Xác định độc tố acid okadaic, DTX1 và DTX2 trong một số nhuyễn thể vỏ hai mảnh vỏ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG Mã sinh viên: 1201180 XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ ACID OKADAIC, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG Mã sinh viên: 1201180 XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ ACID OKADAIC, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Tống Thị Thanh Vƣợng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, với giúp đỡ tận tình nhà trƣờng, thầy cô bạn bè, em hoàn thành khóa luận Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tống Thị Thanh Vƣợng tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến suốt trình thực đề tài viết khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Hóa phân tích – Độc chất tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh đƣợc thiếu sót Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy cô bạn Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Trần Thị Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I – TỔNG QUAN .2 1.1 Giới thiệu sơ lƣợc nhuyễn thể 1.2 Giới thiệu độc tố sinh học biển 1.3 Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy DSP 1.3.1 Cấu trúc 1.3.2 Nguồn gốc 1.3.3 Tính chất lý hóa 1.3.4 Độc tính 1.3.6 Các phƣơng pháp hay dùng để xác định DSP 1.4 Phƣơng pháp LC-MS/MS .11 1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) 12 CHƢƠNG – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 15 2.2.1 Nguyên vật liệu 15 2.2.2 2.3 Thiết bị 15 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 2.4.1 Chuẩn bị mẫu 16 2.4.2 Khảo sát xây dựng phƣơng pháp 18 2.4.3 Ứng dụng phƣơng pháp 21 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 21 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Thông số MS/MS 22 3.2 Điều kiện sắc kí lỏng 23 3.2.1 Chọn pha tĩnh 23 3.2.2 Chọn pha động 23 3.3 Thẩm định phƣơng pháp 25 3.3.1 Tính đặc hiệu 25 3.3.2 Xác định khoảng tuyến tính 28 3.3.3 Độ lặp lại độ thu hồi 30 3.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng .31 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADAM 9-anthryldiazomethane 9-anthryldiazomethan ASP Amnesic Shellfish Poisoning Mất trí nhớ ngộ độc nhuyễn thể APCI APPI AOAC Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học áp suất khí Ionization Atmospheric Pressure Ion hóa photon áp suất Photonization Ionization khí Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân tích Communites thức AZA Azaspiracid CE Collision Energy Năng lƣợng va chạm CAV Cell Accelerator Voltage Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Tiêu chảy ngộ độc nhuyễn thể DTX1 Dinophysistoxin-1 DTX2 Dinophysistoxin-2 ELISA Enzyme-linked immune sorbent Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ assay liên kết enzym ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography LC- Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ hai lần MS/MS mass spectrometry LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng MBA Mouse BioAssay Thử nghiệm chuột MS Mass spectrometry Khối phổ MU Mouse unit Đơn vị chuột Tỉ số khối lƣợng điện tích m/z NRC National research coucil Hội đồng nghiên cứu quốc gia NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning Độc thần kinh ngộ độc nhuyễn thể OA Okadaic acid PP Protein Phosphatase PTX Pectenotoxin PSP Paralytic Shellfish Poisoning Liệt ngộ độc nhuyễn thể PSU Practical salinity units Đơn vị độ mặn R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal to noise Tỉ số tín hiệu nhiễu YTX Yessotoxin Enzym phosphatase DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Báo cáo trƣờng hợp bị ngộ độc nhuyễn thể .3 Bảng 1.2 Các nhóm liên kết phân tử khối acid okadaic (OA) dinophysistoxins (DTXs) Bảng 1.3 Một số tính chất lý hóa OA DTXs Bảng 1.4 Giới hạn hàm lƣợng độc tố DSP phƣơng pháp phát theo quy định số nƣớc khu vực .6 Bảng 1.5 Giới hạn phát DSP số kit ELISA thƣơng mại Bảng 1.6 Một số nghiên cứu gần .10 Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn 15 Bảng 2.2 Các mẫu thu thập địa điểm lấy mẫu .16 Bảng 2.3 Bảng pha dung dịch hỗn hợp 18 Bảng 3.1 Các thông số hoạt động nguồn ion hóa 22 Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh chất phân tích 22 Bảng 3.3 Ion mẹ ion độc tố nhóm DSP 26 Bảng Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 28 Bảng 3.5 Độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp xác định OA 30 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp xác định DTX1 30 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp xác định DTX2 31 Bảng 3.8 LOD, LOQ độc tố nhóm DSP 31 Bảng 3.9 Kết phân tích độc tố DSP mẫu sò .33 Bảng 3.10 Kết phân tích độc tố DSP mẫu hàu .33 Bảng 3.11 Kết phân tích độc tố DSP mẫu ngao .34 Bảng 3.12 Kết phân tích độc tố DSP mẫu vẹm .34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acid okadaic (OA) dinophysistoxins (DTXs) Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 12 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc máy khối phổ MS 13 Hình 1.4 Mô hình phân tích tứ cực 14 Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 17 Hình 3.1 Phổ khối ion OA DTX2 23 Hình 3.2 Phổ khối ion DTX1 23 Hình 3.3 Sắc kí đồ tỉ lệ pha động 45:55 24 Hình 3.4 Sắc kí đồ tỉ lệ pha động 35:65 24 Hình 3.5 Sắc kí đồ tỉ lệ pha động 25:75 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn .26 Hình 3.7 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn OA 26 Hình 3.8 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn DTX2 .27 Hình 3.9 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn DTX1 .27 Hình 3.10 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp DSP 27 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ OA 28 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX1 29 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX2 29 Hình 3.14 LOD OA, DTX2 DTX1 .32 Hình 3.15 LOQ OA, DTX2 DTX1 .32 Hình 3.16 Mẫu hàu Thanh Hóa 07/11/2016 35 Hình 3.17 Mẫu sò Thanh Hóa 07/11/2016 .35 Hình 3.18 Mẫu hàu Thanh Hóa 20/11/2016 35 Hình 3.19 Mẫu sò Thanh Hóa 08/12/2016 .36 Hình 3.20 Mẫu hàu Thanh Hóa tháng 2/2017 36 Hình 3.21 Mẫu ngao Nam Định 07/11/2016 36 Hình 3.22 Mẫu vẹm Sài Gòn 11/11/2016 37 Hình 3.23 Mẫu hàu Thanh Hóa 31/03/2017 37 140 y = 1.3551x - 4.426 R = 0.9982 Diện tích pic (cps.min) 120 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (ppb) Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX1 DTX2 160 y = 1.4407x - 2.8943 R = 0.9980 Diện tích pic (cps.min) 140 120 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (ppb) Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX2 Nhận xét: đƣờng hồi quy thẳng hệ số tƣơng quan 0,995 ≤ R ≤1 khoảng nồng độ khảo sát, chứng tỏ có tuyến tính nồng độ chất phân tích với diện tích pic chất phân tích Do vậy, đƣờng chuẩn dựng chấp nhận đƣợc 29 3.3.3 Độ lặp lại độ thu hồi Thêm chuẩn vào mẫu âm tính nồng độ khác (10, 40, 80 ng/mL) Tiến hành chiết phân tích mẫu nồng độ lần để đánh giá độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp Kết phân tích thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.5 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định OA STT 10 ng/ml 40 ng/ml 80 ng/ml Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) 10,2 102,0 39,5 98,8 77,4 96,8 11,0 110,0 37,9 94,8 79,0 98,8 10,2 102,0 40,3 100,8 80,6 100,8 11,0 110,0 34,7 86,8 75,1 93,9 11,0 110,0 37,1 92,8 75,1 93,9 9,4 94,0 36,3 90,8 73,5 91,9 TB 104,7 94,1 96,0 SD 6,0 4,7 3,1 RSD(%) 5,7 5,0 3,2 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX1 STT 10 ng/ml 40 ng/ml 80 ng/ml Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) 10,3 103,0 39,0 97,5 76,7 95,9 10,3 103,0 39,0 97,5 71,5 89,4 11,0 110,0 38,3 95,8 80,4 100,5 10,3 103,0 37,6 94,0 78,9 98,6 10,3 103,0 36,1 90,2 75,9 94,9 11,0 110,0 39,8 99,5 82,6 103,2 TB 105,3 95,7 97,1 SD 3,3 3,0 4,4 RSD(%) 3,1 3,1 4,5 30 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX2 STT 10 ng/ml 40 ng/ml 80 ng/ml Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) Nồng độ R (%) 10,5 105,0 37,5 93,8 73,6 92,0 11,2 112,0 38,9 97,2 72,2 90,2 9,8 98,0 38,2 95,5 73,6 92,0 11,2 112,0 35,4 88,5 70,8 88,5 10,5 105,0 36,1 90,3 72,2 90,2 9,8 98,0 38,2 95,5 71,5 89,4 TB 105,0 93,5 90,4 SD 5,7 3,1 1,2 RSD(%) 5,4 3,3 1,3 Nhận xét: Theo qui định hội đồng châu Âu (AOAC) [7], với chất phân tích mức nồng độ 10 – 100 ng/mL (ppb), giá trị RSD (%) chấp nhận mức ≤ 15% độ thu hồi phải đạt từ 60-115% Từ kết cho thấy độ thu hồi độc tố nhóm DSP dao động khoảng 86,8% đến 112,0% tùy theo nồng độ hệ số biến thiên dao động khoảng 1,3% đến 5,7% Nhƣ vậy, phƣơng pháp xây dựng cho độ lặp lại độ thu hồi đáp ứng theo yêu cầu AOAC 3.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng Chúng sử dụng chuẩn hỗn hợp nồng độ ng/mL tiến hành pha loãng mẫu thực không chứa chất phân tích để khảo sát LOD LOQ phƣơng pháp, xác định dựa tỉ số S/N Kết thu đƣợc bảng 3.8 Bảng 3.8 LOD, LOQ độc tố nhóm DSP OA DTX1 DTX2 LOD (ng/g nhuyễn thể) 0,75 0,75 0,75 LOQ (ng/g nhuyễn thể) 2,5 2,5 2,5 31 Hình 3.14 LOD OA, DTX2 DTX1 Hình 3.15 LOQ OA, DTX2 DTX1 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế Chúng áp dụng phƣơng pháp để phân tích độc tố nhóm DSP số mẫu thu thập tỉnh Thanh Hóa, Phú Yên, Sài Gòn Nam Định Kết phân tích đƣợc trình bày bảng sau: 32 Bảng 3.9 Kết phân tích độc tố DSP mẫu sò STT Mẫu Sò Thời gian Địa điểm lấy lấy mẫu mẫu Kết OA DTX1 DTX2 7/11/2016 (+) (-) (-) Sò 30/11/2016 3,91 (-) (-) Sò 7/12/2016 (+) (-) (-) Sò 8/12/2016 (+) (-) (-) Sò (-) (-) (-) Sò (-) (-) (-) Thanh Hóa 15/12/2016 Bảng 3.10 Kết phân tích độc tố DSP mẫu hàu STT Mẫu Hàu Hàu Hàu Hàu Hàu Hàu Hàu Hàu Thời gian Địa điểm lấy Kết lấy mẫu mẫu OA DTX1 DTX2 3,12 (-) (-) (+) (-) (-) 5,1 (-) (-) 3,91 (-) (-) 9,45 (-) (-) 4,7 (-) (-) 4,3 (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 7/11/2016 20/11/2016 24/11/2016 28/11/2016 29/11/2016 Thanh Hóa Hàu 10 Hàu 11 Hàu 12 Hàu 13 Hàu 2/2017 (-) (-) 4,4 14 Hàu 3/2017 (-) (-) 6,36 15 Hàu (-) (-) (-) 16 Hàu (-) (-) (-) 15/12/2016 31/3/2017 33 Bảng 3.11 Kết phân tích độc tố DSP mẫu ngao STT Mẫu Ngao Thời gian Địa điểm lấy lấy mẫu mẫu Kết OA DTX1 DTX2 7/11/2016 (-) (-) (-) Ngao 12/12/2016 (-) (-) (-) Ngao 7/1/2017 (-) (-) (-) Ngao 8/2/2017 (-) (-) (-) Ngao 7/3/2017 (-) (-) (-) Ngao 9/4/2017 (-) (-) (-) Nam Định Bảng 3.12 Kết phân tích độc tố DSP mẫu vẹm STT Mẫu Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Vẹm Thời gian lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu 4/2016 Phú Yên 10/5/2016 Sài Gòn 9/6/2016 Phú Yên 8/7/2016 Phú Yên 13/8/2016 Phú Yên 9/9/2016 Phú Yên 20/9/2016 Đà Nẵng Kết (ng/g nhuyễn thể) DTX2 OA DTX1 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (- ) Vẹm Vẹm Vẹm 11/11/2016 Sài Gòn (-) (-) (-) Vẹm 27/3/2017 Phú Yên (-) (-) Không phát hiện; (+) Phát với LOD < nồng độ < LOQ 34 Một số pic dương tính OA Hình 3.16 Mẫu hàu Thanh Hóa 07/11/2016 OA Hình 3.17 Mẫu sò Thanh Hóa 07/11/2016 OA Hình 3.18 Mẫu hàu Thanh Hóa 20/11/2016 35 OA Hình 3.19 Mẫu sò Thanh Hóa 08/12/2016 DTX2 Hình 3.20 Mẫu hàu Thanh Hóa tháng 2/2017 Một số mẫu âm tính Hình 3.21 Mẫu ngao Nam Định 07/11/2016 36 Hình 3.22 Mẫu vẹm Sài Gòn 11/11/2016 Hình 3.23 Mẫu hàu Thanh Hóa 31/03/2017 Nhận xét: Kết cho thấy mẫu vẹm Phú Yên, Sài Gòn mẫu ngao Nam Định không phát thấy độc tố nhóm DSP Trong mẫu sò thu đƣợc Thanh Hóa, có mẫu dƣơng tính với OA với nồng độ cao định lƣợng đƣợc 3,91 ng/g nhuyễn thể mẫu sò 30/11/2017 Phân tích 16 mẫu hàu, kết có mẫu phát đƣợc độc tố OA, mẫu dƣơng tính với DTX2 Nồng độ OA cao xác định đƣợc 9,45 ng/g mẫu hàu ngày 28/11/2016 Nồng độ DTX2 cao xác định đƣợc 6,36 ng/g nhuyễn thể mẫu hàu tháng 3/2017 Các mẫu phát dƣơng tính với độc tố DSP có nồng độ nằm giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn châu Âu tiêu chuẩn Việt Nam 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiêm, với mục đích áp dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để tách xác định độc tố OA, DTX1 DTX2 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ, thu đƣợc kết nhƣ sau:  Xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định độc tố LC-MS/MS Điều kiện khối phổ: điều kiện bắn phá ion mẹ, ion xác nhận ion định lƣợng chất nhƣ bảng 3.1 bảng 3.2 Điều kiện sắc ký lỏng: cột Eclipseplus C18 (2,1 × 50mm, 1,8µm); pha động kênh A nƣớc kênh B acetonitril, kênh chứa 0,1% acid formic mM amoniformat Tỉ lệ pha động 35:65 (tt/tt), tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm µl Thẩm định phương pháp: phƣơng pháp xây dựng có tính đặc hiệu với số điểm IP = 4, giới hạn phát thấp (0,75 ng/g nhuyễn thể); khoảng nồng độ tuyến tính chất có hệ số tƣơng quan r > 0,995 Hiệu suất thu hồi đạt từ 86,8% đến 112,0 % , RSD (%) khoảng 1,3% đến 5,7 %, đáp ứng yêu cấu AOAC  Áp dụng phƣơng pháp 58 mẫu thực gồm loài hàu, sò, vẹm ngao Việt Nam: Bƣớc đầu phát xác định đƣợc nồng độ OA (3,12 – 9,45 ng/g) DTX2 (4,4 – 6,36 g/ng) mẫu hàu sò thu thập vùng biển Thanh Hóa KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu ngắn nên phân tích đƣợc độc tố dạng tự loài nhuyễn thể với số lƣợng mẫu (6 mẫu ngao, sò) Vì vậy, đề tài đƣa số kiến nghị sau: - Tiến hành phân tích mẫu thực tế với số loài đa dạng, số lƣợng mẫu lớn nhiều địa phƣơng - Tiến hành phân tích độc tố dạng dẫn xuất ester 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất y học, Tr 123 [2] Bộ Y Tế (2011), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nhà xuất y học, Tr 84-110 [3] Cục Chế biến, Thƣơng mại nông lâm thủy sản nghề muối (2011), “Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”, Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8681:2011 [4] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Tr 22-25 Tiếng Anh [5] A P Louppis, A V Badeka, P Katikou, E K Paleologos, and M G Kontominas (2010), “Determination of okadaic acid, dinophysistoxin-1 and related esters in Greek mussels using HPLC with fluorometric detection, LC-MS/MS and mouse bioassay”, Toxicon, vol 55, no 4, pp 724–733 [6] A Sassolas, G Catanante, A Hayat, L D Stewart, C T Elliott, and J L Marty (2013), “Improvement of the efficiency and simplification of ELISA tests for rapid and ultrasensitive detection of okadaic acid in shellfish,” Food Control, vol 30, no 1, pp 144–149 [7] AOAC International (2016), “Guidelines for Standard Method Performance Requirements (Appendix F)”, AOAC Official Methods of Analysis, pp 1–17 [8] A These, J Scholz, and A Preiss-Weigert (2009), “Sensitive method for the determination of lipophilic marine biotoxins in extracts of mussels and processed shellfish by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on enrichment by solid-phase extraction”, Journal of Chromatography A, vol 1216, no 21, pp 4529–4538 [9] A Gerssen (2010), “The analysis of lipophilic marine toxins”, pp 1–3 [10] B Paz et al.( 2007), “Characterisation of okadaic acid related toxins by liquid chromatography coupled with mass spectrometry,” Toxicon, vol 50, no 2, pp 225–235 [11] C Bialojan and A Takai (1988), “Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatases”, Biochem J., vol 256, pp 283–290 [12] C Bloactive, V Brevetoxins, O Acid, and a Bbgeneds (1993), “Marine Toxins”, Chemical Reviews, vol 93, pp 1897–1909 [13] D M Huang, Y F Shi, C Kong, L L Tian, and X Zhang (2014), “Determination of Okadaic Acid and Dinophysistoxins-1 in Mussel by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,” Adv Mater Res., vol 1033–1034, no November 2013, pp 648–651 [14] EC (2005), “COMMISSION REGULATION (EC) No 2074/2005”, Off J Eur Communities, vol L 269, no September 2005, pp 1–15 [15] EFSA (2009), “Marine biotoxins in shellfish: Summary on regulated marine biotoxins”, EFSA Journal, vol 1306, pp 1–23 [16] European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins (2011), “Harmonised Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS / MS”, pp 1–31 [17] FAO (2004), “Diarrhoeic Shellfish Poisoning (DSP)”, Mar Biotoxins FAO Food Nutr Pap 80, vol 1, no 1999, pp 53–95 [18] F Cetinkaya and T E Mus (2012), “Shellfish Poisoning and Toxins,” J Biol Environ Sci., vol 6, no 17, pp 115–119 [19] Hallegraeff, G.M., Anderson, D.M., Cembella, A.D (Eds) (1995), “Manual on Harmful Marine Microalgae”, IOC Manuals and Guides No 33 UNESCO 1995, pp 95–111 [20] H Goto et al (2001), “Quantitative determination of marine toxins associated with diarrhetic shellfish poisoning by liquid chromatography coupled with mass spectrometry,” Journal of Chromatography A, vol 907, no 1–2, pp 181–189 [21] H.-Q Zhang, W Liu, X He, L.-J Liang, W Ding, and Z.-Y He (2013), “Determination of okadaic acid related toxins from shellfish (sinonovacula constricta) by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,” Agricultural Sciences, vol 4, no 5B, pp 1–6 [22] H Wu, M Guo, Z Tan, H Cheng, Z Li, and Y Zhai (2014), “Liquid chromatography quadrupole linear ion trap mass spectrometry for multiclass screening and identification of lipophilic marine biotoxins in bivalve mollusks,” Journal of Chromatography A, vol 1358, pp 172–180 [23] H Wu, J Yao, M Guo, Z Tan, D Zhou, and Y Zhai (2015), “Distribution of Marine Lipophilic Toxins in Shellfish Products Collected from the Chinese Market,” Marine Drugs, 13, pp 4281–4295 [24] J F Simon and J P Vernoux (1994), “Highly sensitive assay of okadaic acid using protein phophatase and paranitrophenyl phosphate”, Natural Toxins, vol 2, pp 293–301 [25] J K Lloyd, J S Duchin, J Borchert, H F Quintana, and A Robertson (2013), “Diarrhetic Shellfish Poisoning, Washington, USA, 2011”, Emerging Infectious Diseases, vol 19, no 8, pp 2011–2013 [26] Joint FAO/WHO food standards programme (2012), “Report of the electronic working group on the proposed draft performance criteria for screening methods for marine biotoxins in the Standard for raw and bivalve molluscs”, pp 1– 18 [27] J S Lee, T Igarashi, S Fraga, E Dahl, P Hovgaard, and T Yasumoto (1989), “Determination of diarrhetic shellfish toxins in various dinoflagellate species”, Journal of Applied Phycology, vol 1, no 2, pp 147–152 [28] J S Lee, T Yanagi, R Kenma and T Yasumoto (1987), “Fluorometric Determination of Diarrhetic Shellfish Toxins by High-Performance Liquid Chromatography” , Agric Biol Chem., vol 51, no 3, pp 877–881 [29] L MacKenzie, P Holland, P McNabb, V Beuzenberg, A Selwood, and T Suzuki (2002), “Complex toxin profiles in phytoplankton and Greenshell mussels (Perna canaliculus), revealed by LC-MS/MS analysis”, Toxicon, vol 40, no 9, pp 1321–1330 [30] Nguyen Van Nguyen, Dao Viet Ha and Le Thanh Tung (2016), “Dinophysis spp recorded in the coastal waters of northern Vietnam during 2002-2003”, Coastal Marine Science 30., pp 107-110 [31] P Cohen, C F B Holmes, and Y Tsukitani (1990), “Okadaic acid: a new probe for the study of cellular regulation”, Trends Biochem Sci., vol 15, no 3, pp 98–102 [32] P F Puente et al.( 2004), “Rapid determination of polyether marine toxins using liquid chromatography-multiple tandem mass spectrometry,” Journal Chromatography A, vol 1056, pp 77–82 [33] R Draisci, L Lucentini, L Giannetti, P Boria and A Stacchini (1995), “Detection of diarrhoetic shellfish toxins in mussels from Italy by ionspray liquid chromatog- raphy-mass spectrometry”, Toxicon, vol.33, no 12, pp.1591-1603 [34] S C Shumway (1990), “A review of the effects of algal bloooms on shellfish and aquaculture”, J world Aquac Soc., vol 21, no 2, pp 65–104 [35] T D Waite, D J Baker, and V Murray (2014), “Marine Toxins”, vol 56, no 1, pp 39–58 [36] T Ikehara, S Imamura, A Yoshino, and T Yasumoto (2010), “PP2A inhibition assay using recombinant enzyme for rapid detection of okadaic acid and its analogs in shellfish”, Toxins (Basel), vol 2, no 1, pp 195–204 [37] T Suzuki, V Beuzenberg, L Mackenzie, and M a Quilliam (2004), “Discovery of okadaic acid esters in the toxic dinoflagellate Dinophysis acuta from New Zealand using liquid chromatography/tandem mass spectrometry”, Rapid Commun Mass Spectrom., vol 18, no 10, pp 1131–1138 [38] T Yasumoto et a.l (1980), “Identification of Dinophysis fortii as the causative organism of diarrhetic shellfish poisoning.”, Nippon Suisan Gakkaishi, vol 46, no 11, pp 1405–1411 [39] U F (U S F D Administration) (2013), “Guide for the Control of Molluscan Shellfish - Revised 2013,” Interstate Shellfish Sanit Conf., p 547 ... tài Xác định độc tố acid okadaic, DTX1 DTX2 số nhuyễn thể hai mảnh vỏ , với mục tiêu: Xây dựng phƣơng pháp phân tích độc tố gây tiêu chảy LC-MS/MS Xác định độc tố loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ: ... 1201180 XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ ACID OKADAIC, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Tống Thị Thanh Vƣợng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc. .. đến ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên, chúng chứa loại độc tố biển, có độc tố gây tiêu chảy Các độc tố tích tụ hải sản, đặc biệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ trình lọc hút thức ăn Nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị