gây bệnh cho động vật (vd: S typhimurium gây sốt thương hàn tại

chuột)

- Loại gây bệnh cho cả người và động vật (chiếm đa số)

Salmonella là trực khuẩn gram (-), khơng tạo bào tử, cĩ tiên mao (trừ S gallinarum), cĩ kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 m Giống như nhiều lồi vi

khuẩn khác Salmonella cĩ khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ

6 đến 45.60C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C Salmonella phát triển trong

khoảng pH từ 4.1 – 9.0 Trong các mĩn salad cĩ độ pH khoảng 5.5 – 5.7 khơng nhận

dạng được sự thay đổi mùi vị khi Salmonella phát triển Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của Salmonella là 0.93 – 0.95.

Hình 1 Salmonella typhy

(Chụp qua kính hiển viđiện tử)

Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động

vật; từ người bệnh Trong đĩ phải kể đến tác động của động vật lơng vũ, trứng của

chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn Ngồi ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella

lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm khơng được bảo quản kỹ

Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phịng sự nhiễm Salmonella nếu khơng thực

hiện đúng quy trình an tồn thực phẩm

Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ĩi mửa, buồn nơn.Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứngđược biểu hiện là 12-36 giờ Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2-7 ngày

1.3.4 Coliforms

Đây là những vi sinh vật hình que, G-, khơng tạo bào tử, cĩ khả năng lên menlatose và sinh khí trong quá trình lên men này Phát triển trong khoảng nhiệt độ (từ – 2đến 50oC), pH từ 4,0 đến 8.5, cĩ thể sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý Sau 12 – 16 giờ

trên mơi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc cĩ thể nhìn thấy được Coliform đi vào

thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm cĩ nhiễm phân Các lồi tiêu biểu cho

Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes Tuy nhiên, ngồi ra cịn cĩ

khoảng 20 lồi mang những tính chất đặc trưng cho Coliform, trong đĩ bao gồm cả các

Enterobacteriaceae khác và các lồi thuộc Aeromonas.

Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường

có nhiệt độ từ 44.5 – 450C (các Coliform khác có t0

opt=370C) Đây cũng là đặc điểm

nhận biết và phân biệt Colifom phân Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform.

Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của

Coliform:

- Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, cácchất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,

- Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết

- Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 460C

- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường

- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu

Escherichia coli:

Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700 E coli thuộc họ

Enterobacteriaceae Các loài E coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô

nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường Các.Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vàothực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến

Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit Gây nhầynhớt, hư hỏng thực phẩm

Khả năng gây bệnh của E coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ

thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy

sử dụng là acid amin Trong tự nhiên Staphylococcus được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các động vật máu nóng Staphylococcus sinh một số độc tố đường ruột

enterotoxin bền nhiệt và không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút Khi ăn phải thựcphẩm có chứa độc tó này, sau 4-6 giờ người ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn

mửa kéo dài 6-8 giờ Ngoài ra Staphylococcus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết

tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận,viêm tủy xương ở người Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kemtổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm visinh vật này Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trìnhchế biến

Hình 3 Staphylococus aureus (Chụp

qua kính hiển vi điện tử)

Staphylococcus aureus

Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột

Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả

năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit Chính vì

vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong

môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường) Chúng lên men và phân giảiđường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm

Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị

viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ

da người tiếp xúc với người bệnh Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn

đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa Riêng không khí không phải là nguồn gây

nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci.

Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt,

cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream Nếu

không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh.

Vibrio là phẩy khuẩn Phần lớn thuộc gram (-) Di động nhanh nhờ đơn mao ởđầu Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính Thuộc loài hiếu khí tùy tiện.

Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3%

NaCl Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối đến 7.0% Nhiệt độ pháttriển tối ưu là 35 – 370C, tuy nhiên vẫn phát triển được ở khoảng nhiệt độ từ 10 – 440C

Khoảng pH mà Vibrio có thể phát triển từ 5.0 – 11.0 Vibrio cholerae tạo ra độc tố tả

cholerae-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5g gây nhiễm qua đường miệng có thể gâytiêu chảy cho người trưởng thành Ngoài độc tố này, loài này còn tiết độc tố hemolysin

có độc tính tương tự tetrodotoxin của các nóc

Thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển Nguồn thực phẩm cónguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sản phẩm sữa,các loại thuỷ hải sản tươi sống Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động của nhiệt độ Nói

một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sự tác động của Vibrio.

Hình 4 Vibrio cholerae (Chụp qua

kính hiển vi điện tử)

1.3.7 Shigella

Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gây bệnh lỵ trực trùng Chỉ

gây bệnh cho người và linh trưởng Sinh độc tố enterotoxin Là trực khuẩn gram(-),không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện Phát triển trong khoảng nhiệt độ từ

10 – 40oC, t0

opt = 370C, pH = 6 – 8, nồng độ muối 5 – 6% Nhạy cảm với nhiệt

Hình 5 Shigella sonnei (Chụp qua

kính hiển vi điện tử)

Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích

lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu đường và acid amin ở ruột non Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử

vong Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột

già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng

dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu Liều lượng gây ngộ độc

thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm Không

được phép hiện diện trong 25g thực phẩm

Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người.Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quátrình sản xuất, chế biến thực phẩm

1.3.8 Yersinia

Hiện nay tìm thấy 11 loài Là trực khuẩn gram(-) Trong một số trường hợp cókhả năng chuyển động Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nhabào Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32oC Bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 1 – 3

phút Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica phát triển

trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm,

cua, gà, đậu phụ,… Y enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại

người Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng củabệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành.Nếu để lâu sẽ dẫn đến chảy máu dạ dày

Hình 6 Yersinia pestis (Chụp qua

kính hiển vi điện tử)

1.3.9 Clostridium

Hiện nay phát hiện ra hai chủng gây ngộ độc thực phẩm:

- Clostridium botulinum: tạo độc tố gây hại đến hệ thần kinh

- Clostridium perfringens: gây đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều khí Khi

vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra độc tố ruột, gây ngộ độc cho người

Clostridium botulinum là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí, tạo bào

tử Bào tử rất chịu nhiệt Nhiệt độ phát triển tối ưu là : 43 – 47oC, pH từ 5 – 9, bị ức chếbởi NaCl 5%, hoặc NaNO3 2,5%

C.botulinum là vi khuẩn sinh độc tố Tế bào C.botulinum bị tiêu ở nhiệt độ 800Cđến 900C Trong đa số trường hợp C.botulinum sinh gas và tạo mùi khó chịu Từ đặc điểm này ta có thể loại bỏ thực phẩm nhiễm C.botulinum một cách dễ dàng Tuy nhiên

cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bằng cảm

quan về sự nhiễm vi khuẩn C.botulinum của thực phẩm, do đó người sử dụng sẽ bị

nhiễm độc tố gây hội chứng botulism (ngộ độc thịt)

Sự ngộ độc thịt xảy ra không thường xuyên, nhưng nó thường gây tử vong Theo

sự phát triển của khoa học, tỷ lệ tử vong do botulism ngày càng giảm Ví dụ vào nhữngnăm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ này chiếm trên 60%tại Mỹ Theo như thống kê của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh tại Mỹ, thì các sản

phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất trong

Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố Tuy nhiên nó

để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi Chính vì vậy việc xác địnhbệnh là rất khó khăn Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho ngườibệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng cácchất lỏng trong cơ thể,

Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau:

- Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng

- Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó

- Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu

- Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quảntốt và không được hâm nóng

- Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút

- Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau:

- Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch

- Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 820C trong 30 phút

- Làm lạnh nhanh sau khi đóng gói và bảo quản lạnh

- Tất cả các bao bì sử dụng phải là loại được bộ Y tế cho phép và chịu lạnh tốt

1.3.10 Bacillus cereus

B cereus là trực khuẩn G(+), sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong

khoảng nhiệt độ từ 5-500C, tối ưu ở 35-400C Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi,các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…)

Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B cereus khi thực phẩm

được chuẩn bị mà không được giữ lạnh vài giờ trước khi sử dụng Triệu chứng ngộ độcphổ biến là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 14-16 giờ sau khi ăn thực phẩm bịnhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ

Hình 8 Bacillus cereus (Chụp qua

kính hiển vi điện tử)

1.3.11 Feacal streptococcus (Streptococcus phân)

Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực

phẩm Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, hình cầu hay

hình oval kéo dài, Gram dương, thường tụ tập thành hình đôi hay hình chuỗi, không di

động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy Hầu hết các loài này sống hiếukhí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trìnhtăng trưởng

Các loài này có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH

ở 9,6 ở 450C

1.4 CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM

1.4.1 Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước

* Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất

Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩnquốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau:

- Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý,giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml

- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là10.000 MPN/100ml

* Nước uống

Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn) Tiêuchuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạngnước này như sau:

- Nước uống đóng chai

1 Coliform (MPN/100ml)

2 Coliform phân (MPN/100ml)

3 E coli (CFU/100ml)

4 Clostridium khử sulphat (CFU/100ml)

5 Streptococci phân (CFU/100ml)

00000

- Nước giải khát không cồn

Không đóng chai Đóng chai

1 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml)

103

102

0000

Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép

Không đóng chai Đóng chai

- Nước giải khát có cồn

Không đóng chai Đóng chai

1 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml)

102

0

102

00000

1.4.2 Chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y

Chương II

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

2.1.LẤY MẪU

2.1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU THỰC PHẨM

Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện cở mật độ thấp và không có sự phân bốđồng đều trong mẫu

Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩmthường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánhsáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …)được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trongquá trình chế biến Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện cóthể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật

Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm đều

có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổnthương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của visinh vật cần phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mongmuốn khác

2.1.2 PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU

Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan

và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong côngtác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thựcphẩm sau này Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quảnmẫu mặc dù được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rấtquan trọng trong quá trình thử nghiệm Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫntới những sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm

2.1.2.1 Nguyên tắc lấy mẫu

Việc lấy mẫu phải đảm bảo 02 điều kiện sau:

- Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng

- Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từkhi lấy mẫu đến khi phân tích

Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau:

- Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn cóthể sẵn dùng)

Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùngmột loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng mộtkích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình côngnghệ

- Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không vàkiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó

- Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm Mẫu kiểm của một lôhàng lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫubao gói rồi tối thiểu cần 100 g Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm cònnguyên mới được dùng để phân tích Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chếbiến, nước mắm ): 500ml…

- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp

Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng

- Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu

- Trên mẫu cần ghi:

 + Tên mẫu

 + Người lấy mẫu

 + Tên và địa chỉ nhà sản xuất

 + Số lượng mẫu lấy

 + Địa điểm, thời gian lấy mẫu

- Những mẫu chưa sử dụng ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khiphân tích Trường hợp mẫu không cần bảo quản đông thì có thể bảo quản ởnhiệt độ 0-4oC để tránh sự biến động về thành phần đặc tính của mẫu cũng như

vi sinh vật Nhìn chung, mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 24h.Để lâu hơn

có thể bị tăng hoặc giảm vi sinh vật

Bảng 2.1 Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích

Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên

2.1.2.2 Kế hoạch lấy mẫu

* Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M

- Số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M (c);

Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính

* Kế hoạch hai thuộc tính

- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP

- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và khôngchấp nhận được

- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m

và M thì chấp nhận lô sản phẩm Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >

m và M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm

* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu

Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trongthực phẩm Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thìthường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính

VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt tươi

55

30

30

Thu tại nhiều thời điểm và vị trí Đối với loại thực phẩm đã biết chỉ nhiễm bềmặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hoặc cắt látvới bề dày 2-3 mm để thu mẫu

Dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ vỡ)Chú ý nhiệt độ và thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm củathực phẩm)

Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng, biếndạng, bị hở các mối ghép hay không? Ghi lại các nhận xét trên Lau chùi bằng cồnphía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm Chú ý chỉ kiểm các hộp phồng khi có yêucầu

Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kíncủa bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm

2.1.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích

- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10 g (hoặc 25 g)mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó bỏ vào erlen 150 ml hoặc 200 ml đã cósẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng Lắc đều, để lắng cặn Hútphần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1

- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10-100 g mẫu (cảcái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền Cân 10 g đã nghiền nát cho vàoerlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, đểlắng cặn Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1

- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể húttrực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn Lắc kỹ Hút 10 mlmẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệtkhuẩn Ta có độ pha loãng 10-1

- Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE(Polyetylen), đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rãđông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18 h; hoặc 45oC

trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc bình chứa mẫu nếu có thể để tăng tốc độ giảiđông)

- Có thể dùng Stomacher để xử lý mẫu rắn

- Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước đệm photphat, nước muối sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần

2.2 KỸ THUẬT PHA LOÃNG

Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theobậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW Sau khi pha loãng dịch pha loãng

sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập visinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác địnhđược mật độ tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thựcphẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật

2.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

- Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡngcần thiết khác nhau Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu củatừng loại vi sinh vật.

- Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh,phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trườngcần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vilượng… cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lượng của đối tượng vi sinhvật quan tâm Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có

độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mụctiêu

- Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ Các hợp chất hữu

cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của

sự sống Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trìnhsinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trongcác cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố

vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phầndinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhómnguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơthể thực vật, động vật hoặc VSV

- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 –0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%

- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin,các acid béo, các thành phần của màng tế bào Nồng độ thích hợp của các gốckiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 g /ml Nồng độ thíchhợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 g/ml (1 g = 10-6 g )

Thành phần cơ bản chính màng xelluloza của tế bào vi khuẩn

Nguyên tố Dạng tồn tại cho vi sinh vật sử dụng Thành phần trung bình (%)

2.3.1 Phân loại môi trường

Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thànhphần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng

-  Theo bản chất

- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồngốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xácđịnh

- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết vớihàm lượng xác định

- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần củamôi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên

- - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp

- + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ

- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thịgiúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu Tác nhân phânbiệt trong môi trường phân biệt:

- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids

và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH Chỉ thị pH thườngdùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple

- + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H2S H2S được phát hiệnbằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo raFeS có màu đen.

- + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môitrường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn

- + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại nhưStaphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes

- - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặcvài đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở

để định danh chủng

- Chỉ thị màu môi trường

- Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích visinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa nhữngchất chỉ thị màu Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khácnhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môitrường có màu hoặc thay đổi màu Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổimàu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinhhoá Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau

Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích,môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thịmàu cho phù hợp

Bảng Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng

-2.3.2 Pha chế, chuẩn bị môi trường

Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trườngđông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH-MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môitrường ở các lần kiểm nghiệm khác nhau Việc pha chế môi trường nuôi cấy từcác môi trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan,chỉnh pH và hấp khử trùng Phương pháp pha chế môi trường này được thựchiện như sau:

- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn

- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần thiết.Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cầnphải gia nhiệt để làm tan môi trường

- Điều chỉnh pH môi trường Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N

- Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho cácdụng cụ chứa

- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực

- Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy

Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường:

- Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bịhỏng

- Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác

- Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn

- Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường,giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọnlọc bị mất, tạo thành các chất ức chế mới

- Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid

- Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ởphòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm)

2.4.KHỬ TRÙNG

2.4.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường nuôi cấy

Các tác nhân vật lý hay hóa học như nhiệt độ cao, một số dạng bức xạ hay hóa chấtchuyên dụng… có thể dùng để khử trùng vật dụng nuôi cấy

Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do khả năng làm hỏng hay biến tính các thànhphần quan trọng tham gia vào hoạt động sống của tế bào như protein và acid nucleic.

Có thể khử trùng dụng cụ bằng phương pháp nhiệt khô (sấy 170oC trong 2 giờ) haynhiệt ướt (đun ở 60oC trong 30 phút, 72oC trong 15 phút, hoặc 100oC trong 10 phút)

để diệt thể dinh dưỡng của vi sinh vật Cũng có thể khử trùng dụng cụ bằng hơi nướccao áp 121oC trong 15-30 phút để diệt cả các thể sinh dưỡng lẫn các bào tử-nếu có- củamọi vi sinh vật

Các bức xạ điện từ với bước sóng ngắn (như tia X hay tia gamma) có khả năng ion hóanhiều loại phân tử tạo nên những gốc tự do với hoạt tính hoạt hóa cực mạnh có thể pháhủy các thành phần cũng như cấu trúc quan trọng như acid nucleic, màng lipoprotein,các protein trong tế bào Tia tử ngoại tuy không có khả năng ion hóa nhưng lại là mộttác nhân diệt khuẩn mạnh do khả năng tác động lên acid nucleic tạo đột biến gây chết

tế bào Sóng viba (microwaves, dạng sóng điện từ có bước sóng từ khoảng 1-1000nm)cũng được dùng phổ biến nhờ khả năng sinh nhiệt do kích thích các phân tử bất đốixứng về điện tích dao động với tần số cao (trên 900 triệu lần/giây)

Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước giớihạn (< 0,75 µm), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật (trừmycoplasma có đường kính chỉ khoảng 0,2-0,3 µm và virus) Một số hóa chất nhưethylen oxyde, triethylglycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh… có thể kiểm soát sự tăngtrưởng của vi sinh vật thường được dùng để khủ trùng hoặc ức chế sự sống cũng nhưtăng trưởng của vi sinh vật

2.4.2.Khử trùng dụng cụ, môi trường sau nuôi cấy

Môi trường sau nuôi cấy vi sinh vật và các dụng cụ bị nhiễm cần được khử trùng, tiêuhủy hoặc làm sạch phù hợp Nói chung việc khử trùng bằng nhiệt đóng vai trò quantrọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau nuôi cấy Việc khử trùng bằnghóa chất thường chỉ được thực hiện với các dụng cụ có kích thước và cấu tạo nhỏ gọn(như pipet, lam kính…)hoặc trong vài trường hợp đặc biệt

Đối với các dụng cụ thủy tinh được dùng làm nhiều lần (như bình tam giác, ốngnghiệm…) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121oC trong 30 phút Vật liệu nuôi cấytrong các dụng cụ chứa dùng một lần (như plastic) cũng có thể khử trùng ở nhiệt độtương tự trong các bao plastic có điểm nóng chảy cao Sau khi vi sinh bị diệt có thểloại bỏ các đĩa Petri hoặc bao bì nhựa cùng các thứ bên trong

2.5.KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

2.5.1 KỸ thuật gieo cấy vi sinh vật

Mục đích của việc gieo cấy VSV để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt của visinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước, đất )cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của đối tượng VSVmục tiêu

Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước như sau:

- Ồng nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay của

tay phải dùng để mở và giữ nút bông Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông, khử

trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa

- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng

vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy

chạm vào thành và miệng ống nghiệm

- Đầu que cấy có dính VSV được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn

- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồiđưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ quecấy

- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại

- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá đểque cấy

- Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieocấy

Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống

nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái.

Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm thạch nghiêng

Thường sử dụng que cấy vòng Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môitrường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4 Sau khi lấy được sinhkhối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ốngnghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên

Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng

Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng Cácbước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau:

- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việcnhiễm khuẩn lúc gieo cấy

- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáyống nghiệm

Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy

thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ.

2.5.2.Phân lập vi sinh vật

VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV Việcphân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào rathành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc

Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuậtpha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thếtăng trưởng cho chủng quan tâm Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:

2.5.2.1.Kỹ thuật hộp ria (streak plate)

Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tếbào riêng rẽ nhau ra Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởngthành một khuẩn lạc riêng biệt Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từmột tế bào ban đầu

Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảotuyệt đối Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy Sau đây là môt số

kỹ thuật ria thường dùng:

Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak)

Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak)

Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch

Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

2.5.2.2 Kỹ thuật hộp trải : Môi trường được chuẩn bị trước trong các đĩa Pettri Yêucầu bề mặt môi trường phẳng, không ướt Nhỏ 0,1 hoặc 0,2 ml dịch mẫu đã được phaloãng vào chính giữa đĩa môi trường Dùng que trang vô trùng trải đều mẫu khắp bềmặt đĩa Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc

2.5.2.3.Kỹ thuật hộp đổ : Hút 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa.

Đổ 15-20 ml môi trường đã tiệt trùng, đã để nguội khoảng 45-50oC vào giữa đĩa Dùngtay xoay nhẹ sang trái và xoay nhẹ sang phải vài lần để dịch mẫu hòa để vào môitrường Để yên đĩa trên bề mặt phẳng cho đông Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽphát triển thành một khuẩn lạc

2.6.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

2.6.1 ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIÊP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT

ĐỘ QUANG (ĐỘ ĐỤC)

Tế bào vi sinh vật là một thực thể khi có trong môi trường sẽ làm cho môi trườngtrở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trongmôi trường Trong một giới hạn nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trongmôi trường tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường Do đó có thể định lượng vi sinhvật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm.Trong trường hợp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số

lượng vi sinh vật có trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp.Phương pháp tiến hành theo hai bước:

1 Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung dịch

thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1; 0,2;0,3; 0,4; 0,5

Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định lượng tế bào vi sinh vật có trong 1ml

ký hiệu N/ml

Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng Vẽ đồ thị biểu diễn log(N/ml) (trục tung) theo các giá trị OD đặt trên trục hoành Xác định khoảng tuyến tínhgiữa log (N/ml) với OD

2 Xác định lượng tế bào theo độ đục:

- Đo độ đục của huyền phù của tế bào vi sinh vật cần xác định

- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và

OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu Lưu ý N/ml = 10a với a=log(N/ml)

Hình 13 Máy đo độ đục

Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánhmức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng Trongtrường hợp không cần thiết giá trị tuyệt đối của tế bào vi sinh vật thì không cần phảixây dựng biểu đồ tuyến tính giữa mật độ vi sinh vật và giá trị OD

Phương pháp này cho kết quả nhanh, thường được dùng để theo dõi hoặc nghiêncứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặctrong sản xuất, tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật2.6.2.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾMKHUẨN LẠC

Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu.Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thíchhợp

Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ thuộc vào môitrường nuôi cấy.

Phương pháp này thực hiện như sau:pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạcxuất hiện trên một dĩa petri khoảng 25 – 250 Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức

250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm Mẫu có thể được cấy bằng kỹ thuật cấyria hay cấy trải

Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu Sao cho các tếbào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc Kết quả thu được là số trung bình của

2 – 3 đĩa petri với cùng điều kiện nuôi cấy Kết quả cũng thường được trình bày dướidạng CFU (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hìnhthành chung một khuẩn lạc

Hình 11 Khuẩn lạc vi khuẩn và dụng cụ đếm khuẩn lạcMặc dù có một số nhược điểm song đây vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định

số lượng tế bào vi sinh vật Phương pháp này có độ nhạy cao, nên thường được dùngtrong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm

Quy trình chi tiết của phương pháp đếm khuẩn lạc: mẫu được pha loãng theo dãynồng độ như sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5… Ví dụ: lấy 1ml mẫu, pha vào 9ml dungdịch, pha loãng trộn đều, rồi tiếp tục lấy 1ml của dung dịch 1 cho vào 9ml dung dịchpha loãng ta được dung dịch 2 với độ pha loãng là 10-2

Cứ tiếp tục, sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khitìm được độ pha loãng thích hợp, cho phương pháp đếm khuẩn lạc

Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu + 9 phần dung dịch pha loãng cho nên nếu là

Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri

Cách tính kết quả :

Ví dụ: kết quả số khuẩn lạc trung bình từ 2 đĩa petri thu được là 35, độ pha loãng

10-4, số lượng mẫu đưa vào đĩa petri là 0,1ml ta có: 35.10.10000 = 3500000 CFU/ml

Cách biểu diễn kết quả:

- Biểu diễn kết quả phù hợp phương pháp đang áp dụng

- Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa

- Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số

mũ thích hợp của 10)

Ví dụ:

- Kết quả 3500000 CFU/ml viết thành 3,5.106 CFU/ml

- Kết quả 3572000 CFU/ml viết thành 3,6 106 CFU/ml

- Kết quả 3532000 CFU/ml viết thành 3,5 106 CFU/ml

2.6.3.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẲNG PHƯƠNG PHÁP MPN(MOST PROBABLE NUMBER) (SỐ CÓ KHẢ NĂNG CAO NHẤT –SCKNCN)

Quy trình định lượng theo phương pháp này như sau:

Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cầnxác định với 3 mức nồng độ 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm Ủ ở nhiệt độvới thời gian thích hợp Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của visinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như:sinh hơi, đổi màu, đục…) ghinhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng Sử dụng các số liệunày và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạngMPN/100ml hay số MPN/gam

Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trongmỗi độ pha loãng

Bảng Bảng tra MPN cho loạt 3 ống

có trong mẫu nước trên màng lọc Việc xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào sốkhuẩn lạc đếm được Sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thật có thành phần dinhdưỡng thích hợp Theo nguyên lý một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật.

Màng lọc có kích thước 0,2 – 0,45 m được chế tạo từ các sợi thủy tinh hay sợipolypropylene

Ngoài màng lọc thông thường, ngày nay còn dùng màng lọc kỵ nước(Hydrophobic Grid Membrane) Các vạch chia ô làm bằng vật liệu ngăn cản sự mọclan của các khuẩn lạc Số vi sinh vật được tính theo số khuẩn lạc mọc trong các ô

- Từ số các ô vuông có khuẩn lạc suy ra mật độ vsv trong mẫu theo dạng số cóxác xuất lớn nhất (MPN): MPN = N ln(N/(N-x)); trong đó N là tổng số các ô vuông, x

là số ô có khuẩn lạc mọc

Hình 12 Bộ lọc vô trùng và màng lọc

2.6.5 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

Các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men tảo … Có thể địnhlượng trực tiếp trong buồng đếm hồng cầu qua kính hiển vi Quy trình đếm trực tiếpcho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật trong mẫu Tuy vậy phương phápnày có các nhược điểm sau:

- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

- Không phân biệt dược tế bào vi sinh vật, các hạt vật thể khác lẫn trong mẫu

- Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp

Có ba phương pháp đếm trực tiếp:

1 Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu là một dụng cụ bằng thuỷ tinh Diện tích buồng đếm là1mm2, chiều cao là 0,1mm Diện tích 1mm2 được chia làm 400 ô nhỏ và thể tích của

400 ô nhỏ sẽ bằng hoặc 25 ô vuông lớn, tương ứng thể tích của ô vuông lớn là1/250mm3

Trước khi quan sát cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu Pha loãng mẫusao cho trong mỗi ô vuông nhỏ có khoảng 5 – 10 vi sinh vật Muốn đạt được yêu cầutrên cần phải ước lượng số vi sinh vật trong mẫu, hay phải làm thử một vài lần để xácđịnh được công thức pha loãng tối ưu

Hình 10 Buồng đếm hồng cầu

Mẫu được pha loãng bằng dung dịch có thành phần:

Thành phần dung dịch pha loãng

- Laurylsulphate 0,1%

- Methyl blue 0,01%

Các dung dịch pha loãng sau khi chuẩn bị phải lọc qua trước khi sử dụng

Điều chỉnh kính ở độ phóng đại 400 lần rồi tiến hành đếm Đếm số lượng tế bàotrong 5 ô lớn nằm trên đường chéo của buồng đếm

Cách tính số vi sinh vật Gọi x1, x2, x3, x4, x5 là số lượng vi sinh vật trong từng ôlớn ta có :

5

5432

Ta biết thể tích của 1 ô lớn bằng 1/250 mm3

Do đó số lượng tế bào vi sinh vật co trong 1 ml mẫu sẽ là:

Số vi sinh vật (trong 1 ml mẫu) = X 250.1000 = X 250000

2 Đếm trực tiếp bằng đường đếm Breed

Buồng đếm Breed có diện tích 1cm2 được đánh dấu Dùng bơm tiêm cho chínhxác 0,01ml dung dịch mẩu dàn trên mặt buồng đếm Sấy khô bằng cách hơ nhẹ trênđèn cồn bằng methyl blue

Khi đếm phết một lớp dầu trên bề mặt cần đếm Số lượng vi sinh vật /ml đượctính theo công thức:

N/ml=4a.10 4 /d2

a: số lượng tế bào vi sinh vật trong vùng đếm

d: đường kính của vùng đếm

3 Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang

Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như:

- Acridin Cam (AODC)

- 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT)

- Fluoresecin isothio cyanate (FITC)

Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang

Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương phápđếm khuẩn lạc Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năngphát triển thành khuẩn lạc.

Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật cóthật trong mẫu

2.7 THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật

là một vấn đề rất quan trọng Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm

về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật.Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong bacách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động

Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quyước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% làdương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính

Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trongviệc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên cácchủng đối chứng Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinhhoá thường dùng được trình bày trong bảng sau:

Acinetobacter calcoaceticus

Aci lwoffi

78445886

1530815306

746410400

Clostridium histolyticum

Clos Perfringens

1940113124

5038237

Enterobacter aerogenes

Ent cloacae

1304810005

10006-

68411447119249

Proteus mirabilis

Pro rettgeri

109757475

-

6571-

Streptococcus agalactiae

Strep pneumoniae

Strep salivarius

1381363038681

8181-7073

Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vậtbao gồm như sau:

1 Thử nghiệm khả năng lên men

Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sửdụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lênmen Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môitrường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau Sản phẩm tạo thành từ quá trình sốngnày sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉthị màu được bổ sung vào môi trường

Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red

2 Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men

Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vậtbiến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp Phản ứng đượcxác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làmchuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau

Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH làbromothymol blue

3 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydratduy nhất của vi sinh vật Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muốiamoniu Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbonduy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue

4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duynhất Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium Thửnghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màubromothymol blue

7 Thử nghiệm coagulase

Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus Loài này có khả năng

tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đônghuyết tương

8 Thử nghiệm urease

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi

sinh vật, nhất là nhóm Proteus Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3

và CO2 làm tăng pH của môi trường

9 Thử nghiệm gelatinase

Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatinethành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật

10 Thử nghiệm khả năng sinh H2S

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưuhuỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase

11 Thử nghiệm khả năng sinh idol

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung giancủa quá trình oxy hoá thành indol Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phảnứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màuđỏ

12 Thử nghiệm KIA, TSI

Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môitrường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau(glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật

13 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitratthành nitrite và các sản phẩm khác Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng

với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức

chất màu hồng

14 Thử nghiệm oxidase

Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật.Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiệncủa enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương

15 Thử nghiệm ONPG

Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym -galactosidase tham gia vàoquá trình lên men lactose ở vi sinh vật Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o-nitrophenyl-D-galactopyranoside Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng

16 Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo

và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose Vi sinh vật lên menglucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môitrường Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làmđổi màu thuốc thử

17 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruộtEnterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thànhdiacetyl Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine củapepton tạo phức đỏ

18 Thử nghiệm CAMP

Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và -hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của -hemolysin gây phá vỡ hồng cầu

(tan huyết)

19 Thử nghiệm tính di động

Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật.Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng Kết quả được xác định dựa vàokích thước của vệt cấy vi sinh vật

Bộ KIT sinh hoá định danh vi sinh vật

Ngày nay, các thử nghiệm sinh hoá truyền thống để định danh vi sinh vật đã cóthể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy Ngoài ra, còn có các bộ KITcho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hoá theo một quy trình hai lựa chọn đểđịnh danh vi sinh vật Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưuđiểm là tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như mỗi bộKIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn

Hình 24 Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật

CHƯƠNG III

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

1 PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1.1.Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm Chỉ số nàyxác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từmột lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từmột tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thànhkhuẩn lạc (Colony Forming Unit _ CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm

1.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất

1.2.1.Dụng cụ và thiết bị

Bảng 1.1 Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 1

Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm

Ống đong (100 ml) Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Cân phân tích

Lò viba

1.2.2.Môi trường và hóa chất

Bảng 2.2 Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 1

1.3.Thực hành

1.3.1.Quy trình phân tích

Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 1.3.2.Các bước tiến hành

1 Định lượng mẫu:

Bước 1 Cân 10,0 g (hay 25 g) hay hút 10,0 ml (hay 25 ml) mẫu đưa vào cốc thuỷ

tinh vô trùng (nếu là mẫu rắn, phải dập mẫu)

2 Đồng nhất và pha loãng mẫu:

Bước 2 Đổ mẫu vào bình tam giác đã có 90 ml (hay 225 ml) SPW

Bước 3 Mẫu lỏng thì lắc đều, mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu

90 ml SPW + 10g ma� u

Hình 1.1 Kỹ thuật pha loãng

Bước 5 Dùng pipetman với đầu tip vô trùng (hay pipet 1ml vô trùng) hút 1ml

dịch mẫu 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch SPW để được độ pha

Định lượng mẫu

10 g hoặc 10 ml

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri