HOÀN THIEN QUY TRÌNH ðNH LƯNG VÀ TÁCH CHIÊT DITERPEN LACTON TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

TRƯỜNG ðẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y VÕ THẾ LÂM HỒN THIỆN QUY TRÌNH ðỊNH LƯỢNG VÀ TÁCH CHIẾT DITERPEN LACTON TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) Khoá luận tốt nghiệp Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS: TRẦN THỊ DÂN TS: TRẦN CƠNG LUẬN Thành phố Hồ Chí Minh tháng năm 2009 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gởi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường ðại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Quý thầy, cô giảng dạy khoa Chăn Nuôi Thú Y Quý thầy, cô giảng dạy khoa Dược trường ðại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Cùng tất thầy, truyền đạt kiến thức quý báu năm học vừa qua, giúp cho em hồn thành khố luận tốt nghiệp Q thầy, cô tập thể anh, chị cán Trung tâm Sâm Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em nhiều q trình thực khoá luận tốt nghiệp ðặc biệt, em xin trân trọng gởi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Trần Cơng Luận, anh Vương Nam Trung, Trần Thị Dân ñịnh hướng, tận tuỵ hướng dẫn, giúp ñỡ em suốt quãng thời gian làm ñề tài tốt nghiệp Bên cạnh ñó, xin cảm ơn người bạn, anh, chị ñã nhiệt tình giúp đỡ em ngày vừa qua Cảm ơn anh Nguyễn Sen, người anh-người cộng suốt thời gian vừa qua Cảm ơn tập thể lớp DH04DY giúp đỡ, động viên tơi vượt qua ngày tháng khó khăn Xin kính tặng ba mẹ hai em thành Tháng năm 2009 Võ Thế Lâm ii TĨM TẮT ðề tài “Hồn thiện quy trình định lượng, tách chiết diterpen lacton tồn phần Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)” ñược thực Trung tâm Sâm Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 11 năm 2008 ñến tháng năm 2009 Sử dụng kỹ thuật chiết xuất ñể tách chiết hoạt chất diterpen lacton từ Xuyên tâm liên cồn 96 % quy mô phòng thí nghiệm Tiến hành định lượng hàm lượng diterpen lacton, khảo sát so sánh phương pháp chiết mẫu Xuyên tâm liên thu hái từ vùng nguyên liệu ðồng Tháp Mười (Mộc Hoá, Long An) phương pháp đo mật độ quang • Kết thu được: ðã xây dựng phương pháp ñịnh lượng ño quang không loại màu than hoạt với dịch chiết Xuyên tâm liên Xác ñịnh ñược hàm lượng diterpen lacton mẫu dược liệu 8,82% (mẫu chiết quy mô lớn) so với khối lượng thơ phương pháp đo quang • ðưa quy trình tách chiết diterpen lacton từ Xuyên tâm liên quy mô pilot, áp dụng phương pháp chiết ngấm kiệt không liên tục, chiết lần với hiệu suất 98,234 %, hàm lượng andrographolide ñược kiểm tra dịch chiết thiết bị HPLC 1,83 % Từ khoá: Xuyên tâm liên, diterpen lacton, kỹ thuật đo quang, chiết xuất, quy mơ lớn iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ðỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC SƠ ðỒ xi Chương MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 MÔ TẢ THỰC VẬT, PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI XUYÊN TÂM LIÊN 2.1.1 Thành phần hoạt chất Xuyên tâm liên 2.1.2 Tác dụng dược lí Xuyên tâm liên 2.2 Các phương pháp chiết xuất, phân lập ñịnh lượng hợp chất diterpen lacton 11 2.2.1 Các phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất diterpen lacton 11 2.2.2 Các phương pháp ñịnh lượng diterpen lacton 12 2.2.3 Các nghiên cứu gần ñây Xuyên tâm liên 13 Chương 17 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 iv 3.1 VẬT LIỆU .17 3.1.1 Nguyên vật liệu 17 3.1.2 Dung mơi hố chất .18 3.1.3 Thiết bị .18 3.2 PHƯƠNG PHÁP 19 3.2.1 Thử tinh khiết nguyên liệu .19 3.2.2 Hoàn thiện quy trình định lượng diterpen Xun tâm liên 23 Quy trình xử lý mẫu đo quang trước loại màu 24 Phương pháp chiết Soxhlet: 27 Phương pháp ngấm kiệt: 27 Chương 31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 TIÊU CHUẨN HOÁ NGUYÊN LIỆU 31 4.1.1 ðộ ẩm .31 4.1.2 ðộ tro dược liệu 32 4.1.3 Cao toàn phần 33 4.1.4 Sự tồn Andrographolid mẫu dược liệu 33 4.2 ðỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ðO QUANG 36 4.2.1 Xây dựng ñường tuyến tính 36 4.2.2 Khảo sát phương pháp ñịnh lượng ño quang 38 4.3 KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 42 4.3.1 ðịnh tính với thuốc thử Kedde .42 4.3.2 ðịnh tính sắc kí lớp mỏng 44 4.3.3 Kết ñịnh lượng phương pháp ño quang .46 4.4 QUY TRÌNH CHIẾT PILOT 48 4.4.1 ðịnh tính sắc ký lớp mỏng 48 4.4.2 ðịnh tính với HPLC 49 4.4.3 ðịnh lượng ño quang 51 v Chương 56 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ .56 5.1 KẾT LUẬN 56 5.1.1 ðịnh lượng 56 5.1.2 Tách chiết 57 5.2 ðỀ NGHỊ .57 vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril AP : Andrographolid CHCl3 : Cloroform cm : Centimet DP : Deohydroandrographolid EtOH : Etanol g : Gam : Hecta HPLC : High Performance Liquid Chromatography HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatography IR : Infra Red kg : Kilogam LC : Liquid Chromatography µg : Microgam mg : Miligam m : Mét MeOH : Metanol mm : Milimet µl : Microlit ml : Mililit nm : Nanomet NP : Neoandrographolid OD : Optical density PDA : Photodiod Array PRRS : Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome Rf : Ratio of flow RSD : Relative standard deviation SKLM : Sắc ký lớp mỏng vii TB : Trung bình tl/tt : Trọng lượng/thể tích TNHH & TM : Trách nhiệm Hữu hạn Thương mại tR : Retention time TT : Thuốc thử UV : Ultra Violet WTO : Word Trade Organizaton viii DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ðỒ Bảng 2.1: Một vài nghiên cứu chiết xuất ñịnh lượng diterepen lacton Xuyên tâm liên nước giới 14 Bảng 3.1: Cách pha giai mẫu 24 Biểu ñồ 3.1: ðộ bền phản ứng màu 26 Bảng 4.1: ðộ ẩm mẫu dược liệu 30 Bảng 4.2: ðộ tro tồn phần tro khơng tan acid HCl 31 Bảng 4.3: Hàm lượng cao toàn phần mẫu dược liệu .32 Bảng 4.4: Mật ñộ quang mẫu chuẩn 36 Biểu đồ 4.1: ðường tuyến tính nồng độ andrographolid 37 Bảng 4.5: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần, mẫu Domesco loại màu 37 Bảng 4.6: Hàm lượng diterpen lacton tồn phần, mẫu Domesco khơng loại màu 38 Biểu ñồ 4.2: So sánh quy trình định lượng 38 Biểu ñồ 4.3: ðộ bền phản ứng màu theo thời gian 41 Bảng 4.7: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần mẫu chiết 41 Bảng 4.8: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần theo phương pháp chiết ngấm kiệt .45 Bảng 4.9: Hàm lượng diterpen lacton toàn phần theo phương pháp chiết Soxhlet 45 Bảng 4.10: So sánh tiêu phương pháp chiết 45 Bảng 4.11: Thống kê hàm lượng diterpen lacton toàn phần dịch chiết quy mô Pilot 50 Biểu ñồ 4.4: So sánh hàm lượng diterpen lacton lần chiết .52 Bảng 4.12: Hiệu suất mẫu chiết 53 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Xun tâm liên vườn dược liệu Hình 2.2: Hoa Xuyên tâm liên Hình 2.3: Biểu bì .4 Hình 2.4: Biểu bì Hình 2.5: Gân phiến Xuyên tâm liên Hình 2.6: Các cơng thức nhóm diterpen lacton Hình 2.7: Các cơng thức nhóm flavonoid Hình 3.1: Mẫu Xuyên tâm liên 17 Hình 3.2: Bình ngấm kiệt 27 Hình 4.1: Trước thêm thuốc thử Kedde .32 Hình 4.2: Sau thêm thuốc thử Kedde 32 Hình 4.3: Trước thêm thuốc thử Kedde, loại màu .33 Hình 4.4: Sau thêm thuốc thử Kedde 33 Hình 4.5: Trước loại màu 33 Hình 4.6: Sau loại màu .33 Hình 4.7: Bước sóng hấp thu dịch chiết Xun tâm liên trước loại màu 34 Hình 4.8: Bước sóng hấp thu dịch chiết Xuyên tâm liên sau loại màu .35 Hình 4.9: Dịch chiết ngấm kiệt trước thêm thuốc thử Kedde 42 Hình 4.10: Dịch chiết ngấm kiệt sau thêm thuốc thử Kedde .42 HÌnh 4.11: Dịch chiết Soxhlet trước thêm thuốc thử Kedd .43 Hình 4.12: Dịch chiết sau thêm thuốc thử Kedde 43 Hình 4.13: SKLM dịch chiết ngấm kiệt 44 Hình 4.14: SKLM dịch chiết Xuyên tâm liên dụng cụ Soxhlet .44 Hình 4.15: SKLM dịch chiết lần mẫu Xuyên tâm liên 48 Hình 4.16: Sắc ký ñồ mẫu Xuyên tâm liên .49 x Hình 4.11: Dịch chiết Soxhlet trước thêm thuốc thử Kedde Hình 4.12: Dịch chiết Soxhlet sau thêm thuốc thử Kedde 4.3.2 ðịnh tính sắc kí lớp mỏng Dịch chiết chấm bảng mỏng Silicagel GF254 (Merck), khai triển với hệ dung môi CHCl3 :MeOH (9:1), khoảng khai triển cm, bước sóng phát λ = 254 nm, thuốc thử anisaldehyd sulfuric - Phương pháp ngấm kiệt 44 C: Chuẩn andrographolid 1,2,3,4,5,6,7: Dịch chiết lần Quan sát vết chất khai triển bảng mỏng, vết chất dịch chiết thứ khơng phát λ = 254 nm, dịch chiết thứ gần khơng màu với thuốc thử anisaldehyd sulfuric C λ = 254 nm TT anisaldehyd sulfuric Hình 4.13: SKLM dịch chiết ngấm kiệt - Phương pháp Soxhlet λ = 254 nm TT anisaldehyd sulfuric Hình 4.14: SKLM dịch chiết Xuyên tâm liên dụng cụ Soxhlet 45 Tương tự với dịch chiết ngấm kiệt, vết chất dịch chiết Soxhlet sau khơng màu với thuốc thử anisaldehyd sulfuric 4.3.3 Kết ñịnh lượng phương pháp ño quang ðể kiểm tra hàm lượng diterpen lacton dịch chiết phương pháp chiết, chúng tơi định lượng diterpen lacton dịch chiết Bảng 4.8: Hàm lượng diterpen lacton theo phương pháp ngấm kiệt Dịch chiết Nồng ñộ TB (%) 3,031 2,085 1,871 0,792 0,352 0,192 0,088 Hiệu suất (%) 34,36 23,64 21,21 8,98 3,99 2,18 1,0 Trung bình (%) X = 8,41 RSD = 0,06 % e = 0,01 Bảng 4.9: Hàm lượng diterpen lacton theo phương pháp Soxhlet Mẫu Hàm lượng Hiệu suất (%) Hàm lượng diterpen lacton diterpen lacton (%) trung bình (%) 5,0058 8,68 98,41 8,68 ± 0,0145 5,0077 8,71 98,75 RSD = 0,29 ** 5,0051 8,66 98,19 e = 0,015 46 Bảng 4.10: So sánh tiêu phương pháp chiết: Phương pháp Soxhlet Ngấm kiệt Khối lượng mẫu (g) 5,0062 5,0033 Dung môi (ml) 180 60 Thời gian (giờ) Hàm lượng cao (%) 8, 97 8,42 Hàm lượng diterpen lacton (%) 8,68 8,41 98,45 ± 0,163 95,35 ± 0,142 Dịch sau chiết, Dịch chiết lần, lần ++++++- ++++++- +++++++ +++++++ Bộ dụng cụ Soxhlet Bình ngấm kiệt Hiệu suất (%) Kiểm tra: - SKLM Thuốc thử Kedde Thiết bị Dựa vào bảng theo dõi thông số phương pháp chiết Kết hợp với ñiều kiện thực tế kết định lượng mẫu dược liệu Chúng tơi đề nghị áp dụng phương pháp “ Chiết ngấm kiệt” quy mơ pilot ưu điểm sau Dễ thực nhờ thiết bị ñơn giản, phù hợp với ñiều kiện sản xuất lớn Việt Nam Tiết kiệm chi phí (Giảm dung mơi ñịnh dừng chiết dịch chiết lần thứ 6) Việc tách chiết diterpen lacton Xuyên tâm liên nên dừng lại lần chiết thứ hợp lí hiệu suất lần chiết thứ nhỏ so với tồn q trình chiết, (≤ %) so với tổng số Kết luận: Áp dụng quy trình tách chiết diterpen lacton quy mơ Pilot theo quy trình ñề nghị sau: 47 Dịch chiết Cồn 96% + Bột Xuyên tâm liên Dịch chiết Dịch chiết ðịnh lượng Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết Sơ đồ 4.2: Chiết ngấm kiệt quy mơ Pilot 4.4 QUY TRÌNH CHIẾT PILOT Dịch chiết quy mơ pilot định tính, xác định hàm lượng diterpen lacton sau lần rút 20 lít 4.4.1 ðịnh tính sắc ký lớp mỏng Hút lấy dịch chiết ml, pha lỗng định mức 50 ml Dịch pha lỗng chấm đồng lượng bảng mỏng, vết chất phát bước sóng λ = 254 nm thuốc thử anisaldehyd sulfuric 48 λ = 254 nm TT anisaldehyd sulfuric Hình 4.15: SKLM dịch chiết lần mẫu Xuyên tâm liên Quan sát SKLM, chúng tơi thấy vết chất mờ dịch chiết lần thứ 6, ñể kiểm tra hàm lượng dịch chiết, chúng tơi tiến hành định lượng hàm lượng diterpen lacton tồn phần phương pháp đo quang ñã xây dựng mục 4.2.2, trang 38 Việc pha lỗng phải phù hợp với khoảng tuyến tính nồng độ khảo sát 4.4.2 ðịnh tính với HPLC 49 5.837 mAU 1250 223nm4nm (1.00) 1000 750 500 7.867 14.546 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0min Hình 4.16: Sắc ký đồ HPLC mẫu Xun tâm liên Dựa vào sắc ký đồ, chúng tơi rút kết luận sau: Mẫu dược liệu chiết quy mơ pilot tồn đủ hoạt chất nhóm diterpen lacton là: andrographolid, neoandrographolid, deoxyandrographolid, thể ở: Tr AP: 5,837 phút, với diện tích đỉnh: 9643511 Tr NP: 7,867 phút, với diện tích đỉnh: 398829 Tr DP: 14,564 phút, với diện tích đỉnh: 1414059 Dựa vào kết Trần Công Luận cộng (Xây dựng quy trình định lượng diterpen lacton từ dược liệu Xun tâm liên kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao, tháng năm 2008), với kết ño ñược mẫu dược liệu , tiến hành tính tốn hàm lượng hoạt chất theo chuẩn riêng biệt cho chất Andrographolid theo chuẩn andrographolid với phương trình tuyến tính: Y = 52583730X , R2 = 0,9999 khoảng nồng ñộ 0,025-0,5 mg/ml (4.4.2.a) 50 Dehydroandrographolid theo chuẩn dehydrographolid với phương trình tuyến tính: Y = 34146116X , R2 = 0,9996 khoảng nồng ñộ 0,013-0,25 mg/ml (4.4.2.b) Neoandrographolid theo chuẩn neoandrographolid với phương trình tuyến tính: Y = 11962586X , R2 = 0,9996 khoảng nồng độ 0,013-0,25 mg/ml (4.4.2.c) Dựa vào cơng thức 4.4.2.a, ta có hàm lượng andrographolid: 0,1834 mg/ml 1,834 % so với dược liệu Dựa vào công thức 4.4.2.b ta có hàm lượng dehydroandrographolid: 0,0333 mg/ml 0,333 % so với dược liệu Dựa vào cơng thức 4.4.2.c ta có hàm lượng neoandrographolid: 0,0414 mg/ml 0,414 % so với dược liệu ðây tiêu ñể dự kiến xây dựng tiêu chuẩn nhóm hoạt chất diterpen lacton Xuyên tâm liên 4.4.3 ðịnh lượng ño quang ðể việc ño số OD mẫu dịch chiết dược liệu nằm khoảng tuyến tính đường tuyến tính, chúng tơi tiến hành pha lỗng dịch chiết lần chiết khác Bảng 4.11: Thống kê hàm lượng dịch chiết quy mô Pilot Kết ñịnh lượng dịch chiết Xuyên tâm liên quy mơ Pilot Dịch chiết OD Thể tích dịch thu ñược (lit) 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 0,6054 0,5991 0,6060 0,3496 0,3586 0,3468 19,950 19,950 19,950 20,038 20,038 20,038 Hàm lượng Hàm lượng Diterpen diterpen lacton lacton tính theo trung bình (%) ngun liệu (%) mẫu 1, khối lượng 20,15 kg 3,358 3,3543 3,397 3,308 1,963 1,9746 2,014 1,947 51 Hiệu suất RSD trung bình (%) (%) 38,0302 1,32 22,3873 1,77 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 5.1 5.2 5.3 6.1 6.2 6.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 5.1 5.2 5.3 6.1 6.2 6.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 0,2767 0,2684 0,2720 0,4355 0,4394 0,4272 0,2602 0,2508 0,2571 0,1321 0,1386 01390 0,5902 0,5954 0,5882 0,3490 0,3532 0,3490 0,2383 0,2351 0,2382 0,4517 0,4488 0,4560 0,2325 0,2316 0,2309 0,1425 0,1408 0,1397 0,5902 0,5882 0,5862 0,3415 0,3468 20,140 20,140 20,150 20,150 20,150 20,150 19,730 19,730 19,730 20,300 20,300 20,300 19,930 19,930 19,930 20,647 20,647 20,647 20,6 20,6 20,6 20,44 20,44 20,44 20,23 20,23 20,23 20,302 20,302 20,302 19,930 19,930 19,930 19,926 19,926 1,559 1,512 1,532 0,985 0,994 0,966 0,574 0,553 0,567 0,297 0,312 0,313 1,5343 17,3961 1,56 0,9814 11,1267 1,46 0,5647 6,4025 1,91 0,3075 3,4867 2,89 Σ 8,7168 mẫu 2, khối lượng 20,1 kg 3,288 3,2942 3,317 3,277 2,024 2,0321 2,049 2,024 1,375 1,3685 1,356 1,374 1,039 1,0400 1,032 1,049 0,540 0,5376 0,540 0,533 0,320 0,3200 0,320 0,320 Σ 8,5925 mẫu 3, khối lượng 20,25 kg 3,288 3,2770 3,277 3,266 1,897 1,9197 1,927 52 98,8296 37,3495 0,6 23,0400 0,7 15,5163 0,04 11,7915 0,81 6,0953 1,05 3,6281 0,32 97,4207 37,1538 0,33 21,7652 1,04 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 5.1 5.2 5.3 6.1 6.2 6.3 0,3483 0,2791 0,2776 0,2859 0,4813 0,4835 0,4858 0,2381 0,2371 0,2246 0,1388 0,1400 0,1365 19,926 20,087 20,087 20,087 19,939 19,939 19,939 20,434 20,434 20,434 20,220 20,220 20,220 1,935 1,561 1,552 1,599 1,072 1,077 1,082 0,541 0,537 0,510 0,310 0,315 0,305 Σ 1,5707 17,8081 1,56 1,0771 12,2123 0,46 0,5293 6,0012 3,19 0,3098 3,5121 1,61 8.6835 98,4527 so sánh hàm lượng diterpen lacton dịch chiết 3.5 2.5 1.5 0.5 lần chiết Biểu ñồ 4.4 : So sánh hàm lượng diterpen lacton lần chiết : Mẫu : Mẫu : Mẫu 53 Nhận xét: Dựa vào bảng thống kê kết mẫu chiết lần chiết, chúng tơi đưa kết luận: Kết cho thấy khơng có khác biệt mặt thống kê hàm lượng diterpen lacton mẫu chiết t1-2 = 0,5972 < t0,05 = 2,015 khác biệt mẫu khơng có ý nghĩa t1-3 = 0,2114 < t0,05 = 2,015 khác biệt mẫu khơng có ý nghĩa t2-3 = 0,3583 < t0,05 = 2,015 khác biệt mẫu khơng có ý nghĩa Hiệu suất chiết ñạt cao mẫu (98,83 %), thấp mẫu (97,42%) Hàm lượng diterpen lacton trung bình: Tính theo ngun liệu thu ñược mẫu chiết (8,66 ± 0,064) % Tính theo khơ kiệt thu mẫu chiết là: (9,32 ± 0,064) % Hiệu suất trung bình mẫu chiết: (98,23 ± 0,73) % Thể bảng tính sau: Bảng 4.12: Hiệu suất mẫu chiết Mẫu Hàm lượng diterpen lacton (%) Hiệu suất (%) X= 8,7168 X = 8,66 98,8296 8,5925 RSD = 0,74 %** 97,4207 8,6835 e = 0,01 98,4517 98,234 ± 0,42 RSD = 0,74 ** e = 0,01 Nhận xét: Hàm lượng diterpen lacton chiết ñược mẫu dược liệu cao bình chiết (8,7168 %) tương ứng với hiệu suất 98, 8296 %, thấp bình chiết (8,5925 %) tương ứng với hiệu suất 97, 4207 % Hiệu Suất trung bình bình chiết là: 98, 234 % 54 Sự khác biệt lần chiết khơng có ý nghĩa mặt thống kê, cho thấy ñây phương pháp chiết hồn tồn ổn định, triển khai áp dụng quy mơ lớn đảm bảo hiệu suất chiết, hồn tồn thực với điều kiện có đơn vị gia cơng, sở sản xuất nhỏ công ty sản xuất dược phẩm 55 Chương KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài, chúng tơi đạt ñược số kết sau: 5.1.1 ðịnh lượng Hồn thiện quy trình định lượng diterpen lacton tồn phần Khơng có khác biệt hàm lượng diterpen lacton tồn phần mẫu Xun tâm liên định lượng phương pháp đo quang có loại màu khơng loại màu than hoạt Quy trình xây dựng ñã giảm ñi giai ñoạn loại màu than hoạt, thực việc ño mật ñộ quang sau 3,5 phút cho thuốc thử Kedde vào dịch chiết, ñây khoảng thời gian đủ để thao tác xác Có thể nói, với quy trình định lượng mới, thực việc định lượng diterpen lacton tồn phần mẫu dược liệu nhanh hơn, tiết kiệm thời gian, chi phí đáp ứng độ xác, độ tin cậy Quy trình định lượng Cân xác g mẫu dược liệu xử lí sơ (loại bỏ rễ, phơi khô, cắt thân thành ñoạn nhỏ, xay qua cỡ sàng mm), chiết kiệt máy chiết siêu âm với dung môi etanol 96 %, lượng dung môi chiết theo tỉ lệ tl/tt ( 20/1), lọc dịch chiết qua giấy lọc, rửa bã dược liệu giấy lọc khơng phản ứng cho màu đỏ tím với thuốc thử Kedde Cơ dịch đến cắn, hồ tan cắn dung mơi etanol tuyệt đối (Prolabo), pha lỗng 500 lần, hút lấy ml dịch pha lỗng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 250 µl thuốc thử Kedde A, Kedde B tiến hành ño mật ñộ quang sau 3,5 phút bước sóng 56 544 nm Xác định hàm lượng diterpen lacton tồn phần theo phương trình tuyến tính sau: Y = 0,0044X + 0,0022 Y: Mật độ quang X: Hàm lượng diterpen lacton tồn phần (µg/µl) 5.1.2 Tách chiết Hồn thiện quy trình tách chiết diterpen lacton tồn phần Xun tâm liên Quy trình tách chiết quy mô pilot nên thực với phương pháp ngấm kiệt khơng liên tục, dịch chiết lấy đến lần thứ ngừng lại mà ñảm bảo thu ñược gần hoàn toàn hoạt chất diterpen lacton toàn phần mẫu dược liệu tiết kiệm chi phí, phù hợp với điều kiện có Việt Nam Quy trình tách chiết Mẫu dược liệu xử lí sơ (cắt nhỏ, phơi khơ), sử dụng phần mặt đất Xay dược liệu qua cỡ sàng mm Làm ẩm, ngâm ñến ngập mặt dược liệu etanol 96 % 24 Tiến hành xả rút dịch chiết (40 ml/phút), thu thể tích 20 lít Sau thêm 20 lít etanol 96 % vào bình ngấm kiệt, để qua ñêm xả lấy 20 lit dịch chiết Lặp lại q trình rút xả lần thứ Xả lấy dịch chiết mà thêm dung môi ðịnh lượng dịch chiết nước phương pháp ño quang 5.2 ðỀ NGHỊ Nếu ñược tiếp tục thực đề tài, chúng tơi thực hiện: • Khảo sát hàm lượng diterpen lacton toàn phần Xuyên tâm liên giai ñoạn sinh trưởng khác nhằm đưa quy trình thu hái, chế biến bảo quản Xuyên tâm liên ñể ñạt hiệu tối ưu 57 • Khảo sát hàm lượng diterpen lacton nhiều mẫu ñịa phương khác ñể từ xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu, bổ sung vào dược điển Việt Nam • Nghiên cứu định lượng hoạt chất có hàm lượng nhỏ diterpen lacton tồn phần phương pháp khác • Xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm cao chiết diterpen lacton toàn phần sử dụng làm sản phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi, nhằm tạo sở cho sản phẩm sau 58 ... andrograpanin, andropanosid… Các flavonoid 7-O-methylwogonin, wogonin, oroxylin A, andrographin, paniculin, apigenin – 4’ -dimethyl ethe, mono-O-methylwithtin Hai flavonoid ñược xác ñịnh 5, 7, 2’,... trimethoxyflavon Trong rễ có flavanon glycosid andrographidin, flavon glycosid andrographidin B, C, D, E F Wogonin Paniculin Apigenin dimethylete Eugenol Hình 2.7: Các cơng thức nhóm flavonoid Xun... ñược công bố Theo nghiên cứu Chan W.R, Taylor D.R cộng diterpen lacton ñược tách chiết cloroform etanol 95 % Theo kết nghiên cứu Nguyễn Mạnh Cường Trần Văn Sung, dung mơi chiết metanol Theo nhóm