Chuong 3. Goc tu do va chat khang oxy hoa

CHƯƠNG GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA Sự oxy hóa sức khỏe người Một điều nghịch lý sống hành tinh phân tử trì sống, oxy, phân tử quan trọng cho chuyển hóa lượng hơ hấp mà ngun nhân nhiều bệnh thối hóa Marx, Science, 235, 529-531 (1985) Tại phải học chương này? Nếu tra từ “Antioxidants” từ internet… • Sci-Finder 248,724 Articles (April 2012) • Pubmed 340,354 Hits (April 2012) • Google Search 30,500,000 Web pages (April 2012) • Chemical Abstracts 14,609 Publications (2011 alone) Sự oxy hóa khử Thuật ngữ Định nghĩa Oxidation (Sự oxy hóa) Nhận oxy Mất hydro Mất điện tử Reduction (Sự khử) Mất oxy Nhận hydro Nhận điện tử Oxidant (chất oxy hóa) Oxy hóa chất khác cách lấy điện tử, hydro, thêm oxy Reductant (chất khử) Khử chất khác cách cung cấp điện tử, hydro, loại bỏ oxy Prooxidants (Chất tiền oxy hóa) Gốc tự (Free Radicals): ▪ Phân tử có khả tồn độc lập chứa nhiều điện tử lẻ (không bắt cặp) ▪ Một phân tử với điện tử lẻ lớp R3C Carbon-centered R3N Nitrogen-centered R-O Oxygen-centered R-S Sulfur-centered Prooxidants (Chất tiền oxy hóa) Non-Radicals: ▪ Có khả oxy hóa mạnh ▪ Có khả tạo chất oxy hóa mạnh (các kim loại chuyển tiếp) H2O2 Hydrogen peroxide HOCl- Hypochlorous acid O3 Ozone 1O Singlet oxygen ONOO- Peroxynitrite Men+ Transition metals (Kim loại chuyển tiếp) Reactive Oxygen Species (ROS) (Chất chứa oxy hoạt động) Radicals: Gốc tự Non-Radicals: O2.- Superoxide H2O2 Hydrogen peroxide OH Hydroxyl HOCl- Hypochlorous acid RO2 Peroxyl O3 Ozone RO Alkoxyl 1O Singlet oxygen HO2 Hydroperoxyl ONOO- Peroxynitrite Reactive Oxygen Species (ROS) (Chất chứa oxy hoạt động) Reactive Nitrogen Species (RNS) (Chất chứa nitơ hoạt động) Radicals: NO Nitric Oxide NO2 Nitrogen dioxide Non-Radicals: ONOOPeroxynitrite ROONO Alkyl peroxynitrites N2O3 Dinitrogen trioxide N2O4 Dinitrogen tetroxide HNO2 Nitrous acid NO2+ Nitronium anion NONitroxyl anion NO+ Nitrosyl cation NO2Cl Nitryl chloride Sự oxy hóa hệ thống sinh học • Chúng ta sống điều kiện hiếu khí • Oxy ngun tố trì sống • Chúng ta sử dụng khoảng 3.5 kg oxy ngày • 2,8% oxy sử dụng để tạo gốc tự (free radicals) • Nhiều kg peroxide (tổn thương oxy hóa lipid) tạo thể ngày Khảo sát hoạt động làm gốc tự DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) in vitro y = -0,0098x + 1,6403 Độ hấp thu quang phổ (517 nm) 1,8 R2 = 0,9935 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ Trolox (µM) Đường chuẩn DPPH tính theo µM Trolox 140 160 Khảo sát khả chống oxy hóa tổng số (TAS assay) in vitro 10μL antioxidant + 490μL buffer 100mM pH 7,4 + 0,5mL dd benzoate Na 10mM + 0,2mL Fe - EDTA + ủ 37C 60 phút ủ 100C mL acid acetic 20% TBA 30 phút 0,8% NaOH Đo OD bước sóng 532 nm 0,2mL H2O2 10mM Khả chống oxy hóa tổng số antioxidant (Koracevic et al.,2000) 71 Khảo sát khả chống oxy hóa tổng số (TAS assay) in vitro 1,4 y = -0,9564x + 1,0928 Giá trị OD 1,2 R2 = 0,9858 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 Nồng độ Trolox (mM) Đường chuẩn khảo sát khả chống oxy hóa tổng số in vitro theo mM Trolox Cộng hưởng điện tử (Electron spin resonance: ESR)  Phát nhóm gốc tự có thời gian lưu tồn ngắn  Phản ứng với thuốc thử bắt giữ gốc tự  sản phẩm cộng hưởng bền vững (spin adducts)  Hằng số bắt cặp sản phẩm cộng hưởng  Cấu trúc gốc tự  DMPO (thuốc thử bắt điện tử): phát gốc tự trạng thái hoạt hóa DMPO: 5,5-dimethyl-1-pyrroline N- oxide Cộng hưởng điện tử (Electron spin resonance: ESR) • Sản phẩm cộng hưởng từ đo bước sóng thích hợp • Chất kháng oxy hóa tương tác với O2-  O2- lại phản ứng với DMPO  Nồng độ sản phẩm DMPO/O2- giảm DMPO: 5,5-dimethyl-1-pyrroline N- oxide Hệ thống HPLC-ESR Phenol chuẩn Bơm HPLC (1,0 mL/Phút) Tiêm mẫu Cột Máy đo UV Phân đoạn cao Cao chiết Nam châm Đèn halogen Buồng ESR Nam châm Máy trộn Buồng chiếu xạ UV Dung dịch Tín hiệu phổ DMPO/O2 Hiệu kháng oxy hóa Quy trình hoạt động hệ thống HPLC-ESR Thuốc thử ESR (50 L/ Phút) Kết phân tích HPLC-ESR hợp chất phenol Hình Hình sắc ký đồ HPLC-ESR ba hợp chất phenol chuẩn (a) Sắc ký đồ dung dịch Gal, Caf Cou (25 µM) bước sóng 254 nm (b) Phổ sắc ký ESR ba dung dịch nồng độ 25 µM (đường đậm), 50 (đường đứt khúc), 150 µM (đường chấm) Giá trị DMPO/O2 ghi nhận tắt đèn halogen Phổ ESR hạ thấp chứng tỏ khả kháng oxy hóa tương ứng hợp chất phenol Kết phân tích HPLC-ESR hợp chất phenol Bảng 2: Thời gian lưu giữ (phút), cường độ phổ ESR, giá trị ks hợp chất phenol Tín hiệu phổ HPLC-ESR r.ta r.tb 25d 50d 150d Gal 11,4 11,6 1,0 1,8 3,8 Caf 17,3 17,5 0,8 1,7 3,6 Cou 18,5 18,7 n.d 0,2 0,4 aThời gian lưu giữ (HPLC), bthời gian lưu giữ phổ ESR, cCường độ tín hiệu chuẩn Gal 25 µM, dnồng độ hợp chất phenol (µM), n.d (non density: tín hiệu khơng đáng kể) Hợp chất phenol tương tác với gốc tự làm giảm tín hiệu thu nhận sản phẩm cộng hưởng DMPO/O2 Kết phân tích HPLC-ESR cao chiết rau sam Nồng độ cao rau sam (4 mg/ml) a 2 b Hình Phổ sắc ký ram sam đo bước sóng 254 nm Cơ chế hình thành gốc tự (ROS) hDuox (human dual oxidase): enzyme NADPH oxidase xúc tác phản ứng hình thành gốc tự NADPH oxidase (human dual oxidase) ROS Rối loạn chuyển hóa Mơ hình ruồi giấm Cơ chế hình thành gốc tự (ROS) NADPH oxidase (human dual oxidase,) ROS Rối loạn chuyển hóa Rau sam Đánh giá khả kháng oxy hóa, ức chế enzyme NADPH oxidase Overexpression of hDuox2 GMR-GAL4 UAS-hDuox2 GAL4 gene X GMR promoter GAL4 protein hDuox2 UAS-binding site Overexpression of hDuox2 in posterior to MF of eye disc hDuox2 protein Tổng quan ruồi GMR-GAL4; UAS-hDuox2 A GMR-GAL4; UAS-hDuox2 Biểu vượt trội protein hDuox2 tăng cường chế sản sinh gốc tự  Kiểu hình mắt nhám đặc trưng B  Mơ hình cho khảo sát loại thảo dược có hoạt tính kháng oxy hóa (Anh et al., 2011) A GMR-GAL4 flies (Mắt bình thường) B GMR-GAL4; UAS-hDuox2 (Mắt nhám) Phương pháp khảo sát khả kháng oxy hóa rau sam ruồi GMR-GAL4; UAS-hDuox2 Bột nghiền cao chiết rau sam nồng độ 0, 5, 10 20% phối trộn với thức ăn nhanh (Carolina) ♂ đực 25C Kiểm tra kiểu hình mắt hệ ♀ Hiệu kháng oxy hóa rau sam xác định dựa phần giảm vùng nhám mắt ruồi Dùng phần mềm Image J để xác định diện tích mắt nhám ... Hydrogen peroxide OH Hydroxyl HOCl- Hypochlorous acid RO2 Peroxyl O3 Ozone RO Alkoxyl 1O Singlet oxygen HO2 Hydroperoxyl ONOO- Peroxynitrite Reactive Oxygen Species (ROS) (Chất chứa oxy hoạt động) Reactive... (2011 alone) Sự oxy hóa khử Thuật ngữ Định nghĩa Oxidation (Sự oxy hóa) Nhận oxy Mất hydro Mất điện tử Reduction (Sự khử) Mất oxy Nhận hydro Nhận điện tử Oxidant (chất oxy hóa) Oxy hóa chất khác... sống điều kiện hiếu khí • Oxy nguyên tố trì sống • Chúng ta sử dụng khoảng 3.5 kg oxy ngày • 2,8% oxy sử dụng để tạo gốc tự (free radicals) • Nhiều kg peroxide (tổn thương oxy hóa lipid) tạo thể