HOÀN THIEN QUY TRÌNH ðNH LƯNG VÀ TÁCH CHIÊT DITERPEN LACTON TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

Sử dụng kỹ thuật chiết xuất ựể tách chiết hoạt chất diterpen lacton từ cây Xuyên tâm liên trong cồn 96 % ở quy mô phòng thắ nghiệm.. Tiến hành ựịnh lượng hàm lượng diterpen lacton, khảo

TR ƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CH ĂN NUÔI THÚ Y

VÕ THẾ LÂM

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH ðỊNH LƯỢNG VÀ TÁCH CHIẾT DITERPEN LACTON TRONG CÂY

XUYÊN TÂM LIÊN

Khoá lu ận tốt nghiệp

Ng ười hướng dẫn khoa học:

PGS.TS: TRẦN THỊ DÂN TS: TRẦN CÔNG LUẬN

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 6 năm 2009

L Ờ I C Ả M Ơ N

Em xin chân thành g ở i lò ng bi ế t ơ n sâu s ắ c ñế n:

Ban giám hi ệ u tr ườ ng ðạ i họ c Nông Lâm thà nh ph ố H ồ Chí Minh Quý th ầ y, cô gi ả ng d ạ y t ạ i khoa Ch ă n Nuôi Thú Y

Quý th ầ y, cô gi ả ng d ạ y t ạ i khoa D ượ c tr ườ ng ðạ i họ c Y D ượ c thà nh

ph ố H ồ Chí Minh

Cùng t ấ t c ả nh ữ ng th ầ y, cô truy ề n ñạ t nh ữ ng ki ế n th ứ c quý bá u trong nh ữ ng n ă m họ c v ừ a qua, giú p cho em hoà n thà nh khoá lu ậ n t ố t nghi ệ p nà y

Quý th ầ y, cô cù ng t ậ p th ể các anh, ch ị cá n b ộ tạ i Trung tâm Sâm và

D ượ c li ệ u thà nh ph ố H ồ Chí Minh ñã tạ o ñ i ề u ki ệ n h ế t s ứ c thu ậ n l ợ i, giúp

ñỡ em r ấ t nhi ề u trong quá trì nh th ự c hi ệ n khoá lu ậ n t ố t nghi ệ p

ðặ c bi ệ t, em xin trân trọ ng g ở i lò ng bi ế t ơ n sâu s ắ c ñế n th ầy Tr ầ n Công

Lu ậ n, anh V ươ ng Nam Trung, cô Tr ầ n Th ị Dân ñã ñị nh h ướ ng, t ậ n tuỵ h ướ ng

d ẫ n, giú p ñỡ em su ố t quã ng th ờ i gian là m ñề tà i t ố t nghi ệ p

Bên cạ nh ñó , xin cả m ơ n nh ữ ng ng ườ i bạ n, anh, chị ñã nhi ệ t tì nh giú p ñỡ

TÓM TẮT

đề tài ỘHoàn thiện quy trình ựịnh lượng, tách chiết diterpen lacton toàn phần

trong cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)Ợ ựược thực

hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chắ Minh từ tháng 11 năm 2008 ựến tháng 6 năm 2009

Sử dụng kỹ thuật chiết xuất ựể tách chiết hoạt chất diterpen lacton từ cây Xuyên tâm liên trong cồn 96 % ở quy mô phòng thắ nghiệm Tiến hành ựịnh lượng hàm lượng diterpen lacton, khảo sát và so sánh các phương pháp chiết trong mẫu Xuyên tâm liên thu hái từ vùng nguyên liệu đồng Tháp Mười (Mộc Hoá, Long An)

bằng phương pháp ựo mật ựộ quang

Ớ Kết quả thu ựược: đã xây dựng phương pháp ựịnh lượng bằng ựo quang không loại màu bằng than hoạt với dịch chiết Xuyên tâm liên Xác ựịnh ựược hàm lượng diterpen lacton của mẫu dược liệu là 8,82% (mẫu chiết quy mô lớn) so với khối lượng thô bằng phương pháp ựo quang

Ớ đưa ra ựược quy trình tách chiết diterpen lacton từ cây Xuyên tâm liên trên quy mô pilot, áp dụng phương pháp chiết ngấm kiệt không liên tục, chiết 6 lần với hiệu suất 98,234 %, hàm lượng andrographolide ựược kiểm tra dịch chiết bằng thiết bị HPLC là 1,83 %

Từ khoá: Xuyên tâm liên, diterpen lacton, kỹ thuật ựo quang, chiết xuất, quy mô

lớn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ðỒ ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH .x

DANH SÁCH CÁC SƠ ðỒ xi

Chương 1 1

MỞ ðẦU 1

1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 MÔ TẢ THỰC VẬT, PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI XUYÊN TÂM LIÊN 3 2.1.1 Thành phần các hoạt chất trong Xuyên tâm liên 7

2.1.2 Tác dụng dược lí của Xuyên tâm liên .9

2.2 Các phương pháp chiết xuất, phân lập và ñịnh lượng hợp chất diterpen lacton .11

2.2.1 Các phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất diterpen lacton .11

2.2.2 Các phương pháp ñịnh lượng diterpen lacton 12

2.2.3 Các nghiên cứu gần ñây về Xuyên tâm liên 13

Chương 3 17

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 VẬT LIỆU 17

3.1.1 Nguyên vật liệu 17

3.1.2 Dung môi và hoá chất 18

3.1.3 Thiết bị 18

3.2 PHƯƠNG PHÁP 19

3.2.1 Thử tinh khiết nguyên liệu 19

3.2.2 Hoàn thiện quy trình ñịnh lượng diterpen trong Xuyên tâm liên 23

Quy trình xử lý mẫu trong ño quang trước khi loại màu .24

Phương pháp chiết Soxhlet: 27

Phương pháp ngấm kiệt: 27

Chương 4 31

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 TIÊU CHUẨN HOÁ NGUYÊN LIỆU 31

4.1.1 ðộ ẩm 31

4.1.2 ðộ tro của dược liệu 32

4.1.3 Cao toàn phần 33

4.1.4 Sự tồn tại của Andrographolid trong mẫu dược liệu 33

4.2 ðỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ðO QUANG 36

4.2.1 Xây dựng ñường tuyến tính 36

4.2.2 Khảo sát phương pháp ñịnh lượng ño quang 38

4.3 KHẢO SÁT 2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 42

4.3.1 ðịnh tính với thuốc thử Kedde 42

4.3.2 ðịnh tính trên sắc kí lớp mỏng 44

4.3.3 Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp ño quang .46

4.4 QUY TRÌNH CHIẾT PILOT 48

4.4.1 ðịnh tính trên sắc ký lớp mỏng .48

4.4.2 ðịnh tính với HPLC 49

4.4.3 ðịnh lượng ño quang 51

Chương 5 56

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56

5.1 KẾT LUẬN 56

5.1.1 ðịnh lượng 56

5.1.2 Tách chiết 57

5.2 ðỀ NGHỊ 57

PRRS : Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome

RSD : Relative standard deviation

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ðỒ Bảng 2.1: Một vài nghiên cứu về chiết xuất và ñịnh lượng diterepen lacton trong

Xuyên tâm liên trong nước và trên thế giới 14

Bảng 3.1: Cách pha giai mẫu 24

Biểu ñồ 3.1: ðộ bền của phản ứng màu 26

Bảng 4.1: ðộ ẩm của mẫu dược liệu 30

Bảng 4.2: ðộ tro toàn phần và tro không tan trong acid HCl 31

Bảng 4.3: Hàm lượng cao toàn phần trong mẫu dược liệu 32

Bảng 4.4: Mật ñộ quang của các mẫu chuẩn 36

Biểu ñồ 4.1: ðường tuyến tính nồng ñộ andrographolid 37

Bảng 4.5: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần, mẫu Domesco loại màu 37

Bảng 4.6: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần, mẫu Domesco không loại màu 38

Biểu ñồ 4.2: So sánh 2 quy trình ñịnh lượng 38

Biểu ñồ 4.3: ðộ bền của phản ứng màu theo thời gian 41

Bảng 4.7: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần của mẫu chiết 41

Bảng 4.8: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần theo phương pháp chiết ngấm kiệt

45

Bảng 4.9: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần theo phương pháp chiết Soxhlet 45

Bảng 4.10: So sánh các chỉ tiêu giữa 2 phương pháp chiết 45

Bảng 4.11: Thống kê hàm lượng diterpen lacton toàn phần trong các dịch chiết trên quy mô Pilot 50

Biểu ñồ 4.4: So sánh hàm lượng diterpen lacton giữa các lần chiết 52

Bảng 4.12: Hiệu suất các mẫu chiết 53

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Xuyên tâm liên tại vườn dược liệu 3

Hình 2.2: Hoa Xuyên tâm liên 4

Hình 2.3: Biểu bì trên lá 4

Hình 2.4: Biểu bì dưới lá 4

Hình 2.5: Gân và phiến lá Xuyên tâm liên 5

Hình 2.6: Các công thức nhóm diterpen lacton 7

Hình 2.7: Các công thức nhóm flavonoid 8

Hình 3.1: Mẫu Xuyên tâm liên 17

Hình 3.2: Bình ngấm kiệt 27

Hình 4.1: Trước khi thêm thuốc thử Kedde 32

Hình 4.2: Sau khi thêm thuốc thử Kedde 32

Hình 4.3: Trước khi thêm thuốc thử Kedde, ñã loại màu 33

Hình 4.4: Sau khi thêm thuốc thử Kedde 33

Hình 4.5: Trước khi loại màu 33

Hình 4.6: Sau khi loại màu 33

Hình 4.7: Bước sóng hấp thu của dịch chiết Xuyên tâm liên trước khi loại màu 34

Hình 4.8: Bước sóng hấp thu của dịch chiết Xuyên tâm liên sau khi loại màu 35

Hình 4.9: Dịch chiết ngấm kiệt trước khi thêm thuốc thử Kedde 42

Hình 4.10: Dịch chiết ngấm kiệt sau khi thêm thuốc thử Kedde 42

HÌnh 4.11: Dịch chiết Soxhlet trước khi thêm thuốc thử Kedd 43

Hình 4.12: Dịch chiết sau khi thêm thuốc thử Kedde 43

Hình 4.13: SKLM của 7 dịch chiết ngấm kiệt 44

Hình 4.14: SKLM dịch chiết Xuyên tâm liên trong bộ dụng cụ Soxhlet 44

Hình 4.15: SKLM dịch chiết 6 lần của mẫu Xuyên tâm liên 48

ắc ký ñồ mẫu Xuyên tâm liên 49

DANH SÁCH CÁC SƠ ðỒ

Sơ ñồ 3.1: Phản ứng màu của dịch chiết Xuyên tâm liên 22

Sơ ñồ 3.2: Phản ứng màu của dịch chiết Xuyên tâm liên ñã loại than 23

Sơ ñồ 3.3: Quy trình ño quang không loại màu 25

Sơ ñồ 3.4: Quy trình ño quang có loại màu bằng than hoạt 26

Sơ ñồ 3.5: Quy trình xử lí mẫu ñể ñưa vào máy HPLC 28

Sơ ñồ 4.1: Quy trình ñịnh lượng ño quang 40

Sơ ñồ 4.2: Chiết ngấm kiệt với quy mô Pilot 47

to lớn Việc lạm dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ñã và ñang làm cho sản phẩm

của ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi heo, gà nói riêng ñang gặp những

phản ứng bất lợi của cộng ñồng tiêu dùng quốc tế Yêu cầu cấp thiết là tìm ra một hợp

chất có thể sử dụng ñể hạn chế hoặc thay thế cho kháng sinh ñã sử dụng trong thức ăn

chăn nuôi

Xuyên tâm liên (Andrographolis paniculata (Burm.f.) Nees) có vị ñắng là

dược liệu ñược nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và sử dụng, nhất là ở các nước châu Á: Ấn ðộ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia… Xuyên tâm liên

cũng ñược ghi vào dược ñiển các nước như Trung Quốc, Thái Lan…Thảo dược này

với các hợp chất chủ yếu là diterpen lacton và flavonoid ñược dùng ñể chữa các

bệnh liên quan ñến viêm ñường hô hấp, tiêu hóa, giảm ñau, kháng viêm ñồng thời

mở ra những khả năng to lớn trong việc ñiều trị các bệnh thời ñại như ñái tháo ñường, ung thư, HIV

Ở nước ta, Xuyên tâm liên ñược sử dụng nhiều trong chiến tranh và trong những

năm sau chiến tranh (1978-1985) Tuy nhiên, trong một thời gian dài sau ñó thì Xuyên tâm liên không ñược sử dụng nhiều mà thay vào ñó là các tân dược chuyên biệt Gần ñây, dược liệu này ñang dần ñược phục hồi trở lại ñể cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc thuộc chương trình “Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng ñiểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá dược ñến năm 2020”

Với những lí do trên, chúng tôi thực hiện ñề tài “HOÀN THIỆN QUY TRÌNH

ðỊNH LƯỢNG VÀ TÁCH CHIẾT DITERPEN LACTON TOÀN PHẦN TỪ

CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)” ñể tiến hành tách chiết hợp chất diterpen lacton từ cây Xuyên tâm liên ở quy mô lớn và tạo tiền ñề cho việc tiêu chuẩn hoá sản phẩm thu ñược nhằm ñưa vào sử dụng bổ sung trong thức

ăn chăn nuôi

1.2.1 Mục tiêu

Hoàn thiện quy trình ñịnh lượng bằng phương pháp ño quang

Hoàn thiện quy trình tách chiết, từ ñó ñưa ra quy trình áp dụng trên quy mô pilot

1.2.2 Yêu cầu

Quy trình ñịnh lượng bằng ño quang phải ñáp ứng các yêu cầu; dễ thực hiện, nhanh, chính xác, ổn ñịnh

Phương pháp tách chiết phải phù hợp với ñiều kiện hiện tại của các ñơn vị có

khả năng, có thể áp dụng rộng rãi ñể tách chiết hoạt chất diterpen lacton phục vụ cho nhu cầu của xã hội nhưng vẫn ñảm bảo có ñủ các hoạt chất chính trong nhóm diterpen lacton với hiệu suất cao

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LIÊN

Tên Việt Nam: Xuyên tâm liên

Tên khoa học: Andrographolis

Paniculata (Burm.f.) Nees

Tên khác: Cây công cộng, lãm

hạch liên, hùng bút, khổ ñảm thảo

Tên nước ngoài: Chirette, creat,

kirayat, mahatita, king of bitters,

sinta, halviva (Anh), roi des amers

(Pháp)

Phân loại khoa học:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophita

Lớp (class): Magnoliospsida

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Acanthaceae

Chi (genus): Andrographolis

Loài (species): Paniculata

Cây Xuyên tâm liên là loại

cây nhỏ, thân thảo, mọc thẳng ñứng, có thể cao ñến 1 m, có nhiều ñốt và cành

Thân: Thân vuông, có lông thưa ở các mấu

Lá: ðơn, mọc ñối, cuống ngắn, phiến lá thuôn hay hơi hình mác, hai ñầu nhọn, dài 4 - 6 cm Mặt trên của phiến lá xanh ñậm hơn mặt dưới và có lông thưa Mép lá gợn

Hình 2.1: Xuyên tâm liên tại vườn

dược liệu

sóng Gân lá lông chim nổi rõ ở mặt duới, có 5 cặp gân phụ, cuống lá dài khoảng 0,2 cm

Hoa: Màu trắng, ựiểm hồng, mọc thành từng chùm ở nách lá hay ở ựầu cành đài hoa: 5 lá ựài ựều, rời dạng dải hẹp, dài khoảng 0,3 cm, có lông thưa, tiền khai hoa liên mảnh

Tràng hoa: 5 cánh hoa dài

khoảng 1, 3 cm, màu trắng có ựốm

hồng, dắnh nhau bên dưới thành

một ống Môi trên màu trắng Thuỳ

giữa của môi dưới có màu tắm

hồng, hai thuỳ bên màu trắng có sọc

tắm Tiền khai hoa kết hợp

Quả: Quả nang dẹp, hai ựầu

nhọn, dài khoảng 16 mm, rộng 3,5

mm

Hạt: Hình trụ, thuôn dài, màu nâu nhạt

Cây ra hoa từ tháng 9-12, ra quả từ tháng 1-2

Tu8

Hinh 2.3: Biểu bì trên của lá Hình 2.4: Biểu bì dưới của lá

Hình 2.2: Hoa Xuyên tâm liên

1 Lớp biểu bì trên 5 Lục mô khuyết 9 Lớp biểu bì

4 Lục mô hình dậu

Xuyên tâm liên có nguồn gốc từ Ấn ðộ, sau ñó lan sang nhiều nước nhiệt ñới khác như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc, Philippine, Pakistan, Sri Lanka…Cây mọc hoang dại và ñược trồng chủ yếu ở các

nước Châu Á

Ở Việt Nam, cây ñược trồng ở nhiều ñịa phương Vào những năm 80, cây ñược trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc, sau ñó giảm xuống, gần ñây lại tiếp tục ñược khôi phục, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc

Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều ñịa phương trồng Xuyên tâm liên với quy mô khác nhau như: vùng dược liệu ðồng Tháp Mười, Lâm ðồng, Phú Yên v.v

Xuyên tâm liên mọc vào khoảng tháng tư hoặc ñầu tháng năm, cây mọc từ hạt Cây sinh trưởng nhanh trong mùa xuân-hè, mùa ñông tàn lụi Khi cây sắp ra hoa, lá nhỏ

dần và rụng sớm

Hình 2.5: Gân lá và phiến lá Xuyên tâm liên

Quả Xuyên tâm liên lúc già tự mở cho hạt thoát ra ngoài Hạt có tỉ lệ nẩy mầm cao (khoảng 70-80 %) Thời gian nẩy mầm thường là sau 7 ngày kể từ ngày gieo hạt

Xuyên tâm liên là cây ưa sáng hoặc có thể bị che bóng một phần trong ngày Cây ưa mọc trên ñất ẩm, khi mưa không bị ñọng nước

Nhiệt ñộ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là 22-26 °C, với lượng mưa thích hợp là 1500-2500 mm/năm

Hoa Xuyên tâm liên nở từ cành phía dưới trước, sau dần lên các cành ở ngọn

Ngược lại, khi tàn úa và tàn lụi lại bắt ñầu từ các cành ở ngọn trước

Cây ưa ñất nhẹ, cát pha, thoát nước, không chịu úng ðặc biệt, Xuyên tâm liên là cây duy nhất có thể mọc trên ñất Xecpentin - loại ñất chứa nhiều kim loại nhôm, ñồng

Thời gian ñầu cần tưới nước cho ñủ ẩm, làm cỏ, vun gốc thường xuyên Mỗi tháng bón thúc 80 – 100 kg ñạm cho 1 ha

Sâu bệnh ñối với Xuyên tâm liên không nghiêm trọng lắm, thường là do một

số sâu thông thường hại lá Do vậy cần chú ý ñể phòng tránh kịp thời

Lá ñược thu hoạch khi cây bắt ñầu ra nụ, thu hoạch toàn cây khi cây bắt ñầu

nở hoa Có thể dùng tươi hoặc phơi, sấy nhẹ cho khô rồi ñể dùng dần

2.1.1 Thành phần các hoạt chất trong Xuyên tâm liên

Xuyên tâm liên chứa hai nhóm hoạt chất chính là diterpen lacton và flavonoid

Ba chất chính thuộc nhóm diterpen lacton trong Xuyên tâm liên gồm có andrographolid, aeoandrographolid, deoxyandrographolid Hàm lượng andrographolid ở lá là 2,6 %, ở thân là 0,1 – 0,4 % Lá chứa hơn 2 % andrographolid trước khi cây ra hoa, sau ñó chỉ còn dưới 0,5 %

- Công thức phân tử: C 20 H 30 O 5

- Khối lượng phân tử : 350,449 g/mol

- Tinh thể hình phiến, không màu, vị ñắng

- Ít tan trong nước; tan trong aceton, metanol, etanol, cloroform, eter

Ngoài ra còn có homoandrographolid, deoxy-11-oxoandrographolid, deoxy-11,12-didehydroandrographolid, andrographosid, 14-deoxyandrographosid, deoxyandrographolid-19-β-D-glucosid, 14-deoxy-12-methoxyandrographolid, andrograpanin, andropanosid…

14-Các flavonoid là 7-O-methylwogonin, wogonin, oroxylin A, andrographin, paniculin, apigenin 7 – 4’ -dimethyl ethe, mono-O-methylwithtin Hai flavonoid

mới ñược xác ñịnh là 5, 7, 2’, 3’-tetramethoxyflavanon, và 5-Hydroxy-7, 2’, 3’ – trimethoxyflavon

Trong rễ có một flavanon glycosid là andrographidin, các flavon glycosid là andrographidin B, C, D, E và F

Hình 2.7: Các công thức nhóm flavonoid

Xuyên tâm liên chứa một tỷ lệ tanin khá cao, chủ yếu ở vỏ thân, vỏ cành và vỏ rễ

Ngoài ra còn có các chất khác như: Andrographan, andrographon, panicolid, eugenol, acid cafeic, nhựa, ñường khử, tinh bột…

Tóm lại, có hai hợp chất ñáng lưu ý nhất trong cây Xuyên tâm liên ñó là hợp

chất diterpen lacton trong lá, thân và flavonoid trong rễ

2.1.2 Tác dụng dược lí của Xuyên tâm liên

Y học cổ truyền Ấn ðộ và Trung Quốc ñã nghiên cứu và sử dụng Xuyên tâm liên ñể chữa rất nhiều loại bệnh Bốn tác dụng tiêu biểu của nó ñã ñược chứng minh trong các nghiên cứu lâm sàng cũng như theo kinh nghiệm y học cổ truyền trên thế

giới là: kháng viêm, thải ñộc, nâng cao sức ñề kháng, kháng vi khuẩn và vi-rút Ở

Việt Nam, trong những năm chiến tranh và những năm sau chiến tranh, khi thuốc kháng sinh tổng hợp còn rất khan hiếm, Xuyên tâm liên ñược dùng thay thế thuốc kháng sinh cho nhiều bệnh kèm theo sốt do vi khuẩn và vi-rút, ñặc biệt là các bệnh liên quan ñến ñường hô hấp, tai mũi họng

Xuyên tâm liên có vị ñắng, tính hàn Theo Dược ñiển Trung Quốc xuất bản

năm 1995, Xuyên tâm liên ñược dùng trong ñiều trị cảm cúm với sốt, viêm họng, viêm thanh quản, loét miệng, loét lưỡi, ho cấp tính hay mãn tính, viêm ruột kết, ỉa chảy, lỵ, nhiễm khuẩn ñường tiết niệu, mụn nhọt, lỡ loét, rắn ñộc cắn

Tháng 5 năm 2009, tổ chức y tế thế giới (WHO) ñưa ra liệu pháp phòng và ñiều trị cúm H1N1 có sử dụng Andrographolid, với liều dùng là 400 mg cao chiết

của Xuyên tâm liên, trong ñó có 4-6 % andrographolid, ngày dùng 3 lần (http://www.google.com.vn/search?hl=fr&q=traitement+H1N1+%2B+andrographis

&btnG=Recherche+Google&meta=&aq=f&oq=)

Theo tài liệu công bố từ báo Sài Gòn Giải Phóng, số ra ngày 29 tháng 9 năm

2007, trong chương trình phòng chống bệnh PRRS trên heo, công ty TNHH TM &

SX thuốc thú y Minh Dũng cũng ñã ứng dụng những tác dụng dược lí của Xuyên

tâm liên và một số thảo dược khác ựưa ra phác ựồ ựiều trị PRRS, ựã mang lại những

hiệu quả tắch cực, bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn ựã xác nhận kết quả này

Rễ và lá Xuyên tâm liên ựược dùng phổ biến trong y học cổ truyền Ấn độ

và nhiều vùng ở đông Nam Á, Trung Mỹ và vùng Caribe Nước sắc lá hay rễ dùng

ựể trị ựau dạ dày, lỵ, tả, cúm, viêm phế quản, làm thuốc tẩy giun và lợi tiểu

Trên thực nghiệm, Xuyên tâm liên có tác dụng chống viêm và ức chế phù chân chuột trong mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng với caragenin Có tác dụng giảm ựau nhẹ trên chuột ựược kẹp ựuôi Cao nước thô Xuyên tâm liên và các phân ựoạn n-butanol và nước gây giảm ựáng kể huyết áp ựộng mạch ở chuột cống

trắng Sprague-Dawly gây mê Andrographolid và neoandrographolid với liều

100 mg/kg khi tiêm vào phúc mạc chuột nhắt trắng có tác dụng bảo vệ gan, chống nhiễm ựộc gan do carbon tetrachlorid

Trên nghiên cứu lâm sàng, tại khoa nhi bệnh viện Quân Y 175 ựã tiến hành ựiều trị cho 20 bệnh nhân tuổi từ 16 Ờ 18 tháng bị tiêu chảy cấp tắnh Liều lượng thuốc cần dùng cho một bệnh nhân là 1 Ờ 1,5 g/ngày cho trẻ em dưới một tuổi và 1,5 Ờ 2 g/ngày cho trẻ một tuổi trở lên Kết quả ựiều trị cho thấy có 17/20 trường

hợp hết bệnh trong vòng 7 ngày

Tác dụng bảo vệ gan và tác dụng chống oxy-hoá: cao nước Xuyên tâm liên,

hợp chất andrographolid và nhiều diterpen chiết từ Xuyên tâm liên có tác dụng bảo

vệ tế bào gan chuột nhắt không bị hư hại bởi các ựộc chất như: tetraclorua carbon, paracetamol, hexacyclohexan hay terbutylhydroperoxid Ngoài ra, cao chiết Xuyên tâm liên còn có tác dụng kắch thắch hoạt ựộng của men chuyển hoá và tăng lưu

lượng mật Cao cồn 80 % Xuyên tâm liên có tác dụng tăng cường các enzym chống oxi-hoá như: Superoxid dismutase, catalase, glutathione peroxidase, cytochrom P-450 reductase và giảm LHD, giảm malonyl dialdehyd trong mô hình gây ung thư

tế bào gan (Thuốc và sức khoẻ, số 236, 15/5/2003)

Xuyên tâm liên có tác dụng ức chế các chủng vi khuẩn và nấm như:

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Shigella dysenteriae, Shigella shigae, Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans…

Dẫn xuất dehydroandrographolid succinic acid monoester từ andrographolid

có tác dụng ức chế vi-rút gây bệnh HIV ở người Andrographolid khi dùng phối hợp

với thuốc AZT, loại thuốc chống HIV quen thuộc trước ñây, có thể giảm liều dùng AZT xuống còn một nửa mà hiệu quả ñiều trị chống HIV vẫn như cũ

Cao chiết Xuyên tâm liên ñược dùng thay thế cho Streptomycin hoặc Pyrazinamid trong liệu pháp ISP phối hợp 3 thuốc Streptomycin, Isoniazid và Pyrazinamid ñể ñiều trị lao phổi và cho kết quả tốt trong ñiều trị lâm sàng

Ngoài ra, các nghiên cứu gần ñây cho thấy Xuyên tâm liên có tác dụng chống ung thư,chống oxi hóa, sốt rét và bệnh tiểu ñường

2.2 Các phương pháp chiết xuất, phân lập và ñịnh lượng hợp chất diterpen lacton

2.2.1 Các phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất diterpen lacton

Có rất nhiều phương pháp chiết xuất và phân lập diterpen lacton từ Xuyên tâm liên ñã ñược công bố Theo các nghiên cứu của Chan W.R, Taylor D.R và các

cộng sự diterpen lacton ñược tách chiết bởi cloroform và kế tiếp là etanol 95 %

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Cường và Trần Văn Sung, dung môi chiết là metanol

Theo nhóm nghiên cứu của Nguyễn Viết Tựu và các cộng sự, bột lá Xuyên tâm liên ñược ngâm kiệt trong cồn 95 %, cô thu hồi bớt cồn, rồi loại tạp bằng than hoạt Hỗn hợp lacton này ñược ñem chiết hồi lưu lần lượt với benzen, cloroform,

cồn 95 % thu ñược 3 phân ñoạn chiết Các phân ñoạn này qua tinh chế và kết tinh nhiều lần thu ñược 3 loại tinh thể của 3 diterpen lacton chính trong Xuyên tâm liên

là andrographolid, neoandrographolid, deoxyandrographolid

Một công trình ñược công bố gần ñây nhất vào năm 2000 của nhóm tác giả

M Rajani , Neeta Shrivastava và M.N Ravishankara thì phương pháp ñơn giản và nhanh chóng nhất ñể tách andrographolid - diterpen lacton chính trong Xuyên tâm liên là dùng hệ dung môi chiết diclorometan : metanol với tỉ lệ 1:1 Andrographolid

kết tinh ngay trong dịch chiết ñược thu lại, tái kết tinh nhiều lần ñể có tinh thể Andrographolid tinh khiết

2.2.2 Các phương pháp ñịnh lượng diterpen lacton

Có nhiều phương pháp ñã ñược áp dụng trong ñịnh lượng hợp chất diterpen lacton:

• Phương pháp cân khối lượng: nguyên liệu ñược chiết bằng cồn, loại tạp chất rồi cho bay hơi dung môi, sấy ñến trọng lượng không ñổi, ñem cân ñể tính phần trăm

• Phương pháp thể tích ñịnh phân: phương pháp này dựa trên nguyên

tắc các hợp chất có vòng lacton 5 cạnh không bão hòa dưới tác dụng của kiềm nóng sẽ mở vòng tạo thành muối kim loại kiềm Bằng phản ứng acid – baz, tính lượng kiềm ñã mất ñi trong quá trình phản ứng, từ

ñó suy ra tỉ lệ phần trăm hợp chất lacton

Ngoài ra còn có một số phương pháp khác như : Phương pháp so màu, ño quang phổ, thực hiện phản ứng màu rồi ño quang, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng (LC), …

• Phương pháp ño quang: là phương pháp có ñộ nhạy cao và ñặc hiệu,

hiện ñang ñược ứng dụng nhiều trong việc xác ñịnh hàm lượng các

chất

Tạo ra phức màu của chất cần xác ñịnh rồi quan sát quang phổ của hệ Phương pháp này dựa trên sự hấp thụ bức xạ ñiện từ bởi các dung dịch của chất phân tích ở cùng

một ñiều kiện, ñộ hấp thu hay mật ñộ quang sẽ tỉ lệ thuận với nồng ñộ chất hấp thụ

Mật ñộ quang của một dung dịch phụ thuộc vào nồng ñộ của chất ñó [D=f(C)] và trong

những ñiều kiện nhất ñịnh thì D = kC và tuân theo ñịnh luật Lambert-Beer

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography)

Các ứng dụng của phương pháp HPLC trong ñịnh lượng dược liệu

Phương pháp quy về 100 % diện tích (Correction normalization): trong

trường hợp không có chất chuẩn tương ứng, có thể xác ñịnh hàm lượng hợp chất tự nhiên bằng HPLC dựa vào nguyên tắc quy về 100% diện tích ñỉnh phương pháp này ñòi hỏi tất cả các chất hoà tan trong hỗn hợp ñều phải phân tích và rửa giải và phát hiện

Phương pháp dùng chất chuẩn ngoại (External standardlization): nguyên tắc

của phương pháp này là so sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích ñỉnh của mẫu thử

với chiều cao hoặc diện tích ñỉnh của một dung dịch mẫu chuẩn tương ứng có nồng

ñộ ñã biết ñây là phương pháp ñược ứng dụng phổ biến trong HPLC

Phương pháp dùng chất chuẩn nội (Internal standardlization): nhằm giảm sai

số và ñạt ñộ lặp lại cao trong phương pháp ñịnh lượng bằng HPLC, một chất chuẩn

thứ hai-ñược gọi là chất chuẩn nội-ñược thêm vào chất chuẩn ngoại và mẫu thử

Nhược ñiểm của phương pháp dùng chuẩn nội là sự phân tách sẽ khó hơn và khó tìm ñược chất chuẩn nội thích hợp

Phương pháp thêm chất chuẩn (Standard additive method): phương pháp thêm chất chuẩn ñược áp dụng trong ñịnh lượng bằng HPLC khi có ảnh hưởng của các chất phụ Ưu ñiểm của phương pháp này là loại bỏ ñược yếu tố ảnh hưởng (Các thay ñổi về nhiệt ñộ áp suất ñược bù trừ trong ñường chuẩn ñộ và không ảnh hưởng ñến kết quả ñịnh lượng), ñộ chính xác cao Tuy nhiên ñây là phương pháp khá tốn

thời gian vì phải chuẩn hoá với từng mẫu mà không chuẩn hoá ñịnh kỳ như khi áp

dụng phương pháp chuẩn ngoại

2.2.3 Các nghiên cứu gần ñây về Xuyên tâm liên

Một vài nghiên cứu về chiết xuất và ñịnh lượng diterpen lacton trong xuyên tâm liên trong nước và trên thế giới:

Bảng 2.1: Một vài nghiên cứu về chiết xuất và ñịnh lượng diterpen lacton trong xuyên tâm liên trong nước và trên thế giới

Chiết xuất phân lập bằng EtOH,

loại tạp bằng than hoạt

Phân lập với benzen,CH3Cl

Phân lập ñược AP-DP-NP

Loại tạp bằng than hoạt

ðịnh lượng diterpen lacton toàn

phần bằng ño quang

Phân lập ñược AP

Chiết xuất và phân lập AP bằng MeOH, CH3Cl, CH2Cl2-MeOH

Loại tạp bằng than hoạt ðịnh lượng AP bằng SKLM với ño quang

MeOH chiết

xuất tốt nhất

Tỉ lệ phục

hồi 95,22 %

ño quang Sử dụng phương pháp

loại màu và không loại màu bằng than hoạt

Không có sự khác biệt

giữa hai

phương pháp

Chiết xuất diterpen lacton bằng eter

dầu hoả,cloroform và MeOH Xử lí qua than hoạt

ðịnh lượng bằng HPLC cột C18 (250 mm X 4,6 mm;5 µm) Hypersil Machery pha ñộng MeOH-H2O (65:35) tốc ñộ dòng 1,0ml/phút, phát hiện PDA 223 nm

tr AP là 3,69 phút

Tỉ lệ phục

hồi từ 99,4 %

H2O(50,5:49,5) tốc ñộ dòng 1,2 ml/phút, phát hiện PDA 220nm

NP là 10,5-11,6 phút

3,2-Tỉ lệ phục

hồi từ 97-104 %

Tách ñược AP-DP-NP

tr AP-DP-NP

4,93-10,08-6,52 phút

H2O(42:58) tốc ñộ dòng 2,0 ml/phút, phát hiện PDA 220 nm

Tách ñược AP-DP-NP-DPG

tR NP-DPG là 5,69-11,34-18,90-25,34 phút

tr AP-DP-NP

5,05-10,68-5,71 phút

I.Norhayati

A.Mariam

(60:40), pH 2,8, tốc ñộ dòng 1,0 ml/ phút, phát hiện PDA 210 nm Ttừ ỉ lệ phục hồi

96 -99 %

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ðề tài “ Hoàn thiện quy trình ñịnh lượng và tách chiết diterpen lacton toàn phần

từ cây Xuyên tâm liên (Andrographolis Paniculata (Burm f.) Nees)” ñược thực

hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng 11 năm

3.1.2 Dung môi và hoá chất

Máy quang phổ UV-vis ThermoSpectronic Heλiosy

Máy ảnh OLYMPUS FE-340

Bếp ñun cách thủy, Memmert (ðức)

Tủ sấy Sanyo MOV-112 (Nhật)

Tủ nung Lenton Furnaces

Máy cô quay BUCHI R-114 (Thụy Sĩ)

Các thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng Hóa chế phẩm-Trung tâm Sâm và

Dược liệu TP HCM

3.2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu

Nguyên liệu sau thu hái bỏ phần rễ, lấy phần trên mặt ñất gồm thân, cành, lá, quả

phơi khô

Sau ñó xay nguyên liệu thành bột Bột này dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu

cũng như chiết xuất trên quy mô pilot

3.2.1.1 Xác ñịnh ñộ ẩm nguyên liệu

Dược liệu thường ñược quy về một giới hạn ñộ ẩm an toàn, quá ñộ ẩm ñó thì

dược liệu dễ bị mốc hoặc hư hỏng

Việc xây dựng chỉ tiêu ñộ ẩm cho dược liệu là xác ñịnh giới hạn cho phép của

một dược liệu ñể nó có thể giữ ñược chất lượng trong quá trình bảo quản ðộ ẩm an toàn này là thường không quá 13 % cho ña số dược liệu Một số dược liệu cụ thể có thể

có ñộ ẩm an toàn hay ñộ ẩm cho phép cao hơn hay thấp hơn.Việc xác ñịnh ñộ ẩm cũng

cần thiết khi ñịnh lượng hoạt chất trong dược liệu

Có thể xác ñịnh ñộ ẩm bằng các cách sau ñây:

• Sấy ở áp suất thường: Áp dụng với ña số các dược liệu

• Xác ñịnh ñộ ẩm bằng phương pháp cất lôi cuốn nước: Áp dụng ñối với

dược liệu chứa tinh dầu.Sử dụng một dung môi hữu cực tạo ñược với

nước một hỗn hợp ñẳng phí ñể tách nước ra khỏi dược liệu Sau khi

ngưng tụ và ñể nguội, ñọc thể tích nước ñược tách ra và tính ra hàm

lượng nước trong dược liệu Dung môi có thể dùng là xylen, toluen

• Sấy dưới áp suất giảm: Áp dụng với các dược liệu bị phân huỷ ở nhiệt ñộ cao

• Làm khô trong bình hút ẩm: Áp dụng với các dược liệu quý cần thu lại

mẫu sau khi xác ñịnh ñộ ẩm Sử dụng các chất hút mạnh như silicagel,

acid sulfuric ñậm ñặc, phosphorpentoxid, có thể có hay không sử dụng

với áp suất giảm

Ở ñây chúng tôi sử dụng phương pháp sấy khô ñể xác ñịnh ñộ ẩm của nguyên

liệu Phương pháp thực hiện như sau:

Sấy chén sứ ở nhiệt ñộ 110°C (sấy ñến khối lượng không ñổi) Sau ñó ñặt chén trong bình hút ẩm ñến khi nguội (khoảng 15 phút) và cân chén (chính xác ñến 0,0001g)

Bước tiếp theo là cân chính xác khoảng 2 g nguyên liệu cho vào chén, cũng sấy

ở nhiệt ñộ 110 °C ñến khối lượng không ñổi Làm nguội trong bình hút ẩm (khoảng 15 phút), cân

ðộ ẩm ñược xác ñịnh như sau:

1001

G G

Trong ñó: G1: Trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

G2: Trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)

• Cân chính xác khoảng 1-3 g dược liệu cho vào chén nung Trải ñều

dược liệu ở ñáy chén và ñốt cẩn thận trên bếp ñiện cho ñến khi dược

liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói

• Dùng kẹp sắt dài ñưa chén vào lò nung ở 500-600 0C (ñeo kính bảo vệ

ñến khi vô cơ hoá hoàn toàn (tro không còn màu ñen)

Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, ñể nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại trọng lượng cân

• ðặt chén nung vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt ñộ trên trong vòng 1 giờ nữa lấy chén ra, ñể nguội khoảng 30 phút trong bình hút

ẩm Cân

• Tiếp tục làm như vậy cho ñến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối

lượng chén có tro (a) chênh lệch nhau không quá 0,5 mg

• Tính kết quả

Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức:

A%: tro toàn phần của dược liệu (%)

a: Khối lượng chén có tro (g)

b: Khối lượng chén không (g)

c: Khối lượng dược liệu dùng (g)

h: ðộ ẩm của dược liệu (%)

b Xác ñịnh tro không tan trong HCl

(theo DðVN III, trang PL-129, phương pháp 2)

• Lấy chén nung ñã xác ñịnh tro toàn phần ở trên, thêm vào ñó 15 ml

nước cất và 10 ml acid hydrocloric (TT) ðậy chén bằng một mặt kính ñồng hồ, ñun sôi cẩn thận 10 phút rồi ñể nguội Rửa mặt kính ñồng hồ

với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thuỷ tinh xốp ñã cân bì hoặc vào một giấy lọc không tro Rửa (cả lọc và tro) bằng nước cất nóng cho tới khi dịch lọc cho

phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ)

• Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, ñốt, rồi nung ở

500-600 0C trong 2 giờ ðể nguội trong bình hút ẩm và cân Nung tiếp cho

%)

*(

100

*)(

h c c

b a A

−

−

tới khi giữa 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chênh lệch nhau không quá 1,0 mg

• Tính tỉ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với lượng dược

liệu ñã sử dụng

3.2.1.3 ðịnh tính sự hiện diện của diterpen lacton trong nguyên liệu

Phản ứng màu với thuốc thử Kedde

(Xác ñịnh vòng lacton 5 góc)

Lấy 2 g bột nguyên liệu cho vào erlen cùng với 20ml cồn 96 %, chiết trong bể siêu âm

Lấy dịch lọc thu ñược (dung dịch A) thực hiện phản ứng màu với thuốc thử Kedde

1ml dung dịch A cho vào 2 giọt của dung dịch 2 % acid 3, 5 - dinitrobezoic acid trong metanol (tl/tt) (Kedde A) và 2 giọt của dung dịch 5,7 % kali hydroxide trong metanol (tl/tt) (Kedde B)

Quan sát hiện tượng thấy: dung dịch A chuyển sang màu tím ñỏ, chứng tỏ trong mẫu dược liệu có hợp chất mang vòng lacton 5 góc

Sơ ñồ phản ứng màu với thuốc thử Kedde Không loại màu bằng than hoạt

Loại màu bằng than hoạt

Kedde A, Kedde B

Loại màu bằng than hoạt Dịch chiết

Dịch chiết Kedde A, Kedde B

Sơ ñồ 3.1: Phản ứng màu của dịch chiêt Xuyên tâm liên

Dịch chiết

Sắc ký lớp mỏng

Sau khi phân tích sơ bộ bằng phản ứng màu với thuốc thử Kedde, tiến hành phân tích bằng sắc ký trên lớp mỏng với chất hấp phụ là bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck)

Dịch chiết chung của khoảng 1 g dược liệu trong 10 ml etanol/30 phút, thu lấy

cắn và hoà vào ñịnh mức 50 ml với cồn tuyệt ñối Andrographolid chuẩn ñược viện

Dược liệu cung cấp Sử dụng hệ dung môi khai triển là Cloroform: Metanol (9:1), ñược cho vào bình sắc ký kín, có lót giấy bão hoà, ñặt ở nơi bằng phẳng, nhiệt ñộ ổn ñịnh

Bảng sắc ký có khoảng khai triển là 8 cm Sau khi làm khô, soi dưới tia UV (λ = 254 nm) và tiến hành phun thuốc thử anisaldehyd sulfuric ñể xác ñịnh vết chất

3.2.2 Hoàn thiện quy trình ñịnh lượng diterpen trong Xuyên tâm liên

Dựa trên các kết quả của Trần Công Luận và cộng sự (2008), Chantana Aromdee-Penkae Wichitchote-Napaporn Jantakun (công bố 18 tháng 5 năm 2005)

ðể ñáp ứng phù hợp các yêu cầu ñịnh lượng (nhanh, chính xác, dễ thực hiện, rẻ

tiền, ñộ tin cậy cao), chúng tôi ñề nghị quy trình ñịnh lượng diterpen lacton trong Xuyên tâm liên bằng phương pháp ño quang như sau như sau:

3.2.2.1 Khảo sát bước sóng hấp thu cực ñại của dịch chiết Xuyên tâm liên

Cân chính xác khơảng 1 g bột Xuyên tâm liên, chiết trong bể siêu âm với etanol

96 %, thời gian chiết là 30 phút, tỉ lệ (thể tích dung môi/ khối lượng nguyên liệu): (10/1) Dịch chiết ñược lọc bỏ bã, pha trong ñịnh mức 100 ml với etanol tuyệt ñối Hút

lấy 3 ml dịch chiết ñã pha loãng cho vào ống nghiệm, cho vào ống nghiệm vài giọt thuốc thử Kedde A, Kedde B, lắc ñều ống nghiệm Tiến hành quét phổ hấp thu của mẫu nguyên liệu trên máy ño quang ThermoSpectronic Heλiosy

3.2.2.2 Xây dựng ñường tuyến tính

Mật ñộ quang của một dung dịch phụ thuộc vào nồng ñộ của chất ñó [D=f(C)] và trong những ñiều kiện nhất ñịnh thì D = kC (tuân theo ñịnh luật Lambert-Beer) ðể xác ñịnh nồng ñộ diterpen lacton trong bột nguyên liệu, chúng tôi tiến hành xây dựng ñường chuẩn Andrographolid Các giai mẫu ñược pha trong