NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI SVTH: NGUYỄN THỊ DUNG Ngành: DƯỢC THÚ Y Niên khóa: 2004-2009 Tháng 09/2009 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS CHỨA SELEN HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NI Tác giả NGUYỄN THỊ DUNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y-chuyên ngành Dược ngành Dược thú y Giáo viên hướng dẫn ThS LÊ VĂN LĂNG BSTY ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP Tháng 09 năm 2009 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Dung Tên luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa ống nghiệm nguyên liệu chứa Selen hữu dùng chăn nuôi” Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khóa ngày …./…./2009 Giáo viên hướng dẫn Giáo viên hướng dẫn ThS Lê Văn Lăng BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến - Bậc sinh thành sinh ra, chăm sóc, dạy dỗ em để có Nguyễn Thị Dung hôm - ThS Lê Văn Lăng – giảng viên Bộ môn Bào chế-Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp - Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh hướng dẫn em tận tình cơng việc hỗ trợ chu đáo tất mặt để em hoàn thành tốt luận văn - Bộ môn bào chế phân tích - Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh hỗ trợ trang thiết bị mơi trường làm việc chuyên môn cần thiết cho suốt trình nghiên cứu em - Ban giám hiệu Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh giúp đỡ em có mơi trường học tập đầy đủ - Các thầy, Khoa Chăn Ni Thú Y nói riêng, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, dày công dạy dỗ, rèn luyện truyền đạt cho em kiến thức, cho em hành trang để vững bước vào đời - Tất bạn sinh viên lớp Dược Thú Y 30, Đại Học Nông Lâm TP HCM giúp đỡ động viên em suốt năm đại học, bạn sinh viên Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh ln nhiệt tình hỗ trợ em Một lần em xin chân thành biết ơn gửi lời chúc sức khỏe-thành công-hạnh phúc đến tất người NGUYỄN THỊ DUNG iii TĨM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa ống nghiệm nguyên liệu chứa selen hữu dùng chăn nuôi”, tiến hành thời gian từ tháng 3/2009 đến 7/2009, Phòng nghiên cứu – Bộ môn Bào Chế - Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP.HCM Đề tài bước đầu nghiên cứu đặc tính nguyên liệu chứa selen hữu (Selen-sa) Chúng nghiên cứu nguyên liệu: (1) mẫu chuẩn natri selenit (Na2SeO3), (3) tảo Spirulina platensis chứa Selen-sa có hàm lượng Selen-sa khác (0 mcg/ml - 0,2 mcg/g - 120 mcg/g Các phương pháp sử dụng đề tài gồm: - Phương pháp chiết ướt để xử lý mẫu - Phương pháp so màu để định tính, sơ định lượng selen vô mẫu nguyên liệu tảo định lượng selen hòa tan dịch chiết từ mẫu tảo chứa Selen-sa - Thử hoạt tính chống oxy hóa hai phương pháp: • Phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) • Ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp sắt II (Fe2+) Ỉ sắt III (Fe2+) Kết thu sau: - Xác định nồng độ chất chiết (cắn) dịch chiết mẫu tảo - Định tính sơ định lượng selen vơ nguyên liệu (2,5 mcg/g tảo - 0,95), chứng minh Fe2+ bị oxy hóa nhanh ổn định Từ cho thấy, có chất ngăn chặn, bắt giữ Fe2+, lượng Fe2+ giảm đi, tức chất có tác dụng chống oxy hóa Những chất có tác dụng ngăn chặn mạnh thể rõ qua phương trình tương tự phương trình oxy hóa Fe2+ ngồi khơng khí 4.3.2.3 Kết ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp Fe2+ mẫu chuẩn mẫu thử tảo Kết HTCO mẫu chuẩn natri selenit mẫu thử tảo Spirulina thể qua bảng 4.8 biểu đồ 4.8 Bảng 4.8 Kết ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp Fe2+ mẫu chuẩn mẫu thử Mẩu Chuẩn C T K Nồng độ (mcg/ml) 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 Chứng 34 OD 0,4836 0,4684 0,4580 0,4544 0,4516 0,4634 0,4510 0,4201 0,4626 0,4357 0,4600 0,4561 0,4571 0,4604 0,4510 0,4881 0,4671 0,4772 0,4613 0,4377 0,5029 HTCO (%) 3,84 6,86 8,93 9,64 10,20 7,85 10,32 16,46 8,01 13,36 8,53 9,31 9,11 8,45 10,32 2,94 7,12 5,11 8,27 12,96 y = -0.0061x + 9.9285 12.00 R = 0.9902 10.00 8.00 HTCO selenit 6.00 Linear (HTCO selenit) 4.00 2.00 0.00 500 1000 1500 Biểu đồ 4.8 Đồ thị HTCO selenit phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp (Fe2+) Qua bảng 4.8 biểu đồ 4.8, đưa số nhận xét sau: Mẫu chuẩn natri selenit thể HTCO ổn định (biểu đồ 4.8) Tuy nhiên, HTCO qua phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp Fe2+ chậm thấp Ở khơng khí sau 30 phút nồng độ Fe2+ 20,42 (%) (Bảng 4.7) tức Fe2+ bị oxy hóa 79,58 (%) Trong đó, sau 30 phút, nồng độ selenit cao HTCO 3,84 (%), Fe2+ 96,16 (%) Khi nồng độ giảm, oxy khơng khí tham gia vào oxy hóa Fe2+ nên HTCO lại tăng lên 10,20 (%) Các mẫu thử HTCO phản ứng không rõ ràng, kết thay đổi liên tục không ổn định Riêng mẫu K, HTCO lại thể theo quy luật tỉ lệ nghịch với nồng độ Điều cho thấy nồng độ chất chiết giảm oxy khơng khí tham gia vào oxy hóa Fe2+ thành Fe3+ Khi nồng độ chất chiết cao, màu dung dịch làm cản trở phần oxy hóa Fe2+ Ngồi ra, giới hạn đề tài, chúng tơi chưa phân tích thành phần có dịch chiết để đưa kết luận thật xác Qua phản ứng thử HTCO ống nghiệm natri selenit dịch chiết nguyên liệu tảo chứa Selen-sa, thấy rằng: Mẫu chuẩn natri selenit thể HTCO phương pháp đánh bắt gốc tự trực tiếp tốt, nồng độ selenit 10,43 mcg/ml HTCO 18,15 (%) tốt so với 35 phương pháp ngăn chặn hình thành gốc tự gián tiếp, nồng độ selenit 1000 mcg/ml HTCO 3,84 % Các mẫu thử khó để xác định HTCO thật chưa biết xác có chất hàm lượng chất cắn thu sau xử lý mẫu Hình 4.6 Phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp Fe2+ 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp, ghi nhận số kết luận sau: Xác định nồng độ chất chiết dịch chiết mẫu thử tảo Spirulina platensis Bằng phản ứng so màu đơn giản xác định sơ nồng độ selen tự dịch chiết tảo, định tính định lượng selen tự nhanh cần thiết với nồng độ xác định thấp mcg/20 ml, định lượng sơ Selen-sa dịch chiết nguyên liệu Bằng phản ứng đánh bắt gốc tự trực tiếp, selenit môi trường pH = 1,2 thể khả chống oxy hóa, mơi trường pH khác khơng thể kết hai phương pháp khảo sát Từ đó, chúng tơi chứng minh selen vô thể rõ HTCO ống nghiệm (invitro), Selen-sa chưa thể HTCO invitro dùng phương pháp chiết tách thông thường, Selen-sa tảo chiết kết hợp selen với acid amin bền vững Với phương pháp ngăn chặn hình thành gốc tự kim loại chuyển tiếp (Fe2+), selen vô thể thấp Từ đó, chúng tơi kết luận selen có tác dụng chống oxy hóa trực tiếp bắt lấy gốc tự sinh q trình peroxid hóa lipid màng tế bào Selen-sa Với phương pháp thử nghiệm ống nghiệm (invitro) chứng minh tác dụng chống oxy hóa thật selen-sa 5.2 Đề nghị Đối với Selen-sa, dùng phương pháp chiết tách thông thường để tách selen thành dạng tự được, cần dùng phương pháp khác (HPLC – Sắc ký cột hiệu cao) để cắt acid amin chuỗi pepid từ thu 37 mẫu thử tinh khiết có Selen-sa để định lượng xác selen Selen-sa cần dùng phương pháp ASS – phương pháp hấp thụ nguyên tử Để chứng minh rõ tác dụng sinh học selen-sa cần triển khai thực thí nghiệm động vật (invivo) Một số phản ứng invivo xác định khả chống oxy hóa selen-sa như: MDA, GSH,… cần thời gian thực kéo dài Với kết thu từ đề tài bước khởi đầu cho nghiên cứu sâu Selen-sa tảo, nguyên liệu sử dụng rộng rãi người tương lai khơng xa đến với thú y, để sản xuất nguồn thịt không kháng sinh, không hormon,… 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ y tế, 2002 Dược điển Việt Nam III NXB Y học Hà Nội PL 26, 30 Hội thảo chuyên đề, 2009 Chăn nuôi không cần kháng sinh Trang tin Khoa học kỹ thuật Sài Gòn Giải Phóng Đàm Trung Bảo Đặng Hồng Thủy, 1983 Selen sinh học NXB Y học Đàm Trung Bảo Nguyễn Quang Thường, 1996 Một số kết phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa nghiên cứu thuốc NXB Hà Nội Nguyễn Trung Cương, 2005, Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa số chế phẩm chứa selen Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học Trang – 30 Lê Thị Ngọc Diệp, 1999 Giáo trình độc chất học thú y NXB Nông Nghiệp Trang.22 – 34 63 – 84 Đỗ Thị Thanh Hương, 2000 Khảo nghiệm số phương pháp tăng sinh khối tảo Spirulina Plantensis quy mơ phòng thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp đại học Trang – 28 51 – 52 Lê Văn Lăng cộng sự, 12/2008 Nghiên cứu sản xuất sinh khối Spirulina giàu selen hữu (Selen-sa) để làm thuốc Báo cáo kết nghiên cứu Sở KH&CN TPHCM Lưu hành nội Lê Văn Lăng, 1999 Tảo Siprulina – Nuôi trồng, sử dụng y dược dinh dưỡng NXB Y học Tp Hồ Chí Minh Trang 11-109 10 Lê Văn Lăng, Lã Văn Tính cộng sự, 2007 Nghiên cứu bào chế số chế phẩm thảo dược dùng chăn nuôi thay kháng sinh hormon tăng trưởng Báo cáo đề tài nhánh cấp nhà nước KC06NN 11 Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc Dương Duy Đồng, 2002 Thức ăn dinh dưỡng động vật Trang 113 – 132 12 Trần Phi Hoàng Yến Trần Thành Đạo, 2009 Khảo sát tác động chống oxy hóa Invitro số dẫn chất Flavonoid - vai trò nhóm OH tác động 39 chống oxy hóa dẫn chất Flavon Y Học TP.HCM Tập 13 Trang 164 – 169 TIẾNG ANH 13 Contans, J.et al, 1999 Selenium and HIV infection Nutrition vol15 14 Chu, Y.H.Chang, C.L and Hsu H.F, 2000 Flavonoid conten of several vegetables and their antioxidant activity Journal of the science of Food and Agriculture 80 P.561 – 566 15 Fan Anna M.et al, 1990 Selenium – nutritional toxicologic and clinical aspects West J.Med P.153 16 F.W.Edens1, C.R.Parkhurst, G.B.Havenstein-North Carolina State University of Science, Raleigh; Ngư (theo: http://www.chonongsan.net) 17 Godwin, K.O, C.N.Fuss, 1972 The entry of selenium into rabbit protein following the administration of Na275SeO3 Aust J Biol Sci 18 Halliwell B, Chirico S,1993 Lipid peroxidation its mechanical measurement and significant American Journal of Clinical nutrition P.57 19 Hazenton G.a and C.A.Lang, 1980 Glutathion contents of tissues in the aging mouse Biochem.J.188 No I P.25 – 30 40 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng PL - 1: Kết khảo sát HTCO selenit tăng nồng độ chất chiết Mẫu C T K Chứng C Chứng T Chứng K Chứng Nồng độ (mg/ml) 10 10 9 7 5 2 1 10 10 9 7 5 2 1 10 10 9 7 5 2 1 OD 0,673 0,714 0,693 0,709 0,667 0,695 0,692 0,726 0,797 0,824 0,862 0,867 0,528 0,495 0,418 0,436 033 0,376 0,321 0,313 0,552 0,568 0,743 0,69 0,571 0,578 0,595 0,605 0,636 0,574 0,643 0,634 0,731 0,739 0,672 0,803 0,312 1,576 0,309 0,846 41 HTCO (%) 20,4 15,6 18,1 16,2 21,2 17,8 18,2 14,2 5,8 2,6 -1,9 -2,5 37,6 41,5 50,6 48,5 61,0 55,6 62,1 63,0 34,8 32,9 12,2 18,4 32,5 31,7 29,7 28,5 24,8 32,2 24,0 25,1 13,6 12,6 20,6 5,1 Nhận xét: HTCO có giá trị âm, độ hấp thu mẫu cao 0,312; 1,576; 0,309 mẫu C, T, K Do tăng nồng độ cắn đến mức màu dịch không màu Bảng PL - 2: Kết HTCO kết hợp dịch chiết tảo khơng có selen dịch natri selenit pha methanol pH = 1,2 Mẫu K+ Selenit Nồng độ (mg/ml) 10 10 9 7 5 2 1 OD 0,343 0,313 0,234 0,261 0,211 0,221 0,198 0,166 0,141 0,161 0,107 0,121 0,864 Chứng Nồng độ (mg/ml) 10 HTCO (%) 60,3 63,8 72,9 69,8 75,6 74,4 77,1 80,8 83,7 81,4 87,6 86,0 HTCO (%) 62,0 69,8 75,0 78,9 82,5 86,8 Nhận xét: Khi kết hợp thấy rõ thay đổi HTCO Với lượng selenit cho vào không đổi, nồng độ dịch chiết cao hạn chế hoạt động selenit Khi nồng độ dịch chiết cao ảnh hưởng đến màu DPPH 42 Bảng PL - 3: Kết độ hấp thu mẫu thử khả bắt gốc tự DPPH Mẫu K C T Nồng độ (mcg/ml) 1000 1000 500 500 100 100 50 50 10 10 1000 1000 500 500 100 100 50 50 10 10 1000 1000 500 500 100 100 50 50 10 10 OD 0,6401 0,6383 0,6338 0,6338 0,6288 0,6263 0,6066 0,6057 0,6362 0,6358 0,6323 0,6089 0,6457 0,5698 0,6131 0,6155 0,6155 0,6392 0,6149 0,6457 0,5423 0,5453 0,6059 0,6017 0,6085 0,63 0,5875 0,5789 0,6024 0,5777 0,6402 Chứng 43 HTCO (%) 0,0 0,3 1,0 1,0 1,8 2,2 5,2 5,4 0,6 0,7 1,2 4,9 -0,9 11,0 4,2 3,9 3,9 0,2 4,0 -0,9 15,3 14,8 5,4 6,0 5,0 1,6 8,2 9,6 5,9 9,8 Bảng PL – 4: Kết nồng độ Fe2+ dư Mẫu Chuẩn C T K Nồng độ (mcg/ml) 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 1000 500 100 50 10 44 OD 0,4836 0,4684 0,4580 0,4544 0,4516 0,4634 0,4510 0,4201 0,4626 0,4357 0,4600 0,4561 0,4571 0,4604 0,4510 0,4881 0,4671 0,4772 0,4613 0,4377 Fe2+ (%) 96,16 93,14 91,07 90,36 89,80 92,15 89,68 8354 91,99 86,64 91,47 90,69 90,89 91,55 89,68 97,06 92,88 94,89 91,73 87,04 ... vơ hóa nước cất Thêm vào dung dịch Trilon B 0,2M dung dịch NH4OH 10%, đưa pH đến Thêm dung dịch hydroxylamin 1% Sau thêm dung dịch thuốc thử 2,3-diaminonaphtalen Đậy dung dịch giữ 800C 30 phút... tạo thành dung dịch keo có màu từ đỏ - đỏ cam - vàng cam - vàng Thí dụ: Phản ứng với SO2 môi trường acid mạnh: tạo dung dịch đỏ cam, thêm acid nitric (HNO3) dung dịch màu trở nên suốt Dung dịch... lọc dịch suốt Thêm ml dung dịch acid HNO3 30 %, cách thủy 60oC 10 phút Thêm mg ure, đun sôi, để nguội Thêm ml dung dịch KI 10 % Nhận xét màu dung dịch thu so với dãy màu dung dịch chuẩn (bằng