Nghiên cứu dich tễ học phân tử vi khuẩn ESCHERICHIA COLI tiết β lactamases phổ rộng kháng kháng sinh phân lập từ thực phẩm tại nha trang năm 2013 2014

Do đó, vẫn rất cần thiết có nhũng nghiên cứu từ thực phẩm tại Nha Trang nói riêng và Việt Nam nói chung nhằm phân lập vi khuấn Escherichia coỉi từ thực phấm, đánh giá hiện trạng kháng kh

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y Dược THÁI BÌNH

LÊ QUỐC PHONG

NGHIÊN CỬU DỊCH TẺ HỌC PHÂN TỦ VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI TIẾT ß-LACTAMASES PHÓ RỘNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của ricng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Học viên thực hiện luận văn

Lê Quốc Phong

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều cá nhân và tổ chức Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Y tế công cộng, PhòngQuán lý đào tạo sau đại học - Trường Đại học Y Dược Thái Bình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, triến khai đề tài nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sỹ

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Viện Pasteur Nha Trang và Trường Đại học Phủ Osaka - Nhật Bản đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các trang thiết bị máy móc phục vụ cho nghiên cứu này

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học là PGS.TS Phạm Ngọc Khái và GS.TS Yamasaki Shinji đã trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thực hiện và giúp đỡtôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Thái Bình, ngày 20 tháng 10 năm 2014

Tác giả

Lê Quốc Phong

ARN : Ribonucleic Acid

ATVSTP : An toàn vệ sinh thực phẩm

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

C : Kháng sinh cloramphenicol

CAZ : Kháng sinh ceftazidime

CAZ-C : Kháng sinh ceftazidime + clavulanic acid

CFU : Đơn vị hình thành khuấn lạc (Colony forming unit)

CIP : Kháng sinh ciprofloxacin

CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

CTX : Kháng sinh cefotaxime

CTX-C : Kháng sinh cefotaxime + clavulanic acid

CTX-M : Enzyme P-lactamase họ CTX-M

DAEC : E coìi gây kết dính lan toả (Diffuse-adherence E coli)

DEC : Diaưheagenic Escherichia coỉi (E coìi gây tiêu chảy)

dNTP : Deoxynucleotide

EAEC : E coll bám dính kết tập đường ruột (enteroaggregative E colĩ) EAST1 : Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 EHEC : E coli gây xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E coli) EIEC : E coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive E colỉ)

EPEC : E coli gây bệnh lý đường ruột (enteropathogenic E coìi)

ESBL : enzyme (3-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum p-lactamase) ETEC

: E coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E coli)

FOS : Kháng sinh fosfomycin

FOX : Kháng sinh cefocitin

GM : Kháng sinh gentamicin

ISO : International Organization for Standardization

JICA : Cơ quan Họp tác Quốc tế Nhật Bàn (The Japan Intenational

Cooperation Agency )

LT : Heat-labile enterotoxin

mARN : ARN thông tin

MEM : Kháng sinh meropenem

MH : Môi trường Muller Hinton

NA : Kháng sinh nalidixic acid

NDM-1 : New Delhi metallo-beta-lactamase

OPU : Đại học Phú Osaka - Nhật Bản (Osaka Prefecture University)PCR : Polymerase chain reaction

RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction

TEM : Enzyme ß-lactamase họ TEM

WHO : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐÊ 1

Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các nghiên cứu liên quan đến tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli sinh (3-lactamase phổ rộng trong thực phẩm 3

1.1.1 Tình hình nhiễm E coỉi ESBL trong thực phẩm 3

1.1.2 Tình hình đề kháng kháng sinh liên quan đến vi khuấn E coli có nguồn gốc từ thực phẩm 6

1.2 Các nghiên cứu dịch tề học phân tử liên quan đến vi khuấn E coli sinh p-lactamase phổ rộng trong thực phẩm 10

1.2.1 Enzym P-Iactamase phổ rộng (ESBL) 10

1.2.2 Đặc điếm dịch tễ về sự lưu hành và phát tán các ESBL 12

1.2.3 Nghiên cứu về lưu hành các phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group) của vi khuẩn E coli trong thực phẩm 14

1.2.4 Lưu hành các gen độc lực ở vi khuẩn E coli trong thực phẩm 15

Chưoug 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Địa diêm nghiên cứu 19

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.2.2 Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu 20

2.2.2.1 Phương pháp chọn mẫu 20

2.2.2.2 Cỡ mầu nghiên cứu 21

2.2.3 Kỳ thuật áp dụng trong nghiên cứu xác định các biến sổ và chỉ số • -21 2.2.3.1 Phỏng vấn 21

2.2.3.2 Kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu 22

2.2.3.3 Các kỳ thuật xét nghiệm mẫu 222.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34Chuông 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 353.1 Thực trạng nhiễm và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia colitiết ESBL trong thực phẩm 353.1.1 Thực trạng nhiễm vi khuấn Escherichia coli tiết P-lactamasc phố rộngtrong tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà 353.1.1.1 Đặc điểm nguồn gốc các mẫu thực phẩm 353.1.1.2 Phân bổ vi khuẩn Escherichia coli tiết (1-lactamase phồ rộng trongtôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang năm 2013-2014 363.1.2 Thực trạng đề kháng kháng sinh của vi khuấn Escherichia coli tiếtP-lactamase phô rộng trong tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang năm2013-2014 403.2 Đặc điểm dịch tề phân tử của các chủng vi khuẩn Escherichia coỉỉ tiếtp-lactamase phổ rộng phân lập từ thực phẩm tại Nha Trang 463.2.1 Đặc điếm kiểu gen và khả năng biểu hiện một số gcn mã hóa ESBLcúa các chủng Escherichia colỉ tiết P-lactamase phổ rộng 463.2.2.1 Đặc điểm kiểu gen mã hóa ESBL của các chủng Escherichia coiltiết P-lactamase phổ rộng (n=142) 463.2.2.2 Khả năng biểu hiện của một số mã hóa ESBL ở các chủngEscherichia coli tiết P-lactamase phố rộng 523.2.2 Đặc điếm phân nhóm dịch tề của các chủng E coli tiết P-lactamascphổ rộng trong thực phẩm 543.2.2.1 Đặc điểm phát sinh loài (Phylogenetic group) của các chủng vikhuẩn E coli tiết P-lactamase phổ rộng 543.2.2.2 Đặc điếm phân bố một số gen quy định yếu tố độc lực gây tiêuchảy của các chúng E coli ESBL phân lập từ thực phấm tại Nha Trang 593.2.2.3 Đặc điểm kiểu huyết thanh đang lua hành của một số chủng

E Cõỉi mang gen độc lực 60

Chương 4 BÀN LUẬN 63

4.1 Thực trạng nhiễm và đồ kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia col ì tiết p-lactamase phổ rộng (ESBL) trong thực phẩm (tôm nuôi, thịt lợn, thịt gà)

tại Nha Trang năm 2013-2014 63

4.1.1 Thực trạng nhiễm vi khuan Escherichia coli tiết (3-lactamase phổ rộng trong tôm nuôi, thịt lọn và thịt gà tại Nha Trang năm 2013-2014 63

4.1.1.1 Đặc điểm nguồn gốc của thịt gà, thịt lợn và tôm nuôi tại chợ Đầm-Nha Trang-Khánh Hòa 63

4.1.1.2 Phân bố vi khuẩn Escherichia coli tiết |3-lactamase phồ rộng trong tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang năm 2013-2014 64

4.1.2 Thực trạng đề kháng kháng sinh của vi khuấn Escherichia coli tiết P-lactamase phố rộng trong tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trana; 68

4.2 Đặc điếm dịch tễ phân tử cúa các chủng vi khuân Escherichia coli tiết p-lactamase phổ rộng phân lập từ thực phẩm tại Nha Trang 74

4.2.1 Đặc điểm lưu hành kiểu gen và khả năng biểu hiện một số gen mã hóa ESBL của các chủng Escherichia coli tiết p-lactamase phố rộng 74

4.2.2 Đặc điếm phân nhóm dịch tề của các chủng E coli tiết P-lactamasc phổ rộng trong thực phẩm 78

4.2.2.1 Đặc điểm phát sinh loài (Phylogenetic group) của các chủng vi khuẩn E coli tiết p-iactamase phổ rộng 78

4.2.2.2 Đặc điếm phân bố một số gen quy định yếu tố độc lực gây tiêu cháy của các chủng E coli ESBL phân lập từ thực phấm tại Nha Trang -80 4.2.2.3 Đặc điếm kiểu huyết thanh đang lun hành cúa một số chủng E coli mang gen độc lực 84

KÉT LUẬN 85

KIẾN NGHỊ 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ các mầu thực phấm nhiễm vi khuấn Escherichia coli tiết tiết P-lactamase phổ rộng (ESBL) 36

Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E colỉ ESBL giữa các mẫu lấy vào 11/2013

Bảng 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuấn E coli P-lactamase phồ rộng

có nguồn gốc từ tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang 42Bảng 3.6 Tỷ lệ các chủng E coli đa kháng kháng sinh trong thịt gà,thịtlợn

và tôm nuôi năm 2013-2014 43Bảng 3.7 Phân bố kiểu gen mă hóa ESBL trong các chùng E coli phân lập từ tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang 48

Bàng 3.8 Lưu hành kiểu gen mã hóa ESBL ở E coli phân lập từ tôm nuôi theo nguồn gốc khác nhau 50

Bảng 3.9 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuấn E coli mang kiểu genblacTx-M-1 và blacxx-M-9 51

Báng 3.10 Phân bố các subtype của gen blacrx-M trong một số chủng E coli phân lập từ thịt lợn, thịt gà và tôm nuôi tại Nha Trang 52Bảng 3.11 Khả năng biểu hiện của các gen mã hóa ESBL 53Bảng 3.12 Khả năng biểu hiện các gen mã hóa ESBL ở các chùng E coli phân lập

Bảng 3.18 Phân bố kiểu huyết thanh (serotype) của một số vi khuẩn E coli mang gen độc lực 61

E coli tiết ß-lactamase phổ rộng 40Biéu đồ 3.5 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh cúa các chủng vi khuấn E coli theothời gian 41Bicu đồ 3.6 Số lượng kháng sinh bị đề kháng ở các chủng E coỉì phân lập từtôm nuôi, thịt lợn và thịt gà tại Nha Trang 44Biểu đồ 3.7 Phân bố kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng vi khuan

E coli 45

Biểu đồ 3.8 Phân bố kiểu gen mã hóa ESBL trong các chủng E coli phân lập từ thực

phẩm tại Nha Trang, (a) phân bổ các gen blac-Tx-M, blaTEM, blaSHv;(b) phân bô các gen blacTx-M-h bla<; Tx-M-9> blacTX M-2 và blac'Tx-M-8/25 thuộc

kiểu gen blacTX M 46Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ mang đa gen mã hóa ß-lactamase ở các chủng E coli ESBLphân lập từ thực phẩm tại Nha Trang 47Bieu đồ 3.10 Tỷ lệ lưu hành kiểu gcn mã hóa ESBL ở vi khuan E coli theonguồn gốc thịt lợn (a) và thịt gà (b) 49

50

Biếu đồ 3.11 Tý lệ lưu hành các gen mã hóa ESBL theo thời gian của các chủng

E coli phân lập từ thực phẩm tại Nha Trang

Biểu đồ 3.12 Phân bố các gen các chỉ thị (genetic marker) để xác định đặc điểm phân

nhóm phát sinh loài (phylogenetic group) của vi khuấn E coli

có nguồn gốc từ tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà 54Biéu đồ 3.13 Phân bo phylogenetic group (a) và phylogenetic subgroup (b)trong các chủng E coli ESBL 55Biểu đồ 3.14 Phân bố kiểu gen mã hóa ESBL theo các nhóm E coli 58

ĐẶT VẤN ĐÈ

Các yếu tố nguy cơ từ thực phẩm và bệnh lây truyền qua thực phấm là một trong những vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu Phần lớn bệnh tật ớ người cũng là bệnh ở động vật và thực phấm có nguồngốc động vật chính là nguồn có nguy cơ nhất gây ra các bệnh dạ dày - ruột, trong đó các vi sinh vật đóng vai trò chính và trong số này, Escherichia coli là một một trong những tác nhân gây bệnh khá phổ biến ởngười và vật nuôi [2],[54], Nhiễm trùng E coli ânh hưởng đến hàng trăm nghìn người mồi năm ở Châu Âu và các nước khác Chúng không chì gây ra một số bệnh lý thông thường như nhiễm trùng đường tiết niệu,

mà còn có thế gây ncn những bệnh lý nguy hicm như nhiễm trùng máu Nghiêm trọng hơn là vi khuấn này ngày càng gia tăng khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh Một nghiên cứu ở Anh cho thấy vi khuẩn

E coỉi kháng kháng sinh ở người có hơn 50% là do lây truyền từ thực phẩm có nguồn gốc động vật và đang trớ nên là mối nguy lớn với sức khoé cộng đồng trên toàn thế giới [7], [38],

Mặt khác, vi khuẩn E coli sinh enzyme beta-lactamase phố rộng (ESBL) cũng đã được phát hiện trong các sản phấm thịt động vật và được nhận định có liên quan với việc sử dụng rộng rãi kháng sinhcephalosporin trong chăn nuôi [9], [36] E coỉỉ mang enzyme này sẽ kháng lại hầu hết các kháng sinh p-lactams, ngoại trừ cephamycins và carbapenems [4], [67], Thêm vào đó, hiện có nhiều chủng vi khuấn E coli

mang các kiểu gcn đa kháng kháng sinh và các gen này có thể được lan truyền từ thể hệ vi khuẩn này sang thế hệ vi khuẩn khác [58] Nguy hiểm hơn, các vi khuẩn E coli này còn truyền các gen kháng kháng sinhcho nhau và sang cả các loài vi khuẩn gây bệnh khác như Salmonella, shigella [67], làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh trong quần thể và gây ra những khó khăn trong điều trị lâm sàng, thậm chí là khi dùng

cả những kháng sinh thế hệ mới được cho là có tác dụng tốt Con người mang vi khuấn E coỉi sinh ESBL có thể mắc do lây truyền từ người này sang người khác, do được chọn lọc qua việc dùng kháng sinh hoặcmắc thông qua chuỗi thực phẩm không an toàn [61]

Hiện tại ở nước ta, các nghiên círu có liên quan đến sự kháng thuốc cúa vi khuấn Escherichia coli trong bệnh phấm được nhiều tác giá thông báo Tuy nhiên, có rất ít các nghiên cứu về đề kháng kháng sinhcủa vi khuấn có nguồn gốc từ thực phẩm nói chung và vi khuẩn E coli nói riêng [38] và đặc biệt các thông tin về dịch tễ học phân tử lưu hành các gen kháng kháng sinh, các gen độc lực hầu như chưa được thôngbáo Do đó, vẫn rất cần thiết có nhũng nghiên cứu từ thực phẩm tại Nha Trang nói riêng và Việt Nam nói chung nhằm phân lập vi khuấn Escherichia coỉi từ thực phấm, đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh và tìmhiểu các đặc điểm dịch tễ học phân tử của chúng, góp phần đưa ra bức tranh tổng thể dịch tề học ở mức độ phân tử bao gồm sự phân bố và biếu hiện của các gen kháng thuốc, sự lưu hành các gen độc lực, cung cấp

các thông tin cơ sở cho việc thiết lập hệ thống giám sát vi khuẩn kháng kháng sinh Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi khuẩn Escherichia coli tiết lactamases pho rộng kháng kháng sinh phân lập từ thực phẩm tại Nha Trang năm 2013-2014” với mục tiêu như sau:

Ịi-1 Mô tả thực trạng nhiễm và đề kháng kháng sinh của vi khuấn Escherichia coll tiết P-lactamasc phố rộng (ESBL) trong thực phẩm (thịt lợn, thịt gà, tôm nuôi) tại Nha Trang năm 2013-2014

2 Xác định đặc điểm dịch tễ học phân từ về kiểu phân nhóm, kiếu gen và khả năng biểu hiện của một số gen mã hóa ESBL ở các chủng Escherichia coli tiết p-lactamase phổ rộng

Chuong 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các nghiên cún liên quan đến tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli sinh p-lactamase phổ rộng trong thực phấm

1.1.1 Tình hình nhiễm E coli ESBL trong thực phẩm

Escherichia coli do Theodor Escherich (1857-1911), một nhà vi khuân học người Áo, phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 E coìi là thành viên thuộc hệ vi khuấn bình thường của đường tiêu hóa, chiếm ti

lộ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Tuy nhiên, một số loại E coli có thể sản xuất ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin), hemolysin, enzym phân hủy một số kháng sinh (p-lactamase), nên E coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu trong các tác nhân gây tiêu chảy (ETEC - Enterotoxigenic E colí), vicm đường tiết niệu (UPEC - Uropathogenic E coìi), viêm đường mật; đứng hàng đàutrong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết, viêm phối ở trẻ sơ sinh [8],

Việc E coli sán sinh ra enzyme p-lactamase phổ rộng (ESBL) cũng đồng nghĩa với việc vi khuẩn này kháng lại với kháng sinh rất mạnh đặc biệt là kháng sinh nhóm beta-lactam từ thế hệ 1 đến thế hệ 3, loạikháng sinh mà người ta đã kỳ vọng trong một thời gian dài là có khả năng diệt được các chủng vi khuấn gram (-) Ngoài ra, các plasmid mang gen ESBL còn mang kèm các gen kháng kháng sinh khác, tạo nên sựđồng kháng, chính vì vậy vi khuấn có ESBL không chỉ kháng với beta-lactam mà còn kháng với nhiều kháng sinh thuộc các nhóm khác như tetracyclin, fluoquinolon, chloramphenicol và sulfamethoxazol-trimethoprim [33]

về tình hình phân bố E coỉi tiết p-lactamase, nghiên cứu năm 2003 trên toàn thế giới thấy rằng: ớ Mỹ tỉ lệ sinh ESBL ở vi khuẩn E coli là 7%, còn ở châu Á -Thái Bình Dương, tỉ lệ đó là nhiễm E coli

ESBL trung binh là 18% Trong đó, Trung Ọuốc và Việt Nam là 2 quốc gia có tý lệ lưu hành E coli ESBL trong lâm sàng tưong đối cao, lên đến trên 50%; các quốc gia khác có tỷ lệ E coìi sinh ESBL từ 25%-50%

là Thái Lan, Singapore, Indonesia và A-Rập Saudi; Các nước có tỷ lệ E coỉi sinh ESBL thấp hơn ở mức 5-10% như Nhật Bản, Đài Loan và Hàn Quốc [41 ]

Trong thực phẩm, các nghiên cứu về E coli tiết P-lactamase phổ rộng cũng được triển khai ở nhiều nơi, trên nhiều đối tượng thực phấm khác nhau, trong đó tập trung chủ yếu vẫn là đối tượng thực phấm tươisốne như thịt và các sản phẩm từ thịt Cụ thể như sau:

Tại Pháp, theo nghiên cứu của Girlich và cộng sự (2007), từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2005 có 32/112 mẫu thịt gà nhiễm vi khuấn E coli kháng với kháng sinh ceftazidime và cefotaxime [35]

Tại Anh, một nghiên cứu vào năm 2006 đã phát hiện ra một số chúng vi khuẩn E coli ESBL trong các mẫu thịt gà nuôi tại Anh Nghiên cứu này cũng cho thấy rằng 9/27 mầu thịt gà nhập khấu và 7/40 mẫuthịt gà không rỗ nguồn gốc cũng nhiễm E coli ESBL Các mẫu thịt gà nhập khẩu từ Brazil thường xuyên phát hiện có E coli ESBL đặc biệt là các chủng mang plasmid chứa gen CTX-M E coli mang plasmid này

là khá phố biền ở Brazil nhưng lại rất hiếm gặp tại Anh Phân tích gia cầm nhập khẩu từ Nam Mỹ vào Anh cho thấy 62/210 nhiễm E coli ESBL [34],

Tại Hà Lan, nghiên cứu của Overdevest I (2011) trên các mẫu thực phẩm sống có nguồn gốc từ động vật bán lè trên thị trường nhiễm cho thấy có đến 71/89 (79,8%) các mầu thịt gà nhiễm E coli ESBL, 1/57(1,8%) thịt lợn, thịt bò là 4/85 (1,8%) Trong nghiên cứu này tác giả cũng đồng thời phân tích các mẫu phân người đang điều trị nhiễm khuấn tại Bệnh viện gần khu vực thu mẫu thịt gà cho thấy các chủng E coli từphân lập từ thịt gà và bệnh nhân có quan hệ di truyền rất giống nhau [58], Trong nghiên cứu gần đây của Geser N và cs (2012) cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm E coli tiết ß-lactamase phố rộng ờ Hà Lan trong trong thịt

gà là 77% , thịt bò 5%, thịt lợn là 2% [34]

Tại Đan Mạch, một nghiên cứu tiến hành kiểm tra thịt lợn, thịt bò và thịt gà nhập khấu cho thấy thịt gà có tỷ lệ nhiễm E coli ESBL cao nhất trong 3 sản phẩm thịt nhập khâu này (chiếm 36%) trong khi đó, tý

lệ nhiễm E coli ESBL ở thịt lợn và thịt bò ở mức 1,2% Hầu hết gà nhập khấu vào Đan Mạch có nguồn gốc từ Đức hoặc Pháp và có tới 34% gà ở Đức và 43% gà từ Pháp dương tính với E coli ESBL Trong khi đó,

gà nội địa ở Đan Mạch tỷ lệ nhiễm vi khuấn E coli ESBL tương đối thấp chỉ 3,3% điều này phản ánh mức độ sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp ở Đan Mạch thấp hơn nhiều so với Pháp và Đức [12]

Tại Tây Ban Nha, nghiên cứu cúa tác giả Doi Y (2010) cho thấy thịt bán lẻ trên thị trường cũng đã được phát hiện có vi khuẩn E coli ESBL với 67% (8/12) của mẫu thịt gà, 58% (7/12) mẫu gà tây, 25%(3/12) thịt lợn và 8% (1/12) thịt bò [28],

Tại Hà Lan, tác giả Stuart và cs (2012) nghiên cứu trên 98 mầu thịt gà và thông báo có 84% nhiễm E coli tiết ß-lactamase phố rộng [62],

Tại Nhật Bàn, một nghiên cứu của tác giả Hiroi và cs (2012), cho thấy tý lệ mang vi khuẩn E coli ESBL của gà song là 60% Nghiên cứu còn chỉ ra ràng có sự liên quan mật thiết giữa các gen kháng khángsinh giữa E coìi từ thịt gà và E coli phân lập từ các bệnh nhân [43],

Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Gundogan N và Avci E (2013) trên 75 mẫu thực phấm gồm thịt bc, thịt gà, sữa tươi và phô mai cho thấy tý lệ nhiễm E coỉi là 80% (60/75 mẫu dương tính), trong số đó có20/45 chúng E coli mang kiểu hình ESBL, chiếm tỷ lệ 44,4% , trong đó, thịt gà có tỷ lệ nhiễm E coli ESBL cao nhất [36],

Tại Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu có liên quan đến vi khuấn E coli ESBL đều tập trung trên đối tượng là các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Chẳng hạn như, nghiên cứu của tác giả Mai Văn Tuấnthực hiện từ tháng 10 - 12/2006 tại bệnh viện Trung ương Huế cho thấy ti lệ sinh ESBL là 30,4% (65/214 chủng) [21] Tác giả Hoàng Thị Phương Dung thực hiện nghiên cứu từ 7 - 12/2008 tại bệnh viện Đại học YDược Tp Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ sinh ESBL của E coỉi là 71,2% Cho đến nay, hầu như có rất ít nghiên cứu ở Việt Nam về E coti sinh ESBL có nguồn gốc thực phẩm Tác giả Van Thi Thu Hao (2007) nghiên

cứu trcn 180 mẫu thực phấm tươi sống (thịt và hải sản) tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli trong các mẫu thực phấm này rất cao, cao nhất là thịt gà là 27/30 mẫu dương tính E coli

(chiếm 99%), thịt bò là 48/50 (96%), thịt lợn là 49/50 (98%), ở hải sản là 47/50 (94%) [37], [39]

1.1.2 Tình hình đề kháng kháng sinh liên quan đến vi khuẩn E coli có nguồn gốc từ thực phấm

Trong hơn hai thập kỷ qua, sự xuất hiện và lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh đã và đang trở ncn là mối nguy lớn với sức khoè cộng đồng trên toàn thế giới Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan chođộng vật (điều trị và phòng ngừa), dùng liều thấp đế kích thích tăng trưởng đã tạo một sức ép chọn lọc làm vi khuấn kháng kháng sinh Mặt khác, do toàn cầu hóa về cung cấp thực phẩm đã làm lan truyền các vi sinhvật kháng kháng sinh và chúng được lây truyền vào người thông qua chuồi thực phẩm Ngoài ra, những nhân tố di truyền di động (mobile genetic elements) như plasmid, transposon và integron có thế lan truyền cácgcn kháng kháng sinh theo chiều dọc hoặc chiều ngang giữa các vi khuẩn Đồng thời, các nhân tố này còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triến và lan truyền của đề kháng đa kháng kháng sinh ớ vi khuan.Mặt khác, những phân tích phân tử của gen kháng kháng sinh đã cho biết vi khuấn kháng kháng sinh nhiễm trong thực phấm liên quan chặt chẽ với vi khuấn của người và sự tiếp họp giữa các vi khuẩn đã làm lantruyền gen kháng kháng sinh [7], [65],

Năm 2014, Tố chức Y tế thế giới (WHO) cũng đã tống hợp tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coỉi ở các khu vực trên thế giới đối với kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ 3 vàíluoquinolon và hầu hết các số liệu ghi nhận được ở năm 2013 và từ các dừ liệu đã được đăng tải giai đoạn 2008-2013 Theo đó, đa số các nước đã có dừ liệu giám sát và thống kê ớ cấp quốc gia về tỷ lệ đề kháng đốivới các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ 3 như ceftazidime, cefotaxime và ceftriaxone và các kháng sinh thuộc nhóm fluoquinolon [67], Cụ thể, đối với tinh hình đồ kháng cephalosporin thế hệ thứ 3:theo báo cáo cấp quốc gia ở khu vực Châu Phi (n=13 nước), tỷ lệ E coli đề kháng là 2-70%; ở châu Mỹ (n=14 nước) tỷ lệ này là 0-48%; châu Âu (n=35) 3-82%; khu vực Đông Nam Á (n=5) từ 16- 68%; khu vựcTây Thái Bình Dương (n=13) là 0-77% Tỷ lệ đề kháng ở một số nước như Mỹ 33%, Nhật 16,6%, Trung Quốc (31,3% với CAZ và 70% đối với CTX), Thái Lan 35%, Anh 9,6%, Đức 8%, Pháp 8,2% Việt Namchưa có dữ liệu ở cấp quốc gia thông báo về tình hình đề kháng của E coli đối với cephalosporin thế hệ 3 [67]

Đối với tinh hình kháng fluoquinolone, hiện đã có 84 nước có thông báo ở cấp quốc gia, như ở khu vực Châu Phi (n=14 nước) tỷ lệ E coli đề khảng là 14-71%; ở châu Mỹ (n=16 nước) tỷ lệ này là 8-58%;châu Âu (n=35) 8-48%; khu vực Đông Nam Á (n=5) 32-64%; khu vực Tây Thái Bình Dương (n=16) là 3-96% Tỷ lệ E coỉi đề kháng fluoquinolon ở một sổ nước như Ethiopia (71%); Peru 58,5%, Canada 26,9%,

Mỹ 33,3%, Morocco 75%, Pháp 17,9%, Úc 22,3%, Ý 40,5%, Đan Mạch 14,1%, Thụy Điển 20,2%, Tây Ban Nha 34,5%, Anh 17,5%, Myanma 55%, úc 10,6%, Trung Quốc 55%, Nhật 34,3%, Hàn Quốc 40,4%, TháiLan 50,9-67,2% tùy loại kháng sinh [67], Việt

Nam là một trong số ít các nước chưa có dữ liệu thông báo về tình hình đề kháng cùa E coil đối với cephalosporin thế hệ 3 ở cấp Quốc gia tuy nhiên Việt Nam cũng đã có 1 số nghiên cứu thông báo về tỷ kháng E coli đối với fluoquinolone như nghiên cứa của Oliver James Dyar O.J và Hoa N.Q & cs (2012) trên mẫu phân của 818 trẻ em 6-60 tháng tuổi tại Ba Vì cho thấy tỷ lệ E coli phân lập từ trẻ em kháng Ciprofloxacine(thuộc nhóm flouquinolon) chỉ ở mức thấp 0,2% Tuy nhiên nhóm tác giá cũng thông báo các vi khuẩn E coli này đề kháng cao với các kháng sinh khác như tetracycline (74%), co-trimoxazole (68%), ampicillin(65%), chloramphenicol (40%) và nalidixic acid (27%) [31],[67],

về vấn đề kháng kháng sinh của E coli có nguồn gốc từ thực phấm, trên thế giới đã cỏ nhiều tác giả thông báo, đặc biệt là ở một số nước có thiết lập hệ thống giám sát đề kháng kháng sinh ở vi sinh vật như

Mỹ, Anh, Pháp Theo thông báo của Tadesse D.A & cs (2012), tại Mỹ từ giai đoạn 2000- 2008, hệ thống giám sát kháng kháng sinh cấp quốc gia (viết tắt là NARMS- the National Antimicrobial ResistanceMonitoring System) đã phân tích 13521 chủng vi khuấn E coli phân lập từ thịt gà tại Mỹ cho thấy khuynh hướng đề kháng kháng sinh của E coỉi từ thịt gà trong giai đoạn 2000-2008 thay đổi tùy theo các loạikháng sinh khác nhau Chang hạn như, có sự giảm nhẹ tỷ lệ đề kháng ở một số kháng sinh như kanamycin từ 16,1% đến 10,2%; streptomycin 77,5% đến 54,6%; trimethoprim/sulfamethoxazole (17.2% đến 9.1%),tetracycline (68.4% to 47.4%) Trong khi đó, tỷ lệ kháng lại gia tăng ở các kháng sinh cefoxitin từ 7.4% năm 2000 đến 15% năm 2006; ceftriaxone tăng từ 6.3% đến 13.5% Đổi với ciprofloxacin, tỷ lệ kháng không

có sự thay đỗi (<1%) trong suốt thời kỳ này [63],

Trong nghiên cứu của tác giả Gundogan N & Avci E (2013) cho thấy trong số 45 chủng vi khuẩn E coli phân lập từ 75 mẫu thực phẩm (gồm thịt bê, thịt gà, sữa tươi và phô mai) bao gồm 30 chúng E coỉi

tiết ß-lactamase phổ rộng tại Thổ Nhĩ Kì, tỷ lệ đề kháng cao được tác giả thông báo đối với một sổ kháng sinh như ampicillin (100%), tetracycline (77,8%), cefotaxime (33,3%), ciprofloxacin (31,1%), aztroenam(28,9%); một so kháng sinh có tỷ lệ đề kháng thấp hơn là ceftazidime và ceftriaxone (8,9%), amoxicillin/clavulanic acid và gentamicin (6,7%), amikacin (4,4%) và tất cả các chủng E co/i này đều nhạy cảm với cáckháng sinh thuộc nhóm carbapenem như imipenem và ertapenem [36],

Tác giả Cook & cs (2009) cũng thông báo rằng 71% chùng E coli phân lập từ thịt gà tây ớ Canada kháng hơn 1 kháng sinh và có 18% E coil kháng từ 5 kháng sinh trở lên [25]

Khảo sát cúa tác giả Van Thi Thu Hao (2007) về khá năng đề kháng của vi khuẩn E coli phân lập từ thịt tại thành phố Hồ Chí Minh với 15 loại kháng sinh khác nhau cho thấy, phần lớn các chủng E coli nàyđều đa kháng kháng sinh và thường kháng lại các kháng sinh như tetracycline, sulphafurazole, ampicillin, amoxicillin, nalidixic acid, streptomycin, trimethoprim và chloramphenicol Trong đó, tỷ lệ khángtetracycline là 100% đối với E coli phân lập từ thịt lợn và 95% E coỉi từ thịt gà kháng sulphafurazole Sự đề kháng đối với kháng sinh ciprofloxacin - loại kháng sinh dùng khá phổ biến trong điều trị lâm sàng ởngười cũng quan sát thấy ớ E coli từ các nguồn thực phấm khác nhau (thịt gà, thịt lợn, thịt bò và nhuyễn thể), trong số đó, E coli từ thịt gà có tỷ lệ kháng cao nhất (53%) Tỷ lệ E coỉi đa kháng kháng sinh (kháng

ít nhất 3 kháng sinh thuộc 3 nhóm khác nhau) cũng được tác giả thông báo có tỷ lệ khá cao 70% [38],[39],

Nghiên cứu của Hoàng Hoài Phương & cs (2008) trên 156 chủng vi khuẩn E coil phân lập từ thực phấm (phô mai, kem, giò lụa, nem chua, giò chả, lạp xưởng, rau quả, trứng, thịt và thúy sản tươi) tại thànhphố Hồ Chí Minh cho thấy E colỉ có tỷ lệ đề kháng với tetracycline (59,6%), chloramphenicol (50%), sulfamethoxazol/trimethoprim (45,5%), ampicillin (40,4%), nalidixic acid (20,5%), ciprofloxacin (10,9%),gentamycine (9,6%) Số chủng kháng ít nhất với 1 loại kháng sinh chiếm 80,1% Tác giả cũng thông báo các chùng E coli có nguồn gốc thực phẩm này hoàn toàn nhạy cảm với kháng sinh imipencm thuộc nhómcarbapcncm [7],

1.2 Các nghiên cún dịch tễ học phân tử liên quan đến vi khuẩn E coli sinh ß-lactamase phổ rộng trong thực phẩm

1.2.1 Enzym ß-lactamase phổ rộng (ESBL)

ESBL là các ß-lactamase có khá năng thủy phân các penicillin, cephalosporin từ thế hộ I đến thế hộ III và monobactam ngoại trừ carbapenem, làm cho vi khuẩn đề kháng lại với các kháng sinh này ESBL bị

ức chế bởi các chất ức che ß-lactamasc như clavulanic acid và sulbactam Các loại ESBL khác nhau do đột biến di truyền Những thay đổi nhỏ về nucleotid dẫn đến sự thay thế axid amin này bằng axid amin kia trênvùng hoạt động của enzym ESBL, dần đến khả năng thúy phân kháng sinh khác nhau giữa các loại ESBL Các gen mã hóa enzym nhóm này thường nằm trên plasmid, điều này làm cho các gen có điều kiện lantruyền từ loài này qua loài khác hoặc trong cùng loài Hầu hết các hiện tượng đề kháng kháng sinh thường kết hợp với các yếu tổ di truyền di động như plasmid, transposon, yếu tố IS (insertion element), integron lóp

1 và integron Cơ chế đa dạng của sự truyền thông tin di truyền này góp phần phát tán các gen đề kháng một cách nhanh chóng [4], [16] Có ba loại chính của ESBL là TEM, SHV và CTX-M được xem là phổ biến

và có tầm ảnh hưởng rộng lớn nhất Các loại ESBL này vẫn không ngừng biến đổi; ngày càng tăng về số lượng và phức tạp hơn về đặc tính

• ESBL loại TEM

Các ESBL loại TEM đều bắt nguồn từ TEM-1 và TEM-2 TEM-3, tên trước đây là CTX-1 vì có hoạt tính thủy phân cefotaxim, được xác định là ß-lactamase qua trung gian plasmid phân lập từ K pneumoniae tại Pháp (1984) TEM-3 khác với TEM-2 bới sự thay thế 2 amino acid Tuy nhiên,

TEM-12 phân lập từ vi khuẩn K oxytoca tại Anh năm 1982 do gen mã hóa nằm trên plasmid mới là ESBL loại TEM đầu tiên Ngày nay, hơn 170 thành viên của loại enzym này được mô tả và các dừ liệu về lactamase vẫn được cập nhật thường xuyên [8], [24],[29],

ß-• ESBL loại SHV

Beta-lactamase loại SHV (Sulfhydryl reagent variable) xuất hiện sau loại TEM SHV-2 là loại ESBL được phát hiện đầu tiên trên vi khuẩn Klebsiella ozaenae tại Đức (1983) Đây là thể đột biến của SHV-1,ß-lactamasc dạng SHV chịu trách nhiệm cho sự đề kháng với ampicillin qua trung gian plasmid ở K pneumoniae. SHV-2 khác SHV-1 bởi thay thế một amino acid tại vị trí 238 (Gly238Ser), có khá năng thủy phân

hiệu quả cefotaxime và kém hiệu quả với ceftazidime Hiện đã phát hiện 126 thể đột biến của SHV (nguồn http://www.lahey.org/studies/) Tất cả đều bắt nguồn từ SHV-1 và khác nhau không chí ở sự hiện diện cácđột biến điếm mà còn là các đột biến mất hay đột biến chèn [4],[8],

• ESBL loại CTX-M

Các gen mã hóa enzym CTX-M được xác định có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể của một số loài thuộc giống Klnyvera, là các vi khuẩn phân lập từ môi trường và hiếm khi gây bệnh trên người [18] CTX-M-1

là ß-lactamase có khả năng thủy phân hiệu quả cefotaxim, lần đầu tiên được phát hiện tại Munich (Đức) năm 1989 trên vi khuẩn E coli. Đó là ESBL không-TEM, không-SHV với ít hơn 40% tương đồng với cácTEM và SHV [38], Một chùng vi khuẩn có thể mang gcn mã hóa đồng thời CTX-M và SHV hoặc CTX-M và AmpC, điều này có thể làm biến đổi kiểu hình đề kháng Các gen mã hóa cho CTX-M nằm trên plasmidloại IncF, loại có khả năng tiếp họp cao, có kích thước từ 50 kb đến 200 kb Gen blacrx-M được xác định nằm dưới vùng trình tự gắn chèn ISEcpl, trình tự giúp cho gen có khả năng chèn vào một đoạn ADN khác dềdàng Điều này, giúp làm rò hơn nguồn gốc của blacTXM khi có thề chuyển từ nhiễm sắc thế của vi khuẩn Kỉuyvera sang E coli [4],[8], Ngày nay, người ta đã biết hơn 90 loại CTX-M, được phân vào 5 phân nhóm,mỗi phân nhóm chứa các enzym đặc trưng (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTXM-9 và CTX-M-25) và mồi thể đột biến khác nhau ớ một hoặc vài đột biến [4],[8],

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ về sự lưu hành và phát tán các ESBL

Sự phát tán các ESBL bắt nguồn từ châu Âu sau đó lan sang châu Mỹ và các nước châu Á ESBL SHV là loại chú yếu ở châu Á vào những năm 1990, đặc biệt là SHV-5 và SHV-12 rất phổ biến ở Nhật vàHàn Quốc cho đến nay [59] ESBL loại CTX-M bắt đầu xuất hiện ở châu Âu trên các vi khuấn thuộc họ Enterobacteriaceae từ năm 1989 Với tốc độ lan truyền và gia tăng số lượng các biển thể một cách nhanhchóng, CTX-M đã thay đổi sự phân bổ ESBL trcn thế giới Các ESBL loại CTX-M ngày càng chiếm ưu thế trcn các vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là trên E coli và K pneumoniae phân lập ở các nước châu Âu, châu

Mỹ Latin và châu Á - Thái Bình Dương Ngoài ra, còn có các ESBL loại VEB, GES/IBC, PER, TLA, BES và SFO hiện diện với tỉ lệ thấp [40],

Các gen blaCTx-M (gen mã hóa cho ESBL loại CTX-M) chiếm đến 83% ở vi khuẩn E coli, trong khi blaSHv chỉ chiếm 28% và blaTHM chiếm tỉ lệ không đáng kể trong một nghicn cứu đa quốc gia trên các vikhuẩn E coli sinh ESBL năm 2008 Nghiên cứu này đã cho thấy được khuynh hướng phân bố ESBL trên thế giới, nhất là sự phân bổ rộng khắp của CTX-M-15 [40],

Enzym CTX-M-15 lần đầu tiên phát hiện ở Án Độ năm 2001, đến nay đã trở thành enzym phổ biến ở các nước châu Á và trên khắp thế giới Enzym này nằm trên các plasmid có kích thước từ 85 đến 160 kb.Hầu hết, các plasmid chứa gen blacTX M-15 cũng đồng thời mang gen blaTEM-i, bla()XA-i và aac(6')-Ib-cr aminoglycosidc 6'-N-acctyltransferasc loại Ib-cr có vai trò trong sự đề kháng với các aminoglycosid vàmột số kháng sinh thuộc nhóm íluoroquinolon [39],

Trong một nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2009 trên vi khuấn E coli mang cả AmpC và ESBL, lại cho thấy blaTEM và blaCTx-M có tần so xuất hiện cao nhất lần lượt là 77,8% và 50% Một vài chủng vi khuẩn

có thể mang một lúc đến 6 gen mã hóa P-lactamase trong đó chủ yếu là TEM-1, TEM-11, SHV-13, SHV-28, CTX-M-9, CTX-M-22, CTX-M-55, OXA-1, LEN, OKP-6 and DHA-1 Nghiên cứu cũng cho thấy rằng,các gen mã hóa cho SHV-28, CTX-M-22, CTX-M-55 dễ dàng được truyền từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác thông qua tiếp hợp Khi kiểm tra kiểu hình đề kháng kháng sinh của "vi khuẩn cho" và "vi khuẩn nhận"

đã chứng minh được đề kháng các P-lactam và aminoglycoside luôn song hành cùng nhau Ngoài ra, sự hiện diện của nhiều gcn mã hóa P-lactamasc trong cùng một chúng vi khuấn sẽ làm thay đổi kiểu hình đềkháng gây khó khăn trong việc xác định kiểu hình ESBL [39],

Nghiên cứu về phân bố các gen mã hóa ESBL ở E coli có nguồn gốc từ thực phẩm và người của tác giá Overdevest I & cs (2011) cho thấy, kiểu gen

Sự phân bố kiều gen bldcTX-M trên thế giới, số liệu năm 2009Ị40J

mã hóa ESBL phổ biến nhất ở các chủng E coli có nguồn gốc từ thịt gà là

blacTX-M-I (chiếm 58,1%, n=50), tiếp theo là kiểu gen ố/ơTEM-52 (14%, n=12) và

¿/ơshv -12(14%, n=12) Trong khi đó, ở E coli từ các mẫu phân từ bệnh nhân kiếugcn blacTx-M-1 cũng phổ biến nhất (chiếm 45,8%, n=22), tiếp theo là bla<TXM-i5(16,7%, n=8) và blaTF.M-52 (12,5%, n=6) Ớ các mầu máu bệnh nhân, thì kiểugen blaCTx-M-i4 lại chiếm tỷ lệ cao nhất (33,3%, n=8) [58]

Ở Việt Nam, có rất ít các nghiên cứu về những gen chịu trách nhiệm sinhESBL cũng như plasmid mang các gen này Một nghiên cứu năm 2001 tại các bệnhviện ớ thành phố Hồ Chí Minh, cho thấy các gcn mã hóa cho TEM, SHV, CTX-M

và VEB-1 chiếm tỉ lệ lần lượt là 76,3%, 38,1%, 25,5% và 25,5%; với sự hiện diệnđộc lập hoặc kết hợp nhiều gcn trong cùng một vi khuẩn sinh ESBL Trong đó, chủyếu là các gen mã hóa TEM-1, SHV-1, SHV-2, CTX-M-14, CTX-M-17 và VEB-1

ở các vi khuẩn E coli và K pneumoniae [19]

1.2.3 Nghiên cứu về lưu hành các phân nhóm phát sinh loài

(phylogenetic group) của vi khuẩn E coỉi trong thực phẩm

E colì là vi khuấn thuộc hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật.Một vài chủng E coli gây ra các loại bệnh lý về đường ruột và các bệnh ngoàiđường ruột như tiêu chảy, nhiễm trùng tiết nhiêu, nhiễm trùng máu và viêm màngnão ở trẻ em về đặc điếm phân nhóm phát sinh loài, vi khuấn E coli được chiathành 4 nhóm gồm: A, Bl, B2 và D [42], Các chủng E coli cộng sinh ở đường ruộtcũng như các chúng gây bệnh lý ớ đường ruột chu yếu thuộc nhóm BI và A Trongkhi, các chủng gây bệnh lý ngoài đường ruột chủ yếu thuộc nhóm B2 và một số ítthuộc nhóm D [13],[14],[23] E coli thuộc các nhóm khác nhau thường có đặcđiểm khác nhau về môi trường sinh thái, ký chủ, khả năng đề kháng kháng sinh[20], Johnson & cs [47] các chủng E coli thuộc nhóm B2 và D thường mang genđộc lực nhiều hơn các chủng thuộc nhóm A và B1 Đe xác định đặc điểm

"phylogenetic group", Clermont & cs [23] đã phát triển một phương pháp tương đốiđơn giản dựa vào kỳ thuật PCR phát hiện 3 gen chi' thị là chu A, yjaA và

TspE4.C2. Theo Carlos & es (2010), vi khuẩn E coli còn có thể được chia nhỏ vào

7 dưới nhóm "phylogenetic subgroup", gồm AO, Al, Bl, B2Ị, B23, DI và D2 dựa vào

sự kết họp của các chỉ thị di truyền này [20]

Các nghiên cứu về lưu hành các kiểu phân nhóm phát sinh loài ở vi khuấn

E coli đã được công bố nhiều nơi trên thế giới Chang hạn như nghiên cứu củaEscobar-Páramo & es (2006) tren vi khuấn E cotí phân lập từ phân gia cầm, độngvật có vú và người cho thấy: nhóm BI và D phổ biến ớ gia cầm, nhóm A và B1 phổbiến ở động vât có vú, trong khi nhóm B2 và A lại phổ biến ở người [32], Carlos c.

& cs (2010) cũng thông báo E coli thuộc nhóm B2 chủ yếu được tìm thấy ở người[20], E coỉi cộng sinh thông thường ở đường ruột chù yếu thuộc nhóm BI và A.Trong khi, các chủng gây bệnh lý ngoài đường ruột chủ yếu thuộc nhóm B2 và một

số ít thuộc nhóm D [13], [14], [15], [23],

Ở Việt Nam, chưa có thông nào về việc xác định phylogenetic group của vikhuẩn E coỉi cả trong đối tượng bệnh phẩm và thực phẩm

1.2.4 Lưu hành các gen độc lực ỏ' vi khuan E coỉi trong thực pham

Phần lớn vi khuần E coli không gây bệnh thuộc hệ vi sinh vật cộng sinhtrong ruột, một số gây bệnh lý ngoài đường ruột như viêm đường tiết niệu, nhiễmtrùng máu và một số gây các bệnh lý ở đường ruột và chúng thường gây ra cáchội chứng liên quan đến tiêu chảy

Các E coli gây tiêu chảy được chia thành 6 nhóm chính dựa trên đặc điểmlâm sàng, dịch tễ, týp huyết thanh và đặc biệt là sự có mặt cùa các yếu tố độc lực.Trong đó, các yếu tố độc lực có ý nghĩa quyết định Các nhóm này bao gồm E coli

bám dính kết tập đường ruột (enteroaggregative E coỉi - EAEC); E coli gây xuấthuyết đường ruột (enterohaemorrhagic E coli - EHEC); E coìi xâm nhập đườngruột (enteroinvasive E coli - E1EC); E coỉi gây bệnh lý đường ruột(enteropathogenic E. CƠ//-EPEC) và E coỉi sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E colỉ - ETEC) và nhóm gây kết dính lan toả (Diffuse-adherence - DAEC) [10].Trong đó, nhỏm E.coli EHEC là nhóm E.

coỉi thường xuyên gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng trên thế giới vớitýp huyết thanh đặc trưng cùa nhóm này là 0157:H7 và O104:H4 được xếp vàonhóm các vi khuẩn E.coli sán xuất độc tố Shiga (STEC) [42]

E coli thuộc nhóm ETEC: là tác nhân gây tiêu chảy (không sốt) thường gặp

ở người, lợn, cừu, dê, bò, chó và ngựa ETEC sản sinh ra 2 độc tố là LT và ST

E coli thuộc nhóm EIEC: Chi tìm thấy ở người, EIEC gây ra hội chứnggiống như bệnh lỵ trực trùng với các dấu hiệu như tiêu chảy nhiều và sốt cao;

E coli thuộc nhóm EHEC: Tìm thấy ở người, gia súc và dê Týp huyếtthanh được biết đến nhiều nhất trong nhóm này là 0157:H7 Chúng gây xuất huyếtđường ruột với triệu chứng đi tiêu chảy phân có máu và không kèm theo sốt Shigatoxin được tiết ra trong quá trình xâm nhập;

E coli thuộc nhóm EAEC: chỉ tìm thấy ở người EAEC gắn với niêm mạcruột gây tiêu chảy nước không kèm theo sốt Chúng sản sinh ra dung huyết tố(hemolysin) và độc tố ST tương tự như ETEC [68],

ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ em cácnước đang phát triển (như nước ta) nhưng không phải là yếu tố chính gây tiêu chảy

ở trẻ em các nước phương Tây ETEC là một vi khuẩn quan trọng gây ticu chảy ờngười châu Âu, nhưng lại không quan trọng bàng EAEC ở người châu Á Trong các

vi khuấn trên, EHEC được xem là một vấn nạn y tế toàn cầu, vì vi khuẩn này chính

là “thủ phạm” gây ra nhiều nạn dịch tiêu chảy trên thế giới trong thời gian 20 nămqua [10],

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, mồi nhóm E coli gây tiêu chảy cónhững yếu tố độc lực đặc thù giúp chúng có khá năng gây bệnh bằng nhiều cơ chếkhác nhau Việc phát hiện sự có mặt của các gen quy định những yếu tố này có ýnghĩa quan trọng trong xác định các E coli gây tiêu chảy, cơ chế gây bệnh, dịch tềhọc phân tử và sự kháng kháng sinh của chúng [10] Cụ thể một số gen độc lực đặctrưng của từng nhóm như sau: các gen stxỉ, S t x 2 (đặc trưng cho EHEC); gcn eaeA, bfpA, EAF (EPEC); gcn elt, e s t (ETEC); gcn irtvE (EIEC); gen eagg, astA

(EAEC ) và gen daaC (DAEC)

về phân bố gen độc lực ở vi khuẩn E coli trong thực phẩm có nguồn gốcđộng vật, một số nghiên cứu trên thế cũng đã thông báo Phần lớn các nghiên cứutập trung chủ yếu vào E coli thuộc các nhóm STEC và ETEC nhiễm trcn đổi tượngđộng vật là gia súc [37], Cụ thổ, nghiên cưu của Camcy E & cs (2006) trên 1351mầu thịt bò tại Ireland, phát hiện có 32 (chiếm 2,4%) mẫu nhiễm E coli 0157 vàtrong số đó có 31 chủng E coỉi dương tính với gen độc lực eaeA và hylA; 30/32chủng mang gen /JiCh7; 31/32 mang gen v t l hoặc V t 2 hoặc cả hai [21], Nghiên

cứu của Samadpour & cs (2006) trên 1750 mẫu thịt bò cũng cho thấy có 61 mẫudương tính với E coli thuộc nhóm EHEC (chiếm 3,5%), 20 mầu nhiễm E coli

0157 (1,1%) thuộc nhóm STEC và tác giả này cũng thông báo phát hiện 4/100 mẫunấm (4%) dương tính với E coli 0157 [60], Một số nghiên cứu khác phát hiện E coỉi thuộc nhóm ETEC trong đối tượng thực phấm cũng đã được thông báo, nhưnghiên cứu của Rasrinaul & cs (1988) hay của Olsvik & cs (1991) cũng đã thôngbáo phát hiện E coli thuộc nhóm ETEC trong sản phâm thịt gia súc [56];

Trên đối tượng các động vật như lợn và gia cầm, gần đây cũng có nghiêncứu của tác giả Kalantar E & cs (2013) trên 125 mẫu thực phẩm đông lạnh tại Iran(gồm thịt gà, cá, thịt lợn và thịt bò cho thấy tỷ lệ nhiễm E coli với tỷ lệ là 32%,trong đó số chủng E coli mang gcn stx (Shiga toxin gcn) và est (enterotoxin gen)lần lượt là 5% và 2,5% [49], Johnson J R & cs (2005) cũng thông báo phát hiệnphát hiện E coli gây bệnh ngoài đường ruột (EPEC) có mặt trong thịt và thịt gà[48],

Tại Việt Nam, nghiên cứu vi khuấn E coỉi gây tiêu chảy trên lâm sàng đượcnhiều tác giả nghiên cứu và thông báo Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân bố genđộc lực của E coỉi trên động vật sử dụng làm thực phẩm hoặc trôn thực phấm cònrất ít Một vài nghiên cứu cũng đã thông báo về gcn độc lực ở E coli trên động vậtnuôi làm thực phàm như thông báo cúa Kobayashi H & cs (2003) có 9% mẫu phânlợn tại cần Thơ nhiễm E coli EAEC và E coìi sinh độc tố shiga [50], Nghiên cứucủa Nguyền Tuấn Anh năm 2013 cho thấy, tỷ lệ lợn ở các trang trại ờ Bắc Ninhmang vi khuấn E coli là 81,4% (57/70 mầu phân lợn dương tính E coli). Các E coli này được xác định thuộc các týp huyết thanh nhóm 08, 064, o 101, 0138, 0139,

0141, 0149 Trong đó, E coli 0139 và 0141 chiếm tỷ lộ cao nhất (>40%) [11]

Tác giả Vũ Khắc Hùng và cs (2004) thấy ràng týp huyết thanh 0149 chiếm

tỷ lệ cao nhất (77%) trong tổng số 220 chùng E coli từ phân lợn được kiểm tra Tạiđồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000) xác định tỷ lệ 026 là 27,8%,tiếp đến là 0139 (13,9%) Các týp huyết thanh 0127, 0111, 0124, 0125, 0126, 086,

0149 đều chiếm tỷ lệ 8,3%, còn týp huyết thanh 055, 0128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%.Tại Tiền Giang, Nguyễn Trung Trực và cs (2004) xác định các týp huyết thanh 08,

064, 0142 0138 và 0139 là phổ biến (trong đó 0139 chiếm tỷ lệ cao nhất) TheoFairbrother (1992), các serotyp 0138, 0139, 0141 và 0149 thuộc nhóm vi khuẩnETEC và VTEC là các nhóm thường hay gặp trong các bệnh nhiễm khuẩn E coli ờ

lợn Tỷ lệ các týp huyết thanh kháng nguyên o của các chùng vi khuấn E.coli gâybệnh có thố liên quan đến yếu tố địa lý, các vùng khác nhau có thể có tỷ lệ lưu hànhtýp huyết thanh khác nhau Hơn nữa, tỷ lệ các týp huyết thanh thường có mối quan

hộ với loại bệnh và độ tuối khác nhau của lợn Nghiên cứu này góp phần khẳngđịnh rằng trong điều kiện nuôi công nghiệp vẫn có sự khác nhau về tỷ lệ lưu hànhcác týp huyết thanh kháng nguyên o cúa vi khuẩn E coli theo tuổi cúa lợn con [11],

Chưong 2

2.1 Đối tuọng, địa điếm và thòi gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tưọtig nghiên cứu

+ Thực phẩm bầy bán ở chợ Đầm - Nha Trang - Khánh Hòa gồm thịt lợn,thịt gà và tôm nuôi

+ Các chủng vi khuấn E coỉi phân lập từ thịt lợn, thịt gà và tôm nuôi

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

+ Chợ Đầm: là chợ lớn nhất tại thành phổ Nha Trang, số lượng các tiểuthương buôn bán thịt gà, thịt lợn và hải sản cũng chiếm số lượng lớn so với các chợkhác ở thành phố này Chính vì vậy đây là địa điểm được chọn lựa đế tiến hành thumầu nghiên cứu

+ Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm khu vực miền Tilingthuộc Viện Pasteur Nha Trang: Là một trong 5 trung tâm vùng về kiểm nghiệm

tự một số gen mã hóa ESBL đề xác định các biến thể.

2.1.3 Thòi gian nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu từ 10/2013 đến 10/2014

- Thời gian thu mẫu, điều tra và xét nghiệm mẫu thực phẩm tại Nha Trang:lấy mẫu và điều tra nguồn gốc mẫu vào buổi sáng các phiên chợ trong tháng11/2013 và 2/2014 Tiến hành xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm vi khuấn E coìi

ESBL ngay trong ngày thu mẫu

- Thời gian tiến hành các thí nghiệm chuycn sâu về dịch tề phân tử tạiTrường Đại học Phủ Osaka - Nhật Bán: từ 5/2014 đến 9/2014

2.2 Phương pháp nghiên cún

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả qua điều tra cắt ngang về phân bố nguồn gốc tômnuôi, thịt lợn và thịt gà tại chợ Đầm , Nha Trang, Khánh Hòa

Nghiên cứu mô tả qua phân tích mầu tại phòng xét nghiệm để xác định đặcđiềm dịch tễ học về phân bố tỷ lệ nhiễm E coìi ESBL trong các đối tượng thựcphẩm và trong cùng đối tượng thực phẩm nhưng có nguồn gốc khác nhau; thựctrạng đề kháng kháng sinh; quy luật phân bố và lưu hành một so gen mã hóa ESBLkháng kháng sinh, nhóm phát sinh loài, gen độc lực và týp huyết thanh đang lưuhành của E coli ESBL trong thực phẩm tại Nha Trang

2.2.2 Phưoìig pháp chọn mẫu và cõ‘ mẫu

2.2.2.I Phương pháp chọn mẫu

Chọn địa điểm thu mẫu: chọn chủ đích chợ Đầm (là chợ đầu mối tại thành

phố Nha Trang)

Phưong pháp chọn mẫu thực phẩm:

Mầu được thu vào tháng 11/2013 và 2/2014 Mồi tháng 175 mầu (64 mầuthịt gà, 64 mẫu thịt lợn và 47 mẫu tôm nuôi) Tại phiên chợ vào buổi sáng, tiếnhành lấy mầu toàn bộ đối với các quầy hiện có bán thịt lợn, thịt gà và tôm nuôi

n = z

14

Vì một phiên chợ sẽ không có đủ số mẫu cần lấy/loại thực phẩm do vậy sốlượng mầu xét nghiệm của từng loại sẽ được lấy tích lũy (cộng dồn) từ phiên chợnày sang phiên chợ khác cho vừa đủ cờ mẫu đã tính toán Trong quá trình thu mẫukết họp phỏng vấn người bán hàng về nguồn gốc mẫu và ghi chóp thông tin vàophiếu thu thập dữ liệu (phụ lục 1)

Đe tránh ngoại nhiễm, các mẫu được chứa đựng vào túi mầu vô trùng, dánnhãn có mã số mẫu để nhận biết và được bao quán lạnh trong thùng đựng mầu có

đá khô và vận chuyền ngay về phòng thí nghiệm vi sinh thực phấm của Trung tâmKiếm nghiệm ATVSTP khu vực miền Trung thuộc Viện Pastcur Nha Trang trongvòng 1 giờ đầu sau khi lấy mẫu

2.2.22 Cỡ mẫu nghiên cứu

Tính cỡ mầu cho xác định tỷ lệ theo công thức sau:

p ( l - p )

A2Trong đó:

Zi-o/2 là hệ số tin cậy ở ngưỡng 95% sẽ có giá trị là 1,96 p: là tý lệ nhiễm E coli ESBL trong thực phấm qua một cuộc điều tra trước, trong nghiên cứu này đã thứ nghiệm thăm dò được kết quả là 0,65

A: là độ chính xác mong muốn của p trong chọn mẫu, trong nghiên cứu nàylấy A= 0,05

n: là cỡ mẫu, qua tính toán cỡ mẫu sẽ là 350 mầu thực phấm

2.2.3 Kỹ thuật áp dụng trong nghicn cúư xác định các biến số và chỉ số

2.2.3.1 Phỏng vẩn

Tiến hành phỏng vấn các tiểu thưoưg bán lẻ tôm nuôi, thịt lợn và thịt gà bầybán tại chợ Đầm để xác định nguồn gốc các loại thực phấm này Quá trình phỏngvấn được ghi chép thông tin vào phiếu thu thập dừ liệu (phụ lục 1)

2.2.3.2 Kỹ thuật lấy mẫu và hảo quản mẫu

Người lấy mẫu được tập huấn đầy đủ về kỹ thuật lấy mẫu

Tất cả các mầu được lấy vào buổi sáng và được xử lý an toàn sinh học đảmbảo tránh ngoại nhiễm Tất cả các mẫu được đánh mã số, đảm bão cho quá trìnhtruy xuất kết quả với lý lịch mẫu

Tại mỗi quầy lấy mẫu như sau:

Đối với thịt lợn: chọn 300g thịt nạc/mẫu, không chọn phần thịt nhiều mỡđảm bảo không làm ảnh hưởng đến quá trình đồng nhất mẫu khi nuôi cấy vi khuẩn.Đối với thịt gà: chọn 500g/mầu thịt vùng bụng và vùng ngực từ 1 con gà duynhất

Đối với tôm: chỉ chọn tôm nuôi, không chọn tôm đánh bắt tự nhiên, khốilượng là 300g/mầu

Mầu được bảo quản ờ thùng lạnh trong quá trình vận chuyền về phòng thínghiệm tại Viện Pasteur Nha Trang

2.23.3 Các kỹ thuật xét nghiệm mẫu

a) Phân lập và định danh vi khuẩn Escherichia coỉi trong thực phấm

(Theo tiêu chuẩn ISO 16649-2:2001 [45])

* Nguyên lý:

Vi khuẩn ở nhiệt độ 44°c hình thành khuẩn lạc màu xanh điển hình trên môitrường tryptone-mật-glucuronid (TBX) trong các điều kiện được qui định trong tiêuchuẩn này

* Cách tiến hành:

Cân 25 g mẫu trong điều vô trùng, cho vào túi đựng mẫu vô trùng; Bổ sung

225 ml dung dịch BPW; đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 1 phút Thuđược huyền phù ban đầu 10'1; pha loãng mẫu để được các dung dịch mẫu thử 10'2,10'3, 1CT4

Cấy và ù:

Dùng pipet hoặc micropipet vô trìing chuyển 1 ml mầu thử (nếu mẫu thử ởdạng lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (10'1) (nếu sàn phẩm ớ dạngkhác) vào dĩa Pctri vô trùng, cấy hai đĩa ớ mồi độ pha loãng

Lặp lại qui trinh trên cho mồi độ pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng mộtpipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng nếu cần

Rót vào mồi đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường TBX mà trước đó đã làmnguội đến 47°c trên nồi cách thủy

Trộn cấn thận dịch cấy với môi trường và đổ ycn cho hồn hợp đông lại, đểcác đĩa petri trên mặt phẳng mát nằm ngang

Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy đến khi rót môi trường không đượcquá 15 phút

Lật ngược các đĩa và để ở tủ ấm 44°c trong khoảng từ 18h đến 24h Tổngthời gian ủ không được quá 24h

Đem các đơn vị hình thành khuân lạc:

Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các CFU điền hình của Escheríchia coli

dương tính [3-glucuronidara trên mồi đĩa thạch chửa ít hơn 150 CFU điển hình và íthơn 300 CFU tồng số (điển hình và không điển hình)

Nếu dịch cấy không thể tách riêng và không thề quan sát được các khuấn lạcđiển hình, thì các đìa chứa 0 CFU điển hình cần được xem xét theo các phươngpháp tính khác nhau

Đố có kết quá đúng, cần đếm các CFU trôn ít nhất một đĩa chứa ít nhất 15CFU màu xanh điển hình

Tính N, số lượng CFU cúa Escherichia coli dương tính P-glucuronidara cómặt trong mẫu thứ trên mL hoặc trên gam sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp sửdụng công thức:

Yìị là số đTa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất.

Vthế tích dung dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mL n 2 là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai d hộ số pha loãng tương ứng với độ pha loăng thứ nhất được giữ lại d = 1 trong trường hợp (các mẫu ở dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp

b) Xác định chùng vi khuân Escherichia coỉi mang kiêu hình ESBL

Xác định các chủng vi khuấn Escherichia co/i mang kiểu hình ESBL khángkháng sinh bàng phương pháp thử nghiệm đìa đôi [4], [8], Thử nghiệm xác nhậnđược thực hiện trên nguyên tắc tìm tác dụng hiệp lực giữa đĩa ceftazidime 30pg(CAZ) và ceftazidime/acid clavulanic 30/10 pg (CAZ-C) hoặc cefotaxime 30pg(CTX) và cefotaxim/acid clavulanic 30/10 |ig (CTX-C) Sự kết họp với chất ức chếESBL như clavulanic acid sẽ làm tăng hoạt tính của cephalosporin thể hiện bằng sựgiãn rộng của vùng kháng khuẩn Ket quà được biện luận theo hướng dẫn của CLS1(M100-S18) [24] Khi đường kính vòng kháng khuấn của đĩa ccphalosporin/acidclavulanic > 5mm so với đường kính vòng kháng khuần của đĩa cephalosporin thìchúng đó được ghi nhận là mang kiểu hình ESBL

Chuẩn bị môi trường: Môi trường Muller Hinton (MH) được chuẩn bị trong các hộp lồng với độ dày 4-5mm, bảo quán trong túi nilon kín, giữ ở 4-8°C Chuẩn bịchủng: Các chủng vi khuẩn E coli đă được định danh, thuần khiết, nuôi cấy trên thạch dinh dưỡng trong 24 giờ Hòa khuẩn lạc vi khuấn E.

Nuôi cấy: 37°c trong 18-24 giờ

Đọc kết quả: Đo đường kính vòng vô khuấn; tính hiệu số giữa đường kínhvòng vô khuấn của kháng sinh CTX-C và CTX; CAZ-C và CAZ Kết luận chùng

E coli mang kiểu hình ESBL nếu hiệu số trên >5 mm

c) Xác định kháng sinh đò của vi khuân Escherichia coll ESBL

* Nguyên lý: Sứ dụng phương pháp kirby-baucr Đây là phương pháp khoanhgiấy khuếch tán sử dụng các khoanh giấy có tẩm các loại kháng sinh khác nhau sau

đó đặt lên thạch kháng sinh sẽ khuếch tán ra môi trường xung quanh Neu vi khuẩnnhạy cảm với kháng sinh đó thì nó sẽ không mọc xung quanh khoanh giấy

Đo đường kính vòng vô khuân và đọc mức độ kháng kháng sinh theo cácmức: nhạy cảm (S); kháng (R); nhạy cảm vừa (I)

Thạch Mueller-Flinton (MF1); NaCl (0,85%); dãy độ đục chuẩn(McFarland) Chủng đối chứng sử dụng là chủng chuấn quốc tế Escherichia coli

ATCC 25922 Sử dụng khoanh giấy kháng sinh (hãng Biorad - Mỹ) của 14 loạikháng sinh gồm: Ampicillin (AM), Fosfomycin (FOS), Cefoxitin (FOX),Cefotaxime (CTX), Ceftazidime (CAZ), Meropenem (MEM), Gentamicin (GEN),Kanamycin (K), Streptomycin (S), Tetracyline (TE),

Ciprofloxacin (CIP), Chloramphenicol (C), Nalidixic acid (NA), Sulfamethoxazole-trimethoprim (SXT)

Chuẩn bị chủng vi khuấn: Dùng quc cấy vô trùng lấy 1 khuấn lạc vi khuẩn

E coli hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bàng máy trộnVortex Điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuấn tương ứng với độ đục chuẩn0,5 McFarland Thực hiện song song thử nghiệm với chúng chuẩn Quốc tế

Escherichia coli ATCC 25922 để kiểm tra chất lượng của qui trình

Láng vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller-Hinton (MH): Ria đều vi khuẩn lên mặtthạch MH bàng que tăm bông vô trùng

Đặt khoanh giấy kháng sinh: Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từngkhoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch, ủ ấm ở 37°c

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chếchuấn theo quy định cúa CLSI (M100-S18) [24], Sau đó ghi lại kết quá của từngloại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R)dựa vào tiêu chuấn đọc kết quả đường kính vùng ức chế đối với vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae của một số loại kháng sinh thử nghiệm [24]

d) Xác định lun hành gen mã hóa ESBL của các chủng Escherichia coli tiết Ịỉ-lactamase phô rộng

* Nguyên lý: sử dụng kỳ thuật Multiplex PCR để phát hiện sự lưu hành các gen

mã hóa ESBL thuộc họ blacTx-M (gôm blacxx-M-t , blacTx-M-2* blacTx-M-8 >

blacrx-M-9, blacTx-M-25); họ blaTEM và blaSHv dựa trên các cặp mồi được thiết kế đặc hiệucho các vùng gen này như sau:

Tách chiết ADN: Hút 1 mL dịch nuôi cấy qua đêm của chủng vi khuẩn trênmôi trường LB lỏng, ly tâm 1 phút ở 13000 vòng/phút, thu lấy tế bào Tiếp tục thựchiện quy trình chiết tách ADN như các bước hướng dẫn trong kit tách chiết ADN bộgen Wizard (Promega)

Thực hiện phản ứng PCR:

Bổ sung các thành phần vào ống 0,2ml gồm: 5pl đệm 10X; 0,5 pl dNTP(20 mM/loại); 2 pl MgC12 (50 mM); 1 pl mồi xuôi (10 pM); 1 pl mồi ngược (10pM); 0,3 pl Taq ADN polymerase 5 u/pl; ADN khuôn mẫu 1 (.li (100 ng); bôsung nước cât vừa đủ 50 pl

Đưa vào máy PCR để thực hiện phản ứng khuếch đại theo chương trìnhnhiệt như sau: 1 chu kỳ (95°c/l phút); 30 chu kỳ (94°C/30 giây, 57°C/30 giây,72°c/l,5 phút); 1 chu kỳ 72°C/3 phút; bảo quản ở 4°c

Sản phấm PCR sau đó được điện di trôn gel agarose 1% ở 120 V trong 60phút và được đọc kết quã bằng máy chụp gel Gel-Doc (Biorad)

*Giài trình tự một số gen mã hóa ESBL để xác định các hiến thể (subtype) đang lưu hành:

TEM-781R

5GGTCGCCGCATACACTATTCTC-3’ 5 TTTATCCGCCTCC ATCC AGTC-3 ’

186 bp

Ghi chú: F: mồi xuôi; R: mồi ngược * Cách tiến hành:

Sàn phấm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kít Qiagen - Mỹ được chạy phánứng PCR giải trình tự bằng bộ kít BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequence Kítcủa hãng Applied Biosystem với thành phần phản ứng như sau: lpl BigDye; 2 pỉdung dịch đệm 5X; 0,5 pl mồi xuôi hoặc mồi ngược (10 |iM); 5-20ng ADN mụctiêu; nước cất vừa đủ lOpl Đưa vào máy PCR thực hiện phán úng theo chươngtrình nhiệt như sau: 1 chu kỳ 96°c/l phút; 25 chu kỳ gồm 96°c/10 giây, 50°C/5giây, 60°C/4 phút; giử ở 4°c.

Sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự được tủa với ethanol, EDTA vànatri oxalate theo các bước sau : Cho vào mồi ống eppendorf 4 pl dung dịch dừngphản ứng (gồm 2 (rì NaOH 3M, pH 5,2 và 2 pl EDTA 100 mM, pH 8,0); chuyền

10 pl sản phẩm PCR giải trình tự vào ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch dừngphản ứng và trộn kỳ; thêm 70 pi ethanol lạnh 95% và trộn kỹ, ly tâm với tốc độ

13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Sau đó loại bỏ dịch nổi Rứa tủa 2 lần, mỗilần với 200 pi ethanol lạnh 70% Ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 15phút ở 4°c Loại bở dịch nổi Làm khô bằng máy hút chân không trong 15 phút.Hòa tan tủa ADN trong 10 pl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (AppliedBiosystem) ù ở nhiệt độ phòng trong 15 phút đế ADN tan hoàn toàn và đưa vàomáy giải trình tự

Trình tự ADN được xác định bằng máy giải trình tự tự động SequencerAB1 3100-Mỹ (tại Trường Đại học Phủ Osaka - Nhật Bản) Sau đó, trình tựADN được phân tích bàng phần mềm BioEdit và so sánh với các trình tự đã đượccông bố trên ngân hàng gen (Genbank) của NCBI

e) Xác định khả năng hiểu hiện của một số gen mã hóa ESBL

Gen mã hóa ESBL khi biểu hiện sẽ trải qua quá trình sao mã tổng hợpARN thông tin (mRNA) sau đó thông qua quá trình dịch mã đề tồng họp nên cácprotein enzyme (trong trường họp này chính là các enzyme P-lactamase khángkháng sinh) Vì vậy, đề biết được gen mã hóa ESBL có biểu hiện hay không thì sẽtiến hành xác định sự có mặt mRNA của chính gcn đó

Chuấn bị canh khuẩn E coli: vi khuẩn E coli ESBL được nuôi cấy trêncanh thang MH trong 24h; điều chinh nồng độ vi khuẩn đến 5,0.10x CFU/ml(OD600 = 1)

Tách chiết ARN: Tách chiết ARN tù’ các chủng vi khuẩn E coli ESBLđược thực hiện theo quy trình bộ kít "RNeasy"Mini Kit (50)" của Hãng QIAGEN.Tổng họp cDNA từ mRNA của vi khuẩn E coli ESBL: theo quy trình bộkít của hăng TAK.ARA - Nhật Bán

Xác định các gen mã hóa ESBL từ cDNA bằng phán úng PCR: sử dụng kỳthuật multiplex PCR đã được mô tả ở mục 2.2.5.4

Đánh giá kết quả: Các gen có biếu hiện là các gen cho kết quá khuếch đạidưong tính từ cDNA

f) Xác định đặc điếm phân nhỏm dịch tễ của các chủng E coỉi tiết lactamase phô rộng

fj-* Xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (Phylogenetic group) [23]

Vi khuẩn Escherichia coli được xếp vào 4 nhóm phát sinh loài chính đó là

A, BI, B2 và D Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của vi khuẩn E coli đượcxác định bằng kỳ thuật multiplex PCR dựa trên 3 gen chỉ thị đó CluiA, YjiA vàTSPE4.C2 với trình tự mồi được thiết kế đặc hiệu cho các gen này như sau: gen

chuA gồm 2 mồi ChuA.l (5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3') và ChuA.2

(5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3'); gen YjaA gồm 2 mồi là YjaA.l TGAAGTGTcAGGAGACGCTG-3') và YjaA.2 (5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3'); gen TspE4C2 gồm 2 mồi TspE4C2.1 (5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3'); TspE4C2.2 (5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3')

Thực hiện phản úng PCR với các thành phần sau: Nước cất 1 pl 1 ox Ex

Tag Buffer, 0,8 pi dNTP, 0,4 pi Primer mix, 0,05pl Takara Ex Tag. Trong đó,primer mix gồm 10 pi ChuAl, 10 pi ChuA2, lOpl YjaA.l, lOpl YjaA.2, 10 pi

TspE4C2.1, 1 Opl TspE4C2.2,40pl TE buffer

Chưong trình phản ứng PCR như sau: 1 chu kỳ (98°C/5 phút); 35 chu kỳ

(98°c/l 0 giây, 57°C/30 giây, 72°C/30 giây); 1 chu kỳ 72°C/7 phút; giử ở 4°c.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, ớ 100V trong thời gian

45 phút Đọc kết quả điện di trên máy Geldoc - Biorad (Mỹ)

Đánh giá kết quá: dựa vào sự có mặt của các gen chuA, YjaA và TspE4C2

để xác định phân nhóm như sau: 1

Áp dụng kỳ thuật lai khuẩn lạc (colony hybridization) được mô tả bởi MoselyS.L và cs (1980) [52] có bổ sung và cải tiến cúa Trường Đại học Phủ Osaka - NhậtBản ADN của vi khuẩn E coli được lai với ADN của các gen độc lực (gọi là probe)

đã được đánh dấu phóng xạ 32p, mầu dương tính sẽ phát ra tín hiệu phóng xạ và đượcghi lại bằng phim X-quang

Tạo các mầu dò (probe - ADN của các gen độc lực): Tạo mầu dò cho 11

gen độc lực gồm s t X i , S Í X2, eaeA, hfpA, EAF, elt, est, invE, eagg, astA và

daaD đại diện cho 6 nhóm E coli gây tiêu cháy là EHEC, EPEC, ETEC, EAEC,EIEC, DAEC bàng kỳ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng chocác gcn này

Cụ thế như sau: gen 57x1, Stx2 (sử dụng mồi VT-com-Ul:

GAACGAAATAATTTATATGTG và VT-com-Dl: TGATGATGACAATTCAGTAT); gen eaeA (EAE1: A A AC AGGT GA A ACT GTTGCC và gen EAE2 : CTCTGCAGATTAA CCTCTGC);

1 Xác định lưu hành các gen độc lực liên quan đến khả năng gây tiêu chảy ờ vikhuẩn E coli tiết p-lactamase phổ rộng phân lập từ thực phẩm

gen bfpA (BfpA-f: AATGGTGCTTGCTTGCGCTTGCTGC và BfpA-r: GCCGCTTTAT CCAACCTGGTA); gen EAF (EAF-f: CAGGGTAAAAGAAGATGATAA và EAF-r: TATGGGGACCATGTATTATCA; gen est (Est-f: ATTTTTMTTTCTGTATTRT CTT và Est-r: CACCCGGTACARGCAGGATT); gen elt GGCGACAGATTATAC CGTGC và Elt-r.

CGGTCTCTATATTCCCTGTT); gen astA (AstA-f: CACAGTATATCCG AAGGC và AstA-r:

CGAGTGACGGCTTTGTAG); gen Eagg (Eagg-f: CTGGCGA AAGACTGTATCAT và Eagg-r: CAATGTATAGAAATCCGCTGTT); gen daaD (daaD-f: TGAACGGGAGTATAAGGAAGATG và daaD -r: GTCCGCCATCACATCAAAA); gen inveE (lnvE-f: AGTTCTCGGATGCTATGCTC và InvE-r: CAAGATTTAACCTTCGT CAAC).

Lai khuẩn lạc của 142 chung E coli với 11 gen độc lực sẽ được đánh dấuphóng xạ 32P theo sơ đồ sau:

Lai với mẫu dò (probe) đánh dấu

gen cần tìm ADN được cố định trên màng

- Ly trích ADN của các khuấn

này bằng NaOH-SDS

- Cố định ADN vừa ly trích lên

Kết quả trên phim X quang

* Xác định týp huyết thanh (serotype) của các chủng E co/i mang gen độc lực

Vi khuẩn E coỉi được xác định týp huyết thanh với 185 kháng nguyên thân (O) và 56 kháng nguyên lông (H) bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh Phương pháp xác định kháng nguyên O:

Chuẩn bị kháng nguycn o từ vi khuẩn E coli: Hòa sinh khối vi khuẩn E coìi vào ống nghiệm chứa 5ml NaCl 0,85%; hấp áp suất ở 121 °c/15 phút Ly tâm900g/20 phút, loại bở dịch nồi, thu cặn và hòa cặn vào 5ml NaCl 0,85% và sửdụng làm kháng nguyên cho phản ứng ngưng kết với kháng thể

Thực hiện phán ứng ngưng kết huyết thanh nhóm O: Chuẩn bị các ốngchứa lOOpl kháng nguyên đã chuẩn bị ở trên, bố sung 2 giọt kháng thể nhóm o

Thực hiện phản ứng ngưng kết huyết thanh nhóm H: Chuẩn bị các ốngchứa lOOpl kháng nguyên đã chuấn bị ớ trên, bố sung 2 giọt kháng thể nhóm H

ủ 50°c trong nồi hấp cách thủy trong 1 giờ Phản ứng ngưng kết nếu xuất hiện cáckết tủa dạng hạt

Nhận định kết quả:

Kết quả ngưng kết vói kháng huvết

thanh O-đa giá (O-polyvalent sera)

Bưóc thực hiện tiếp theo

Bất kỳ O-polyvalent nào dương tính

Xác định ngưng kết với các kháng thể 0 đơn giá tương ứng

Tất cả 0- đa giá đều âm tính

Không xác định týp huyết thanh 0 với các kháng thể nhóm 0 hiện có

Kết quả ngưng kết vói kháng huyết

thanh O-đoti giá (O-monolyvalent sera)

Bước thực hiện tiếp theo

Một trong những kháng huyết thanh đơn gia

dương tính

Xác định chúng E coli dương tính với kiếu huyết thanh nhóm 0 này

Nhiều kháng huyết thanh đơn gia dương tính So sánh nồng độ kháng the tối thiếu ngưng kết

kháng nguyên của các nhóm 0- đơn giá (O-antibody titer)

Kháng huyết thanh O-đơn giá nào ngưng kết ở nồng

độ thấp nhất sẽ được chọn

Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Chưoìig 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu

3.1 Thực trạng nhiễm và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli tiết ESBL trong thực phẩm

3.1.1 Thực trạng nhiễm vi khuẩn Escherichia coli tiết ß-lactamase phổ

rộng trong tôm nuôi, thịt lọn và thịt gà

Nhận định kết quả

Kết quả ngưng kết vói kháng huyết

thanh H

Bước thực hiện tiếp theo

Một kháng huyết thanh H - đon giá

Kết quả ngưng kết với kháng huyết

thanh H-đon giá (H- monolyvalent

sera)

Bước thực hiện tiếp theo

Một trong những kháng huyết thanh

đơn giá dương tính

Xác định chủng E coli dương tính vớikiểu huyết thanh nhóm E1 này

Nhiều kháng huyết thanh đơn giá

dương tính

So sánh nông độ kháng thê tôi thiêu ngưngkết kháng nguyên của các nhóm H- đon giá(antibody titer)

Không có kháng huyết thanh H nào

dương tính

Chủng E coli không di động (H )

3.1.1.1 Đặc điểm nguồn gốc các mẫu thực phẩm

Biếu đồ 3.1: Phân bố đặc điếm nguồn gốc thịt lọn (a), thịt gà (b) và tôm

nuôi (c) bán tại chợ Đầm - Nha Trang

Kết quả phân tích 350 phiếu điều tra thông tin về nguồn gốc thịt lợn, thịt

gà và tôm nuôi cho thấy:

Đối với thịt lợn: 28,9% có nguồn gốc từ huyện Diên Khánh; 22,7% từhuyện Cam Lâm; 20,3% tù’ huyện Ninh Hòa và 16,4% từ các hộ nuôi ớ các xãthuộc thành phố Nha Trang Tuy nhiên có đến 11,7% mẫu thịt lợn không biết rõ

về nguồn gốc (Biếu đồ 3.la)

Đối với thịt gà: nguồn gốc tại huyện Diên Khánh chiếm tỷ lệ cao nhất(36,7%), tiếp đến là thành phố Nha Trang (21,1%) và phần còn lại có nguồn gốc

từ một số địa phưcmg khác như huyện Cam Lâm (14,8%), huyện Ninh Hòa(13,3%), có 14,1% mẫu không biết rỏ nguồn gốc (Biếu đồ 3.2b)

Đối với tôm: có nguồn gốc từ các vùng nuôi tôm trong tính như từ huyệnNinh Hòa (35,1%), thành phố Nha Trang (22,3%), huyện Cam Lâm (14,9%) vàhuyện Cam Ranh (25,5%) Có 2,1% không biết rõ nguồn gốc (Biểu đồ 3.2c)

3.1.1.2 Phân bố vi khuẩn Escherichia coli tiết ß-Iactamase phổ rộng

trong tôm nuôi, thịt lọn và thịt gà

Bảng 3.1 Tỷ lệ các mẫu thực phẩm nhiễm vi khuấn Escherichia coli

Kct quá báng 3.1 cho thấy tỷ lộ mẫu thực phẩm dương tính với vi khuẩn

E co/i ESBL là 40,6% Trong đó tỷ lệ nhiễm E coli ESBL ở tôm nuôi, thịt gà vàthịt lợn tại Nha Trang khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Trong đó, thịt gà

có tỷ lệ dương tính cao nhất (65,6%), thịt lợn và tôm nuôi có tỷ lệ nhiễm E coỉi

ESBL ít hơn, lần lượt là 36,7% và 11,7%

Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli ESBL giữa các mẫu lấy

vào 11/2013 và 2/2014

Bảng 3.2 cho thấy, tỷ lệ nhiễm E coli ESBL khi so sánh giữa tháng tháng11/2013 và 2/2014 cùng không có sự khác biệt đáng kề ở thịt lợn và tôm nuôi Riêngđối với thịt gà, tỷ lệ nhiễm ờ tháng 11/2013 (78,1%) cao hơn so với 2/2014 (53,1%),

sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05

tiết tiết ß-lactamase phổ rộng (ESBL)

Mầu thực Số mẫu xét Dương tính E coli ESBL p

ESBL

%

Số mầudương tính E.