NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA MÀNG HẠT GẤC MOMORDICA COCHINCHINENSIS SPRENG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP DMPD, DPPH, FRAP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA MÀNG HẠT GẤC MOMORDICA COCHINCHINENSIS SPRENG BẰNG CÁC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA MÀNG

HẠT GẤC MOMORDICA COCHINCHINENSIS SPRENG BẰNG

CÁC PHƯƠNG PHÁP DMPD, DPPH, FRAP

Sinh viên thực hiện: BẠCH THỊ BÍCH NGÂN

Ngành : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 09/2010

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA MÀNG HẠT GẤC

MOMORDICA COCHINCHINENSIS SPRENG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

Giáo viên hướng dẫn:

Th.S Mai Huỳnh Cang

Tháng 09 năm 2010

LỜI CẢM TẠ

Kính gửi đến các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành vì đã tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức quí giá trong quá trình học tập, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện đề tài một cách tốt nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Mai Huỳnh Cang, giảng viên bộ môn Công nghệ Hóa Học, Đại học Nông Lâm Tp HCM đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất trong quá trình thực hiện đề tài và những hỗ trợ về nhà ở và sinh hoạt trong một tháng thực tập tại bộ môn TIPs, Đại học ULB (Vương Quốc Bỉ)

Tôi xin cảm ơn GS TS F Debaste, ban quản lí dự án WBI tại Bỉ và PGS.TS Trương Vĩnh, trưởng Bộ môn Công nghệ Hóa Học, Đại học Nông Lâm Tp HCM – trưởng ban quản lí dự án WBI tại Việt Nam đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành một tháng thực tập tại

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09/2010

Sinh viên thực hiện

Bạch Thị Bích Ngân

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của màng hạt gấc bằng các phương pháp DMPD, DPPH, FRAP” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ hóa học, Đại học Nông lâm TP.HCM, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010 và tại phòng thí nghiệm bộ môn TIPs, Université Libre de Bruxelles (Vương quốc Bỉ) từ 12/07/2010 đến 05/08/2010

Với mục đích khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên hàm lượng

carotenoid và hoạt tính chống oxi hóa của màng hạt gấc Momordica Cochinchinensis Spreng, nguồn nguyên liệu giàu lycopene và β-carotene ở Việt Nam, đề tài đạt được

những kết quả sau:

Hàm lượng carotenoid trong màng hạt gấc tươi là 8514,01 µg/g DW; màng hạt gấc sấy chân không ở 60oC giữ được hàm lượng carotenoid cao nhất 79,55%, tương đương với 6762,87 µg/g DW

Hoạt tính chống oxi hóa bị ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy Sấy chân không ở 60oC giữ được hoạt tính chống oxi hóa cao nhất Hoạt tính chống oxi hóa tổng của màng hạt gấc tươi xác định bằng ba phương pháp DMPD, DPPH, FRAP lần lượt là : 676,84 ; 226,84 ; 478, 617 μM TE/g DW Hoạt tính chống oxi hóa tổng của màng hạt gấc sấy chân không ở 60oC xác định bằng ba phương pháp lần lượt là : 218,154 ; 92,066 ; 78,537 μM TE/g DW Ba phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa đều có độ ổn định Bổ sung chất chống oxi hóa BHT ảnh hưởng không đáng kể đến khả năng chống oxi hóa của màng hạt gấc

Ngoài thử nghiệm trích ly carotenoid bằng hệ dung môi n-hexane : acetone (tỷ lệ thể tích 3 : 2), đề tài còn thử nghiệm trích ly carotenoid bằng acetone và enzyme

Gac (Momordica Cochinchinensis Spreng or Murica Cochinchinensis Spreng) fruit

is considered a highly nutritious fruit because it contains high level of carotenoids, especially lycopene and β-carotene Gac aril has been used for cooking, but fresh aril spoils easily Thus, drying is necessary so that preserve product for a long time In addition, carotenoids is very sensitive to heating damage Therefore, this research was to evaluate the antioxidant activities of fresh and semi-drying aril by three methods, such as DMPD, DPPH, FRAP

The results highlight a significantly different between the vacuum and air dried product The vacuum drying offer a significantly shorter drying time for the whole temperature range combined with a lower degradation of the carotenoid and total antioxidant activites

The carotenoids content in fresh and drying sample (vacuum dryer at 60oC) by

spectrophotometry method was 8514,01; 6762,87 µg/g DW, respectively Antioxidant

activities in fresh sample by three methods DMPD, DPPH, FRAP was 676,84 ; 226,84 ;

478, 617 μM TE/g DW and drying sample (vacuum dryer at 60oC) was 218,154 ; 92,066 ; 78,537 μM TE/g DW, respectively There was the reproducibility of three methods

Besides n-hexane: acetone (v/v 3:2), we also extracted carotenoids with acetone and enzymatic treatment to consider the yield of carotenoids in extraction

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH PHỤ LỤC xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

1.4 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Nguyên liệu 3

2.1.1 Đặc điểm thực vật của quả gấc 3

2.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học 4

2.2 Sơ lược về hợp chất carotenoid tự nhiên trong thực phẩm 8

2.2.1 Tính chất lý hóa của carotenoid 8

2.2.2 Lycopene 10

2.2.3 β-carotene 11

2.3 Sự oxy hóa, chất chống oxy hóa, cơ chế phản ứng chống oxi hóa 12

2.3.1 Sự oxi hóa 12

2.3.2 Chất chống oxy hóa 13

2.3.3 Cơ chế chống oxy hóa 14

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 15

2.4 Phương pháp trích ly và phương pháp xác định hàm lượng carotenoid 17

2.4.1 Phương pháp trích ly 17

2.4.2 Các phương pháp xác định hàm lượng carotenoid 18

2.5 Quá trình sấy và các kỹ thuật sấy 19

2.5.1 Định nghĩa quá trình sấy 19

2.5.2 Các phương pháp sấy 20

2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian sấy lên màu sắc, hàm lượng carotenoid, hoạt tính chống oxy hóa 21

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

3.1 Quy trình nghiên cứu 24

3.2 Nguyên liệu và hóa chất 26

3.2.1 Gấc 26

3.2.2 Hóa chất 26

3.3 Thiết bị 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 27

3.4.1 Xác định thành phần, đặc tính hóa lý của màng hạt gấc 27

3.4.2 Thử nghiệm trích ly bằng dung môi và enzyme 28

3.4.3 Xác định hàm lượng carotenoid bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử 30

3.4.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 30

3.5 Xử lý số liệu: 32

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Khảo sát đặc tính hóa lí nguyên liệu 33

4.1.1 Xác định độ ẩm trung bình 33

4.1.2 Xác định màu sắc, kích thước và phần trăm khối lượng các thành phần 33

4.1.3 Thành phần acid béo của màng hạt gấc 34

4.2 Thử nghiệm trích ly bằng dung môi và enzyme 35

4.2.1.Trích ly carotenoid bằng acetone và n-hexane: acetone 35

4.3 Xác định hàm lượng carotenoid bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử 37

4.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng ba phương pháp DMPD, DPPH, FRAP 41

4.4.1 Tính ổn định của từng phương pháp - ảnh hưởng của nhiệt độ và kiểu sấy lên độ ổn định của từng phương pháp 44

4.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa có bổ sung BHT 48

4.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid và hoạt tính chống oxi hóa 50

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

AD Air drying – sấy khay

ANOVA Analysis of variance

BHT Butylated hydroxytoluene

CIE Commission Internationale de l'Eclairage

DMPD N,N-Dimethyl-p-phenylenediamine

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

DW Dry weight – Khối lượng khô

FRAP Ferric Ion Reducing Antioxidant Power

FW Fresh weight – Khối lượng ướt

HAA Hydrophilic Antioxidant Activity – hoạt tính chống oxi hóa hydrophilic HTCO Hoạt tính chống oxi hóa

LAA Lipophilic Antioxidant Activity – hoạt tính chống oxi hóa lipophilic TCC Total Carotenoid Content – hàm lượng carotenoid tổng

TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity

VD Vacuum drying – sấy chân không

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2 1: Tên gọi quả gấc theo các ngôn ngữ khác 3

Bảng 2 2: Hàm lượng β-carotene và lycopene trong màng hạt gấc 5

Bảng 2 3: Thành phần dinh dưỡng của màng hạt gấc 7

Bảng 2 4 Một số kỹ thuật sấy thường dùng đối với thực phẩm 20

Bảng 3 1: Nhiệt độ cài đặt ở các phương pháp sấy 30

Bảng 4 1: Độ ẩm nguyên liệu theo cơ sở khô 33

Bảng 4 2: Thành phần phần trăm khối lượng và độ màu của nguyên liệu 34

Bảng 4 3: Thành phần acid béo trong màng hạt gấc 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cấu tạo quả gấc 4

Hình 2 2: Các loại quả giàu lycopene và β - carotene 6

Hình 2 3: Một số sản phẩm từ gấc trên thị trường 8

Hình 2 4: Công thức cấu tạo lycopene 10

Hình 2.5: Công thức cấu tạo β-carotene 11

Hình 2 6: Công thức phân tử DPPH 16

Hình 2.7: Công thức phân tử DMPD 17

Hình 2 8: Công thức phân tử TPTZ 17

Hình 2 9: Không gian màu CIE Lab 22

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 25

Hình 4 1: Hàm lượng carotenoid của màng hạt gấc trích ly bằng các loại dung môi khác nhau 36

Hình 4 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và kiểu sấy lên hàm lượng carotenoid 38

Hình 4 3: Sự tách pha trong bình chiết 41

Hình 4 4: HTCO của màng hạt gấc tươi bằng ba phương pháp (tính theo khối lượng khô và khối lượng ướt ) 42

Hình 4 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên hoạt tính chống oxi hóa lipophilic của màng hạt gấc 45

Hình 4 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên hoạt tính chống oxi hóa hydrophilic của màng hạt gấc 46

Hình 4 7: Ảnh hưởng của kiểu sấy lên HTCO lipophilic và HTCO hydrophilic khi không bổ sung BHT và bổ sung BHT khi trích ly bằng phương pháp DPPH 48

Hình 4 8: Ảnh hưởng của kiểu sấy lên HTCO lipophilic và HTCO hydrophilic khi không bổ sung BHT và bổ sung BHT khi trích ly bằng phương pháp FRAP 49

Hình 4 9: Đồ thị tương quan hồi quy giữa hàm lượng carotenoid tổng và hoạt tính chống

oxi hóa lipophilic theo phương pháp DMPD 50

Hình 4 10: Đồ thị tương quan hồi quy giữa hàm lượng carotenoid tổng và hoạt tính

chống oxi hóa lipophilic theo phương pháp DPPH 50

Hình 4 11: Đồ thị tương quan hồi quy tuyến tính giữa hàm lượng carotenoid tổng và hoạt

tính chống oxi hóa lipophilic theo phương pháp FRAP 51

DANH SÁCH PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đường chuẩn β-carotene 58

Phụ lục 2: Đường chuẩn Trolox của phương pháp DMPD 58

Phụ lục 3: Đường chuẩn Trolox của phương pháp DPPH 59

Phụ lục 4: Đường chuẩn Trolox của phương pháp FRAP 59

Phụ lục 5: ANOVA, LSD ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên hàm lượng carotenoid tổng 60

Phụ lục 6: Phân tích thống kê HTCO Lipophilic của màng hạt gấc tươi bằng 3 phương pháp DMPD, DPPH, FRAP 61

Phụ lục 7: Phân tích thống kê HTCO hydrophilic của màng hạt gấc tươi bằng 3 phương pháp DMPD, DPPH, FRAP 62

Phụ lục 8: ANOVA, LSD ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên LAA bằng DMPD 63

Phụ lục 9: ANOVA, LSD ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên LAA bằng DPPH 64

Phụ lục 10: Bảng ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên LAA bằng FRAP 66

Phụ lục 11: Bảng ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên HAA bằng DMPD 67

Phụ lục 12: Bảng ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên HAA bằng DPPH 69

Phụ lục 13: Bảng ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp sấy lên HAA bằng FRAP 70

Phụ lục 14: Bảng ANOVA và trắc nghiệm t sự thay đổi HTCO theo hàm lượng carotenoid tổng bằng phương pháp DMPD 72

Phụ lục 15: Bảng ANOVA và trắc nghiệm t sự thay đổi HTCO theo hàm lượng carotenoid tổng bằng phương pháp DPPH 72

Phụ lục 16: Bảng ANOVA và trắc nghiệm t sự thay đổi HTCO theo hàm lượng

carotenoid tổng bằng phương pháp FRAP 72

Ở Việt Nam, quả gấc (Momordica Cochinchinensis Spreng) được sử dụng để tạo

màu cho các món ăn Những nghiên cứu khoa học gần đây đã chỉ ra gấc có hàm lượng carotenoid cao, đặc biệt là lycopene và β-carotene Trên thị trường đã có một vài sản phẩm từ quả gấc như viên nang gấc, nước giải khát, dầu gấc Tuy nhiên, các nghiên cứu

về khả năng chống oxy hóa của loại quả này và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chống oxi hóa trong quá trình chế biến chưa được quan tâm nhiều Ngoài ra, mặc dù có nhiều phương pháp để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một chất như FRAP (ferric reducing antioxidant power); CUPRAC (cupric reducing antioxidant power); ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity); ABTS (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid), DMPD (N,N-dimethyl-p-phenylenediamine), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl),

Ưu và nhược điểm của các phương pháp vẫn còn đang thảo luận

Trong phạm vi của khóa luận, chúng tôi so sánh hiệu quả của các phương pháp DMPD, DPPH, FRAP để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của quả gấc Hơn nữa, gấc là loại quả cho trái theo mùa, do đó cần phải sấy sơ bộ để sử dụng vào thời điểm trái mùa Hơn nữa màng hạt gấc chứa một lượng nước khá lớn, sấy sơ bộ giúp nâng cao hiệu quả trích ly và sản xuất các sản phẩm giàu carotenoid từ màng hạt gấc Vì vậy, cần khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và phương pháp sấy lên hàm lượng carotenoid

Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ hóa học, trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Mai Huỳnh Cang, tôi xin thực hiện đề tài “ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA QUẢ GẤC

MOMORDECA COCHINCHINENSIS (LOUR.) SPRENG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

DMPD, DPPH, FRAP”

Đề tài sẽ nghiên cứu và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của carotenoid từ màng hạt gấc tươi và sấy sơ bộ bằng hệ dung môi n-hexan:acetone (3:2 theo thể tích) Những kết quả của đề tài hi vọng sẽ mang lại triển vọng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao giá trị sử dụng cuả quả gấc và phát triển các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hoá của các chất khác

1.2 Mục đích của đề tài

Tìm ra chế độ sấy và phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa phù hợp với màng hạt gấc

1.3 Nội dung của đề tài

Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng carotenoid trong màng hạt Gấc và hoạt tính chống oxy hoá của màng hạt gấc tươi và sấy sơ bộ ở các kiểu sấy khác nhau bằng ba phương pháp: DMPD, DPPH, FRAP

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đặc điểm thực vật của quả gấc

2.1.1.1 Phân loại, mô tả

Theo ″Từ điển thực vật thông dụng″, Gấc (tên khoa học là Momordeca cochinchinensis (Lour.) Spreng) thuộc họ Cucurbitaceae, giống Momordica, loài cochinchinensis.S. Loại thân dây leo, sống lâu năm, được một linh mục người Bồ Đào

Nha đặt tên là Muricia cochinchinensis Ông đã xuất bản cuốn Flora Cochinchinensis vào năm 1790 Sau đó, Sprengel kết luận rằng loài cây này thuộc họ Linnaean, giống Momordica và được đổi tên vào năm 1826, với nhiều tên gọi khác nhau theo bảng 2.1

Bảng 2 1: Tên gọi quả gấc theo các ngôn ngữ khác

Latin Momordica cochinchinensis

Spreng Muricia cochinchinensis Lour

Muricia mixta Roxb

Sweet gourd Cochinchin gourd

Nhật Kushika ,Mokubetsushi Hindi Hakur, Kakrol, Kakur

Thân cây leo cao nhờ tua cuốn ở nách lá Lá mọc so-le, phiến xẻ 3 – 5 thùy sâu Hoa mọc riêng lẻ ở nách lá Quả hình thuôn dài hoặc tròn, có nhiều gai, màu xanh, khi chín chuyển sang màu cam đến đỏ; hạt dẹt cứng, màu nâu hoặc đen [1], [2]

Theo hình 2.1 dưới đây, cấu trúc của quả gấc gồm các thành phần chính sau: vỏ quả màu

đỏ, có gai nhuyễn Lớp thịt quả dày khoảng 1 - 2 cm có màu vàng, chiếm khoảng 50% khối lượng quả gấc, giúp bảo vệ các múi gấc bên trong Múi gấc chiếm khoảng 30% khối lượng quả, bao gồm phần màng màu đỏ, bao lấy hạt ở bên trong, dày khoảng 1 – 3 mm, dùng để chế biến

Hình 2.1: Cấu tạo quả gấc

(1) Thịt quả ; (2) Các múi gấc; (3)Lõi; (4) Màng hạt; (5) Hạt 2.1.2.2 Thành phần carotenoid của quả gấc

Cho đến nay, ở Việt Nam có hơn 20 công trình nghiên cứu về quả gấc và lợi ích của chúng đối với sức khỏe Với kỹ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC), hợp chất carotenoid

(1)

(2)

(3)

(4) (5)

được phân tích chính xác và chi tiết hơn Aoki đã tìm ra 2 carotenoid chiếm ưu thế hơn có trong màng hạt là lycopene và β-carotene Nhóm nghiên cứu của Aoki cũng tìm thấy một lượng nhỏ lycopene (0,9 μg/g) và β-carotene (22,1 μg/g) trong phần thịt quả, zexanthin và β-crytoanthin có trong phần màng hạt và phần thịt quả [3] Sau đó, Ishida đưa ra kết quả quả gấc có hàm lượng carotenoid cao hơn nhưng chỉ phát hiện β-carotene ở dạng vết và không có lycopene trong thịt quả [4] Vuong và ctv đánh giá lại carotenoid trong quả gấc

và nhóm nghiên cứu của Vuong tìm ra một lượng đáng kể α-tocopherol trong màng hạt (76 μg/g) [5] Bảng 2.2 so sánh hàm lượng lycopene và β-carotene của các tác giả

Bảng 2 2: Hàm lượng β-carotene và lycopene trong màng hạt gấc

Nguồn β-carotene

(μg/g FW)

Lycopene (μg/g FW)

Carotenoids tổng (μg/g FW) Thịt quả Màng hạt Thịt quả Màng hạt Thịt quả Màng hạt Aoki (2002) [3] 22,1 ± 15,2 101 ± 38 0,9 ± 0,7 380 ± 71 23,0 ± 17,3 481 ± 89

0 5000

Hình 2 2: Các loại quả giàu lycopene và β - carotene [6]

So với các loại trái cây giàu β-carotene như khoai lang và cà rốt (hình 2.2), gấc có hàm lượng β-carotene tương đương, nhưng hàm lượng lycopene cao hơn dưa hấu và ổi từ 8 đến 10 lần [6] Do đó, trong khoảng 10 năm gần đây, các nhà nghiên cứu đánh giá gấc là nguồn carotenoid tiềm năng và hiệu quả lên sức khỏe

2.1.2.3 Các thành phần dinh dưỡng khác

Ngoài carotenoid, màng hạt gấc còn chứa một lượng acid béo đáng kể Màng hạt gấc chứa 22% các acid béo theo khối lượng Trong đó có 32% acid oleic, 29% acid palmitic, 28% acid linoleic Thành phần hóa học của hạt gấc chủ yếu là acid steric (60,5%), một lượng nhỏ acid linoleic (20%), acid oleic (9%), acid palmitic (5 – 6%), và một số acid ở dạng vết: arachidic, cis-vaccenic, linolenic, palmitoleic, alcosa-11-enoic, eicosa-13-enoic Do đó carotenoid dễ hấp thu hơn trong cơ thể [4]

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy màng hạt gấc là nguồn cung cấp lycopene và β-carotene dồi dào, có giá trị sử dụng Do đó, chúng tôi chọn màng hạt gấc làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu

Bảng 2 3: Thành phần dinh dưỡng của màng hạt gấc [5]

2.1.2.4 Một số sản phẩm từ quả gấc trên thị trường

Hiện nay, trên thị trường xuất hiện một số sản phẩm có công dụng như thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, giàu carotenoid sản xuất từ quả gấc.như viên nang gấc VINAGA (do VIPOFOOD sản xuất) chứa β-carotene, lycopene, vitamin E giúp phòng chữa tiểu đường, hạ cholesterol trong máu, phòng chữa những hư hỏng trong cấu trúc ADN với những trường hợp bị nhiễm xạ, phòng chữa thiếu vitamin A, khô mắt, mờ mắt, làm mau lành vết thương Ngoài ra còn có dầu dinh dưỡng cho trẻ em VIO do Công ty Cổ phần Dầu thực vật Tường An sản xuất giúp sáng mắt, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể Nước uống G3 (Pharmanex sản xuất) được chế biến từ gấc và 3 loại quả: Chinese Lycium, Siberian Pineapple, Cili Loại nước giải khát này có tác dụng bảo vệ tế bào và mạch máu, chống lão hóa…

Viên nang dầu gấc Dầu ăn dinh dưỡng Nước trái cây G3

Hình 2 3: Một số sản phẩm từ gấc trên thị trường

2.2 Sơ lược về hợp chất carotenoid tự nhiên trong thực phẩm

Carotenoid là một trong những chất màu quan trọng và phổ biến đó là: xanh, vàng,

da cam và đỏ Chúng có thể tìm thấy trong rau, củ, quả, tảo, nấm, vi khuẩn và một số động vật Các chất này tạo ra màu sắc đa dạng cho các loài chim, cá, côn trùng, và có thể tìm thấy trong các sản phẩm động vật như trứng, sữa Tuy nhiên, các loài động vật có vú,

kể cả con người không thể tự tổng hợp được carotenoid, mà chỉ có thể hấp thu từ thức ăn

Lịch sử nghiên cứu carotenoid bắt đầu từ thế kỷ 19, lần đầu tiên Wackenroder cô lập được hợp chất màu cam từ cà rốt Cho đến nay, hơn 600 carotenoid được tìm ra nhưng chỉ một vài loại có giá trị dinh dưỡng như: lycopene, β-carotene, xanthophylls, α-cryptoxanthin β -cryptoxanthin, zeaxanthin, lutein [7] [8]

Carotenoid thuộc nhóm tetraterpen (C40H56), có nhiều nối đôi tiếp cách trong phân

tử Đây là nhóm tạo ra các sắc tố từ vàng đến đỏ, hòa tan trong chất béo, chúng làm rau quả có màu da cam, màu vàng, màu đỏ Nhóm carotenoid gồm 65 đến 70 chất màu tự nhiên, tiêu biểu là carotene, lycopene, xanthophyl Carotenoid có trong đa số thực vật, xoài (473 µg/ 100g), ổi ruột đỏ (5578 µg/ 100g), dưa hấu (4921 µg/ 100g), nho (112 µg/ 100g), đu đủ (1112 µg/100g), cam (327 µg/100g), chuối 73 µg/100 [9-12]

2.2.1 Tính chất lý hóa của carotenoid

2.2.1.1 Tính tan

Hầu hết các carotenoid có tính thân dầu, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ như acetone, cồn, ethyl ether, chloroform và ethyl actate Các carotene dễ tan

trong petroleum ether, hexan, và toluene Xanthophyll tan tốt trong methanol và ethamol Carotenoid tinh thể khó tan trong các dung môi trên nhưng tan trong benzene và dichloromethane Dung dịch β-carotene và xanthophyll lutein tan tốt trong tetrahydrofuran.[2, 7]

2.2.1.2 Hấp thu ánh sáng [7]

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo thành phổ hấp thu ánh sáng, làm cho carotenoid có màu sắc đẹp, đồng thời tạo ra một phổ hấp thu nhìn thấy được, đặt cơ sở để định tính và định lượng chúng Phổ hồng ngoại và tử ngoại là công cụ phát hiện đầu tiên để nhận biết carotenoid Bước sóng hấp thu cực đại (λmax) và hình dạng phổ là những đặc điểm của nhóm mang màu

Hầu hết carotenoid hấp thu cực đại ở 3 bước sóng Số lượng nối đôi liên hợp càng nhiều, giá trị λmax càng cao Do đó, hầu hết các carotenoid lycopene không vòng không bão hòa, với 11 nối đôi liên hợp, có màu đỏ và hấp thu bước sóng dài nhất (λmax bằng

444, 470, 502 nm)

2.2.1.3 Đồng phân hóa và sự oxi hóa

Carotenoid có độ không bão hòa cao nên dễ bị đồng phân hóa và oxi hóa Nhiệt độ, ánh sáng, acid và sự hấp thu của các chất hoạt động bề mặt (nhôm oxit) thúc đẩy quá trình đồng phân hóa của dạng trans carotenoid, dạng thường gặp của chúng là dạng cis Nguyên nhân làm mất carotenoid là do sự oxi hóa, phụ thuộc vào sự có mặt của oxy, và bị tác động bởi ánh sáng, enzyme, ion kim loại và đồng oxi hóa với lipid hydroperoxide Dạng epoxide và apocarotenoid (carotenoid có carbon skeleton xuất hiện trong giai đoạn đầu của quá trình tổng hợp carotenoid trong thực vật Sự phân chia tạo thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp tương tự với quá trình oxi hóa các acid béo, làm mất màu và mất hoạt tính sinh học Sự đồng phân hóa và oxi hóa carotenoid diễn ra trong quá trình chuẩn

bị, quy trình chế biến và tồn trữ thực phẩm [7]

2.2.2 Lycopene

2.2.2.1 Cấu trúc hóa học

Khung sườn carbon của lycopene là chuỗi hydrocarbon mạch thẳng gồm 11 nối đôi liên hợp và 2 nối đôi không liên hợp Lycopene không có vòng β-ione như β-carotene và do

đó không có hoạt tính tiền vitamin A

Hình 2 4: Công thức cấu tạo lycopene

Công thức phân tử : C40H56

Khối lượng phân tử : 536.8824

Lycopene là chất màu đỏ chủ yếu của nhiều loại trái cây và rau củ như : cà chua, dưa hấu, đu đủ ruột đỏ, ổi, nho đỏ

2.2.2.2 Lợi ích cho sức khỏe

Trong thập niên gần đây, có nhiều thăm dò về vài trò của lycopene trong việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch và ung thư Lycopen có khả năng bảo vệ các phân tử sinh học của tế bào như lipid, lipoprotein, protein và NDA không bị tổn hại do sự tấn công của các gốc tự do tế bào khỏi sự oxi hoá Những nghiên cứu dịch tễ học ở Mỹ về tác dụng của lycopene trong cà chua đã cho thấy ở vùng nào người dân ăn nhiều cà chua thì tỷ lệ ung thư ống tiêu hoá (đặc biệt dạ dày, trực tràng và kết tràng) thấp hơn những vùng người dân

ăn ít cà chua, tỷ lệ người cao tuổi chết về ung thư giảm tới 50% Kết quả ấn tượng nhất về tác dụng của lycopene là đối với ung thư tuyến tiền liệt Trong một nghiên cứu kéo dài 12 năm trên một nhóm đối tượng ăn ít nhất 2 lần nước sốt cà chua mỗi tuần đã thấy nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt giảm 35%, tác dụng này còn mạnh hơn ở những người ung thư đang tiến triển [13] Lycopene cũng được công nhận có tác dụng giảm bệnh tim mạch Sử dụng nhiều sản phẩm cà chua chế biến làm tăng nhanh nồng độ lycopene trong huyết tương và giảm mức tổn hại lipoprotein trong cơ thể Nồng độ lycopene trong huyết tương

cao có thể tránh được sự xơ vữa mạch máu và nhồi máu cơ tim Ngoài ra, lycopene còn hạn chế sự tổng hợp ra cholesterol và làm tăng các lipoprotein tỷ trọng thấp

2.2.3 β-carotene

2.2.3.1 Cấu trúc hóa học

β-carotene có trong các loại củ quả màu vàng, cam như : cà rốt, khoai lang, xoài, bí ngô,

đu đủ, mơ, bông cải xanh

Hình 2.5: Công thức cấu tạo β-carotene

Công thức phân tử : C40H56

Khối lượng phân tử : 536.8824

β-carotene có công thức hóa học giống lycopene nhưng khác nhau về cấu tạo Phân tử có

9 nối đôi liên hợp và khung carbon kết thúc bằng hai vòng β-ionone Cấu tạo đặc biệt này quyết định tính chất riêng biệt của β-carotene

β-carotene dễ bị oxi hóa và đồng phân hóa dưới tác động của ánh sáng, oxygen và hơi nóng Cần bảo quản trong bao bì tối màu, kín, chứa khí trơ như nitơ hoặc argon

2.2.3.2 Tính chất sinh học

™ Hoạt tính tiền vitamin A

carotene chứa 2 vòng ionone có hoạt tính tiền vitamin A Trong số các đồng phân carotene, dạng trans có hoạt tính vitamin A 100%, trong khi đó, dạng cis chỉ có 50% hoạt tính hoặc thấp hơn

β-carotene là nguồn tiền vitamin A dồi dào trong thực phẩm nhằm ngăn ngừa sự thiếu hụt vitamin A Viatmin A đóng vai trò quan trọng trong cơ thể như thị lực, tăng cường hệ miễn dịch β-carotene cũng là một chất chống ung thư tiềm năng

2.3 Sự oxy hóa, chất chống oxy hóa, cơ chế phản ứng chống oxi hóa

2.3.1 Sự oxi hóa

Trong phản ứng vô cơ, chất cho một electron để trở thành ion dương gọi là chất bị oxi hóa hay chất khử Chất nhận thêm một electron để trở thành ion âm gọi là chất bị khử hay chất oxi hóa

Quá trình nhận electron là quá trình oxi hóa, còn quá trình cho electron là quá trình khử Trong đa số trường hợp, phản ứng oxi hóa – khử là phản ứng cân bằng giữa dạng oxi hóa và khử Hai dạng này tổ hợp trong một phương trình chung gọi là phản ứng oxi hóa – khử Theo các nghiên cứu đã được công bố, các bệnh ung thư, tim mạch, lão hóa… có liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong tế bào sống Các quá trình oxy hóa xảy ra trong tế bào dưới tác dụng của các gốc tự do tạo ra năng lượng phá hủy các DNA, protein…

Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong quá trình trao đổi chất hoặc đưa vào từ bên ngoài qua thức ăn, hoặc do vi sinh vật, virus Các gốc tự do tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl OH•, ion sắt Fe2+ ; những gốc tự do trung bình và yếu như superoxide anion (O2 •-), hydrogen peroxide (H2O2), oxy đơn phân

tử, peroxynitrite (ONOO-)… Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình chống oxy hóa nội sinh bằng các hợp chất như: glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại sinh xâm nhập

Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất bức xạ UV, nhiễm phóng xạ, khói thuốc lá, hoặc do tiêu thụ nhiều thực phẩm chiên, nướng quá lửa… Khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, các gốc tự

do dư thừa có khả năng tương tác phá hủy màng lipid bảo vệ tế bào, oxy hóa các nucleic base làm thay đổi cấu trúc DNA gây ra đột biến gen, phát sinh các khối u, ung thư, làm

hỏng cấu trúc protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò như là chất mang các chất hoạt hóa enzyme trong quá trình hô hấp) gây ra các bệnh nguy hiểm ở đường hô hấp…

Các gốc tự do là dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng chống oxy hóa, “bắt” gốc tự do của các hợp chất tự nhiên có khả năng ngăn ngùa và chữa bệnh

2.3.2 Chất chống oxy hóa

Thuật ngữ “chất chống oxy hóa” ngày càng trở nên phổ biến trong xã hội hiện đại thông qua các tin tức trên các phương tiện thông tin đại chúng về lợi ích của chúng đối với sức khỏe

“Chất chống oxy hóa” là “những chất chống lại sự oxy hóa hoặc kiềm chế những phản ứng gây ra bởi oxygen hoặc peroxide, các chất này (như tocopherols) được sử dụng như chất bảo quản trong các sản phẩm khác nhau như trong chất béo, dầu, thực phẩm, và

xà phòng để làm chậm sự phát triển của mùi ôi, trong xăng và các sản phẩm dầu hỏa khác nhằm làm chậm sự tạo thành gum và những biến đổi không mong muốn, và trong cao su

để làm chậm sự hóa già”

Trong các định nghĩa liên quan tới sinh học, “chất chống oxy hóa” là “những chất

tự nhiên hoặc tổng hợp được thêm vào sản phẩm để ngăn chặn hoặc làm chậm sự hư hỏng

do oxy không khí gây ra

Trong lĩnh vực hóa sinh và dược phẩm, chất chống oxy hoá là những enzyme hoặc chất hữu cơ như vitamin E hoặc β-carotene có khả năng chống lại những tổn hại của sự oxi hóa các mô động vật”

Trong khoa học thực phẩm, chất chống oxy hóa được định nghĩa là những chất có trong thực phẩm có tác dụng làm giảm nồng độ của chất oxy hóa hoặc ngăn chặn các kiểu phản ứng có hại như kiểu phản ứng oxygen (ROS – reactive oxygen species) và kiểu phản ứng nitrogen (RNS – reactive nitrogen species) trong các chức năng sinh lý của con người [14, 15] Theo định nghĩa này, không phải tất cả các chất khử liên quan trong phản ứng hóa học đều là chất chống oxi hóa Chỉ những hợp chất có khả năng bảo vệ mục tiêu sinh

học từ sự oxy hóa theo tiêu chuẩn này Các chất chống oxy hóa trong tự nhiên tồn tại ở hai dạng: hydrophilic và lipophilic

2.3.3 Cơ chế chống oxy hóa

Cơ chế của hoạt động chống oxy hóa gồm: (1) các hàng rào sinh lý ngăn chặn sự tạo ra ROS hoặc đưa ROS đến các vị trí có vai trò sinh học quan trọng như: lọc tia UV, màng tế bào; (2) các “bẫy” hóa học “hấp thu” năng lượng và electron, dập tắt ROS như: carotenoid, anthocyanidin; (3) hệ thống enzyme catalytic trung hòa hoặc làm lệch hướng ROS như: enzyme chống oxy hóa SOD (superoxide dismutase), catalase, và glutathione peroxidase; (4) bất hoạt ion kim loại nhằm ngăn chặn sự tạo thành ROS như: ferritin, ceruloplasmin, catechins; (5) chất chống oxy hoá bẻ gãy liên kết, phá hủy ROS như: acid ascorbic (vitamin C) tocopherol (vitamin E), acid uric, glutathione, flavonoid [15]

Phản ứng của chất chống oxy hoá với các gốc tự do hoặc chất oxi hóa khác nhau là khác nhau Ví dụ, carotenoid không là chất ức chế gốc peroxyl tốt liên quan đến phenolic, nhưng chúng là những gốc dọn sạch oxy phân tử tuyệt vời Do đó, không có thử nghiệm riêng lẻ nào cho biết một cách chính xác cơ chế hoạt động của các nguồn tạo ra gốc tự do hay các chất chống oxi hóa trong một hệ thống phức tạp Dựa vào cơ chế bất hoạt liên quan, các cách thức chống oxy hóa chính thường được phân thành hai cơ chế: trao đổi nguyên tử hydro (HAT – hydrogen atom transfer) và trao đổi ion (ET – electron transfer) [14, 15]

Cơ chế HAT: chất chống oxy hoá cách cho 1 nguyên tử hydro để trung hòa gốc tự

do Phương pháp này thích hợp với chất chống oxy hoá bẻ gãy chuỗi tạo ra gốc tự do

AH + X• Æ XH + A•

Cơ chế HAT phụ thuộc dung môi và pH và thực hiện nhanh, từ vài giây đến vài phút Cơ chế HAT cơ bản thường dùng các gốc tự do tổng hợp (ABAP, 2,2’-azobis-2-amidinopropane dihydrochloride; AMVN, 2,2’-azobis-2,4-dimethyl valeronitrile; ABTS, 2,2’-azobis-3-ethylbenzothiazolline-6-sulfonic)

Cơ chế ET: chất chống oxy hoá cho một electron để khử các ion kim loại, carbonyl

và các gốc khác

M (III) + AH Æ AH• + M(II)

Trong cơ chế ET, sự hồi phục dựa vào điện thế khử proton và điện thế ion của từng nhóm phản ứng chức năng Vì vậy, phản ứng phụ thuộc vào pH Giá trị điện thế ion hóa giảm theo sự tăng pH Trong môi trường acid, khả năng bị khử có thể bị kiềm hãm do sự proton hóa của hợp chất chống oxy hoá Ngược lại, trong điều kiện chuẩn, sự phân ly của hợp chất phenolic làm cho hoạt tính của mẫu giảm mạnh [14]

Cơ chế ET gồm hai hợp chất trong hỗn hợp phản ứng là chất chống oxi hóa và chất oxi hóa Chất oxi hóa hấp thu một electron của chất chống oxi hóa, kết quả làm thay đổi màu của chất oxi hóa Mức độ thay đổi màu tỷ lệ với nồng độ chất chống oxi hóa Phản ứng kết thúc khi sự đổi màu dừng lại Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ hấp thu (ΔA) theo nồng độ chất chống oxi hóa cho ta một đường chuẩn Độ dốc của đồ thị chỉ khả năng làm giảm chất chống oxi hóa, được biểu diễn tương đương với Trolox hoặc acid gallic Để đánh giá sự tương quan, người ta thừa nhận khả năng chống oxi hóa bằng sự giảm hoạt tính

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa [15]

Bất kỳ một phương pháp chống oxi hóa nào cũng cần một chất khơi mào sự oxi hóa, một chất nền thích hợp, và một chất nhận để xác định điểm cuối Sự khơi mào có thể

do sự tăng nhiệt độ và oxi phân tử, sự chuyển trạng thái của chất xúc tác kim loại, tác động của ánh sáng và quá trình lắc rung tăng sự tiếp xúc giữa chất phản ứng với gốc tự

do Tuy nhiên, phương pháp xác định và điều kiện phân tích có thể dẫn đến kết quả khác nhau ở các loại thực phẩm giống nhau

Một vài phương pháp phân tích có thể xác định được điểm cuối Bao gồm: (1) xác định thời điểm bắt đầu, (2) xác định tỷ lệ phản ứng, (3) xác định sự trễ pha, khoảng thời gian trễ đến điểm cuối, mẫu có hoạt tính chống oxi hóa càng cao thì thời gian thay đổi càng lâu

Hoạt tính chống oxi hóa có thể xác định bằng tác dụng của chất chống oxi hóa trong việc kiểm soát mức độ oxi hóa Các phương pháp rất đa dạng

Dựa trên nguyên tắc và cơ chế trên, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hoạt tính chống oxy hóa Dựa trên khả năng bắt gốc peroxyl có phương pháp ORAC

parameter), giảm độ mạnh kim lọai bằng phương pháp FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power) Sử dụng ABTS và DPPH để bắt gốc tự do hữu cơ Phương pháp DMPD dùng để xác định hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất hydrophilic, dựa trên phương pháp quang phổ vì gốc tự do tạo thành dung dịch có màu ổn định

Ở dạng ion, DPPH• có màu tím, ổn định trong methanol và có một dải hấp thu từ

515 đến 517 nm Thử nghiệm DPPH được dùng để xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết trà, các loại dầu thực vật và một vài loại rau [16, 17]

Hình 2 6: Công thức phân tử DPPH

2.3.4.2 Phương pháp DMPD

Phương pháp này dùng để đo hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất ưa nước, sử dụng N,N-Dimethyl-p-phenylenediamine (DMPD) Cation của chất này tạo thành dung dịch màu ổn định Sự ức chế tạo màu có thể thấy được khi có sự hiện diện của chất chống oxi hóa [17]

Cation DMPD được tạo ra dựa trên phương pháp quang phổ được áp dụng để xác định các hợp chất sulphide không bền trong protein, phần ưa nước của cà chua, các loại

rượu màu đỏ, trà xanh, nước ép quả lựu và hoạt tính chống oxi hóa của rượu và trạng thái oxi hóa của huyết tương người Trong thử nghiệm DMPD•+ đầu tiên, gốc cation màu tím được tạo ra do phản ứng giữa DMPD với FeCl3 ở pH acid Độ hấp thu của dung dịch được đo ở 505 nm và ổn định màu trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Thử nghiệm này dựa trên khả năng làm giảm màu của hợp chất phenolic, chuyển

từ màu vàng của phức Fe(III)-TPTZ sang màu xanh của phức Fe(II)-TPTZ thông qua các chất chống oxi hóa cho electron Màu xanh được đo bằng quang phổ kế ở 593 nm

nghiệm, kỹ thuật chiết rắn – lỏng được sử dụng nhiều hơn, gồm chiết ngấm kiệt (percolation), chiết ngâm dầm (maceration), trích ly bằng hệ thống Soxhlet, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn,…

Trích ly rắn – lỏng là quá trình hòa tan có chọn lọc một hay nhiều cấu tử trong vật liệu bằng cách cho vật liệu tiếp xúc trực tiếp với dung môi hữu cơ lỏng Có thể dùng một loại dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi để trích ly carotenoid phụ thuộc vào các hợp chất khác trong rau quả

2.4.2 Các phương pháp xác định hàm lượng carotenoid

2.4.2.1 Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) [6]

Từ những năm 1970, phương pháp HPLC đã được phát triển để phân tích carotenoid trong rau quả như cà chua, ớt, bắp, bí đỏ, khoai lang, cà rốt và dầu olive Nhiều carotenoid gồm α- và β-carotene, capsanthin, cryptosanthin, zeaxanthin, lycopene và neoxanthin được tìm thấy và xác định số lượng Để tách carotenoid, HPLC pha đảo thường được dùng hơn pha thuận Cột C18 và C30 thường được sử dụng, nhưng cột C30 tách các đồng phân carotenoid tốt hơn cột C18 Sự chọn dung môi phụ thuộc vào pha tĩnh, số lượng và thành phần các carotenoid và điều kiện phòng thí nghiệm Carotenoid được tìm thấy trong quả gấc lần đầu tiên vào năm 1940, nhưng hơn 60 năm sau, kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp mới được dùng để phân tích các thành phần của carotenoid trong gấc

Ngoài ra còn sử dụng phương pháp xà phòng hóa và không xà phòng hóa để xác định carotenoid Trong phương pháp xà phòng hóa, trước khi trích ly, màng hạt được xà phòng hóa với KOH để các carotenoid như zeaxanthin và β-cryptoxanthin phản ứng với các acid béo thành dạng carotenoid ester Tác giả đã tìm thấy một lượng nhỏ zeaxanthin

và β-cryptoxanthin so với lycopene và β-carotene, màu đỏ giảm khoảng 40% bởi sự xà phòng hóa.[3]

2.4.2.2 Phương pháp quang phổ

Phương pháp quang phổ UV/vis sử dụng quang phổ kế để đo cường độ ánh sáng trong vùng tử ngoại và hồng ngoại Phương pháp này thường được ứng dụng để xác định trạng thái chuyển tiếp của kim loại hoặc các chất có nhiều nối đôi liên hợp trong dung

dịch Từ độ hấp thu A tương ứng với nồng độ của vật liệu hấp thu tại độ dài không đổi, nồng độ mẫu có thể tính theo định luật Beer

Theo phương pháp 941.15 của Hiệp hội hóa phân tích (AOAC), sử dụng hỗn hợp hexane:acetone (v/v 3:2) hoặc hexan:ethanol (v/v 3:4) để trích ly carotene từ thực vật tươi 2 -5 gam mẫu tươi xay bằng máy xay sinh tố cùng với 100 ml dung dịch hexane:acetone và 0,1 gam MgCO3 trong 5 phút Gạn lọc phần dịch chiết và trích ly lại phần bã với 25 ml acetone, sau đó trích ly lại lần nữa với 25 ml hexane Trộn các dịch chiết với nhau và rửa với 100 ml nước để loại acetone Chuyển phần trên vào bình định mức 100 ml chứa sẵn 9 ml acetone, định mức tới vạch 100 ml bằng hexane Tiếp tục tách chlorophylls và xanthophylls trước khi đo độ hấp thu ở 436 nm Phương pháp trích ly này đơn giản và dễ thực hiện, nhưng phải được cải tiến cho phù hợp với mẫu gấc, và gấc không có chlorophylls và xanthophylls

So với HPLC, dung môi dùng trong phương pháp quang phổ ít độc hại hơn Bước tinh khiết hóa đơn giản hơn, và do đó tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, phương pháp này có một trở ngại, đó là không thể phát hiện được một peak riêng biệt cho từng carotenoid Độ hấp thu ở một bước sóng là độ hấp thu tổng của nhiều carotenoid có nhiều phổ chồng chéo lên nhau, có thể có một số hợp chất không là carotenoid gây nhiễu

2.5 Quá trình sấy và các kỹ thuật sấy

2.5.1 Định nghĩa quá trình sấy

Quá trình sấy là quá trình làm bốc hơi nước ra khỏi vật liệu bằng nhiệt Nhiệt được cung cấp cho vật liệu ẩm bằng dẫn nhiệt, đối lưu, bức xạ hoặc bằng năng lượng điện trường có tần số cao Mục đích của quá trình sấy là giảm khối lượng của vật liệu, tăng độ bền và bảo quản được tốt

Trong quá trình sấy, nước được cho bay hơi ở nhiệt độ bất kỳ do sự khuếch tán bởi

sự chênh lệch độ ẩm ở bề mặt và bên trong vật liệu và bởi sự chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh Sấy là một quá trình không

ổn định, độ ẩm của vật liệu thay đổi theo không gian và thời gian

Vì màng hạt gấc có độ ẩm cao nên dễ bị hỏng Do đó thời gian sử dụng ngắn Vì vậy cần sấy sơ bộ đến độ ẩm khoảng 15% để có thể bảo quản được lâu và có thể dự trữ để dùng trong thời gian trái mùa

2.5.2 Các phương pháp sấy

Sấy là phương pháp lâu đời nhất để bảo quản thực phẩm trong thời gian dài Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến thời gian sấy như: nhiệt độ, tuần hoàn tác nhân sấy, độ ẩm và loại thực phẩm đem đi sấy.Có nhiều phương pháp sấy như: sấy thùng quay, sấy tầng sôi, sấy phun, sấy thăng hoa, sấy bằng dòng điện cao tầng, sấy bức xạ

Bảng 2 4 Một số kỹ thuật sấy thường dùng đối với thực phẩm

Phương pháp sấy Cách dùng Ưu điểm Nhược điểm

Phơi nắng Trái cây, thịt, cá, cây

cỏ

Đơn giản, rẻ tiền Chiếm nhiều diện

tích, thời gian dài, cần nhiều nhân công, khó kiểm soát

Sấy tầng sôi Dạng hạt nhỏ Hoạt động gián đoạn,

đồng bộ, nhanh

Bị hạn chế bởi kích

cỡ hạt Sấy phun Chất lỏng, trà, cà phê

hòa tan

Nhanh, sản phẩm ở dạng bột mịn

Tốn nhiều năng lượng, thết bị phức tạp

Sấy thăng hoa Sản phẩm có giá trị

cao, cà phê hòa tan

Liên tục, không hạn chế kích cỡ hạt, nhiệt

Kỹ thuật sấy chân không được sử dụng để bảo vệ các thành phần thực phẩm dễ bị

hư hỏng bởi nhiệt nhở sự tăng cường trao đổi ẩm và nhiệt độ sấy thấp hơn Hệ thống sấy chân không thường gồm bốn phần: buồng chân không, bộ phận cấp nhiệt, thiết bị tạo và

duy trì độ chân không và một bộ phận để thu hơi nước bốc ra từ thực phẩm Nước ở thể lỏng bay hơi nhanh nhờ độ chân không Sự dịch chuyển nhanh của chất lỏng trong sản phẩm có thể gây bọt hoặc phồng trong cấu trúc Trao đổi nhiệt bằng dẫn nhiệt và bức xạ 2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian sấy lên màu sắc, hàm lượng carotenoid, hoạt tính chống oxy hóa

™ Khái quát về hệ màu CIE Lab

Nghiên cứu đặc tính màu sắc theo một hệ thống là rất cần thiết để đánh giá khách quan về sự khác biệt màu sắc Các hệ thống đo màu chủ yếu dựa trên sự cảm thụ màu sắc của mắt khi bị ánh sáng có cường độ và bước sóng khác nhau kích thích Hệ thống được

sử dụng phổ biến trên thế giới là hệ thống màu CIE

Dựa trên cơ sở ánh sáng phản xạ từ bất kỳ bề mặt nào cũng có thể quy về hỗn hợp của ba tia màu: đỏ (red), xanh lá (green), xanh da trời (blue) với tỷ lệ thích hợp

Để thuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống màu sắc CIE Lab Trong đó sử dụng ba thông số:

L: lightness – độ sáng

a: tọa độ màu trên trục đỏ - lục

b: tọa độ màu trên trục vàng – lam

Giao điểm của hai trục a và b là điểm vô sắc (gồm ba màu: đen, ghi, trắng tùy thuộc vào độ sáng tối) Những đoạn có cùng tông màu trong mặt phẳng ab nằm trên một đoạn thẳng kéo dài từ điểm trung tâm ra phía ngoài Trục độ sáng L có giá trị từ 0, ứng với màu đen đến 100, ứng với màu trắng Những màu có cùng độ sáng nằm trên mặt phẳng song song với mặt phẳng giấy

Hình 2 9: Không gian màu CIE Lab

Trong quá trình sấy, hai yếu tố nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến độ màu, hàm lượng carotenoid và hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm

Nhiệt độ cao dẫn đến các phản ứng phân hủy bởi nhiệt nhưng ở 30oC cũng có thể xảy ra phản ứng này [19] Hàm lượng carotenoid đều giảm đáng kể sấy ở nhiệt độ thấp

25oC và nhiệt độ cao 75 oC Tuy nhiên, nếu nhiệt độ sấy cao, thời gian sấy ngắn thì hoạt tính chống oxy hóa tăng so với mẫu đối chứng [20] Thời gian xử lý nhiệt dài, nhiệt độ cao làm giảm đáng kể hàm lượng lycopene [21] Tuy nhiên, quá trình nhiệt có thể làm cho lycopene phóng thích ra khỏi tế bào [22] Một số nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chế biến lên nồng độ carotenoid β-carotene giảm đáng kể trong suốt quá trình chế biến các đối với các loại rau củ khác nhau, nhưng nồng độ carotenoid có thể tăng, giảm hoặc không đổi tùy thuộc vào quá trình [23] Cà chua bị mất hoạt tính chống oxy hóa khi sấy ở nhiệt độ cao (60 – 110oC) trong 2 – 10 giờ để đạt ẩm độ cuối cùng thấp hơn 15% vì lycopene bị phá hủy [22]

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt lên lượng lycopene trong puree của mẫu cà chua lột vỏ và không lột vỏ, xử lý nhiệt ở 100oC trong những khoảng thời gian khác nhau thì không có sự thay đổi về lượng lycopene bị phá hủy đối với mẫu cà chua lột vỏ khi xử lý nhiệt trên 2 giờ Trong khi đó, với thời gian xử lí nhiệt kéo dài hơn 9

giờ thì hàm lượng lycopene giảm đáng kể Tuy nhiên, trường hợp cà chua không lột vỏ có hàm lượng lycopene tăng 30 % khi xử lý nhiệt trong 2 giờ Sau 9 giờ xử lý nhiệt, luợng lycopene trong mẫu không lột vỏ bị mất đi 26% và 39% trong mẫu lột vỏ [21]

Trong quá trình sấy, màu sắc của nguyên liệu cũng bị biến đổi Sau quá trình sấy làm cho màu của sản phẩm bị đen sạm hoặc sậm màu hơn ban đầu (giá trị L* giảm) Đường, pH, các amino acid, và thời gian sấy ảnh hưởng đến màu sắc của sản phẩm vì các hợp chất màu nâu hình thành Giá trị a*/b* được dùng phổ biến như một chỉ số để kiểm tra chất lượng màu sắc (độ sáng của màu đỏ) Giá trị L* và a*/b* đều giảm sau khi khử nước trong cà chua Giá trị a*/b* giảm đi 50 % khi cà chua được sấy đối lưu bằng không khí ở 90oC đến độ ẩm 3 – 4% [22]

Trong các phương pháp sấy: sấy bằng lò ở 60oC, sấy chân không ở 55 oC, sấy bằng không khí ở 60oC , sấy thăng hoa, sấy phun, kỹ thuật sấy thăng hoa nguyên hạt cho sản phẩm bột gấc có hàm lượng carotenoid cao nhất và màu sáng nhất [6]

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Quy trình nghiên cứu

Với mục đích nghiên cứu đã nêu trong mục 1.2, nội dung cơ bản của đề tài được trình bày trong hình 3.1 dưới đây:

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Nghiền mịn Màng hạt gấc

Nguyên liệu là màng hạt gấc tươi, màng hạt gấc sấy sơ bộ đến ẩm độ khoảng 15%, được trích ly bằng dung môi là hệ n-hexan : acetone (tỷ lệ thể tích n-hexan : acetone = 3:2) Dịch chiết sau khi rửa bằng nước cất tách ra hai phần: hydrophilic và lipophilic Phần lipophilic được pha loãng để xác định hàm lượng carotenoid và HTCO lipophilic Phần hydrophilic để xác định HTCO hydrophilic

3.2 Nguyên liệu và hóa chất

Dung môi: n-hexan, acetone, ethanol, methanol

Hóa chất dùng để xác định hoạt tính chống oxy hóa:

• Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)

• Sodium acetate tryhydrate C2H3NaO2 3H2O

• Ferric Chloride FeCl3

• Acid acetic

Các hóa chất trên do hãng Sigma-Aldrich (Đức) sản xuất

3.3 Thiết bị

• Tủ sấy Memmert UNB 400, Đức

• Tủ sấy chân không Jisico, J-DV01, Nhật Bản

• Máy quang phổ Thermospectronic

• Máy đo pH Orion 3star