Xác định độc tố acid okadaic, DTX1 và DTX2 trong một số nhuyễn thể vỏ hai mảnh vỏ

Giới hạn về hàm lượng độc tố DSP và phương pháp phát hiện theo quy định của một số nước và khu vực .... Các phương pháp được sử dụng để xác định độc tố gây tiêu chảy hiện nay gồm có thử

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành đề tài

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ trong học tập và trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh đƣợc những thiếu sót

Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017 Sinh viên Trần Thị Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu sơ lược về nhuyễn thể 2

1.2 Giới thiệu về độc tố sinh học biển 2

1.3 Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy DSP 4

1.3.1 Cấu trúc 4

1.3.2 Nguồn gốc 4

1.3.3 Tính chất lý hóa 5

1.3.4 Độc tính 5

1.3.6 Các phương pháp hay dùng để xác định DSP 8

1.4 Phương pháp LC-MS/MS 11

1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 12

1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) 12

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 15

2.2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Chuẩn bị mẫu 16

2.4.2 Khảo sát và xây dựng phương pháp 18

2.4.3 Ứng dụng phương pháp 21

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Thông số MS/MS 22

3.2 Điều kiện sắc kí lỏng 23

3.2.1 Chọn pha tĩnh 23

3.2.2 Chọn pha động 23

3.3 Thẩm định phương pháp 25

3.3.1 Tính đặc hiệu 25

3.3.2 Xác định khoảng tuyến tính 28

3.3.3 Độ lặp lại và độ thu hồi 30

3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 31

3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ADAM 9-anthryldiazomethane 9-anthryldiazomethan

ASP Amnesic Shellfish Poisoning Mất trí nhớ do ngộ độc nhuyễn

thể APCI Atmospheric Pressure Chemical

CAV Cell Accelerator Voltage Thế phân mảnh

DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Tiêu chảy do ngộ độc nhuyễn thể DTX1 Dinophysistoxin-1

DTX2 Dinophysistoxin-2

ELISA Enzyme-linked immune sorbent

assay

Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym

ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng

MBA Mouse BioAssay Thử nghiệm trên chuột

NRC National research coucil Hội đồng nghiên cứu quốc gia NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning Độc thần kinh do ngộ độc nhuyễn

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Báo cáo về các trường hợp bị ngộ độc nhuyễn thể 3

Bảng 1.2 Các nhóm liên kết và phân tử khối của acid okadaic (OA) và dinophysistoxins (DTXs) 4

Bảng 1.3 Một số tính chất lý hóa của OA và DTXs 5

Bảng 1.4 Giới hạn về hàm lượng độc tố DSP và phương pháp phát hiện theo quy định của một số nước và khu vực 6

Bảng 1.5 Giới hạn phát hiện DSP của một số bộ kit ELISA thương mại 9

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu gần đây 10

Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn 15

Bảng 2.2 Các mẫu thu thập và địa điểm lấy mẫu 16

Bảng 2.3 Bảng pha dung dịch hỗn hợp 18

Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa 22

Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh của các chất phân tích 22

Bảng 3.3 Ion mẹ và ion con của các độc tố nhóm DSP 26

Bảng 3 4 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 28

Bảng 3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định OA 30

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định DTX1 30

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định DTX2 31

Bảng 3.8 LOD, LOQ của các độc tố nhóm DSP 31

Bảng 3.9 Kết quả phân tích độc tố DSP trong mẫu sò 33

Bảng 3.10 Kết quả phân tích độc tố DSP trong mẫu hàu 33

Bảng 3.11 Kết quả phân tích độc tố DSP trong mẫu ngao 34

Bảng 3.12 Kết quả phân tích độc tố DSP trong mẫu vẹm 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của acid okadaic (OA) và dinophysistoxins (DTXs) 4

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 12

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 13

Hình 1.4 Mô hình bộ phân tích 3 tứ cực 14

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 17

Hình 3.1 Phổ khối ion con của OA và DTX2 23

Hình 3.2 Phổ khối ion con của DTX1 23

Hình 3.3 Sắc kí đồ ở tỉ lệ pha động 45:55 24

Hình 3.4 Sắc kí đồ ở tỉ lệ pha động 35:65 24

Hình 3.5 Sắc kí đồ ở tỉ lệ pha động 25:75 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 26

Hình 3.7 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn OA 26

Hình 3.8 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn DTX2 27

Hình 3.9 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn DTX1 27

Hình 3.10 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp DSP 27

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ OA 28

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX1 29

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ DTX2 29

Hình 3.14 LOD của OA, DTX2 và DTX1 32

Hình 3.15 LOQ của OA, DTX2 và DTX1 32

Hình 3.16 Mẫu hàu Thanh Hóa 07/11/2016 35

Hình 3.17 Mẫu sò Thanh Hóa 07/11/2016 35

Hình 3.18 Mẫu hàu 2 Thanh Hóa 20/11/2016 35

Hình 3.19 Mẫu sò Thanh Hóa 08/12/2016 36

Hình 3.20 Mẫu hàu Thanh Hóa tháng 2/2017 36

Hình 3.21 Mẫu ngao Nam Định 07/11/2016 36

Hình 3.22 Mẫu vẹm Sài Gòn 11/11/2016 37

Hình 3.23 Mẫu hàu 1 Thanh Hóa 31/03/2017 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, giá trị dinh dưỡng và lợi ích đối với sức khoẻ của hải sản nói chung, các nhuyễn thể hai mảnh vỏ như hàu, sò…nói riêng ngày càng được biết đến rộng rãi Ngoài các protein chất lượng cao, các axit amin thiết yếu, vitamin và khoáng chất, các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy những người ăn hải sản nhiều ít nguy cơ mắc các bệnh về mạch vành, tăng huyết áp và ung thư thấp Việt Nam là quốc gia với đường bờ biển dài, hệ sinh thái biển đa dạng, có thế mạnh trong việc tiêu thụ và xuất khẩu các sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ Theo số liệu của Tổng cục Hải quan Việt Nam, xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong 7 tháng đầu năm

2016 đạt giá trị 48,11 triệu USD Riêng trong tháng 7/2016, xuất khẩu đạt giá trị 7,25 triệu USD, tăng 15,8% so với cùng kỳ năm 2015

So với các nguồn thực phẩm khác, hải sản ít liên quan đến ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên, chúng có thể chứa các loại độc tố biển, trong đó có độc tố gây tiêu chảy Các độc tố tích tụ trong hải sản, đặc biệt trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ do quá trình lọc hút thức ăn Nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị nhiễm độc tố không có biểu hiện rõ ràng để nhận biết nhưng có thể gây các triệu chứng ngộ độc nhanh chóng và nguy hiểm cho người Để đảm bảo chất lượng và sự an toàn của các sản phẩm hải sản, châu Âu đã ban hành luật quy định giới hạn đối với các độc tố [15], đồng thời giám sát và kiểm soát chặt chẽ đối với sản phẩm hải sản nhập khẩu

Các phương pháp được sử dụng để xác định độc tố gây tiêu chảy hiện nay gồm có thử nghiệm trên chuột, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng khối phổ hay thử nghiệm miễn dịch Trong đó, sắc ký lỏng khối phổ với độ đặc hiệu, độ nhạy và

độ chính xác vượt trội, được sử dụng ngày càng rộng rãi Do đó, chúng tôi lựa chọn

đề tài “Xác định độc tố acid okadaic, DTX1 và DTX2 trong một số nhuyễn thể

hai mảnh vỏ”, với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp phân tích 3 độc tố gây tiêu chảy bằng LC-MS/MS

2 Xác định 3 độc tố trong 4 loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ: ngao, sò, hàu, vẹm

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sơ lược về nhuyễn thể

Ngành nhuyễn thể (còn gọi là thân mềm) là một ngành trong phân loại sinh

học có các đặc điểm như cơ thể mềm, có thể có vỏ đá vôi che chở và nâng đỡ

Ngành này có nhiều chủng loại rất đa dạng, phong phú và là nhóm động vật biển lớn nhất chiếm khoảng 23% tổng số các sinh vật biển đã được đặt tên Trong khu vực nhiệt đới bao gồm Việt Nam ngành này có hơn 90 nghìn loài hiện hữu, trong đó có các loài như trai, sò, ốc, hến, ngao, mực, bạch tuộc Chúng phân bố ở các môi trường như biển, sông, suối, ao hồ… Một số sống trên cạn, một số nhỏ chuyển qua lối sống chui rúc và đục ruỗng các vỏ gỗ của tàu thuyền như hà Ước tính số loài còn sống đã miêu tả được chấp nhận trong nhóm động vật thân mềm khoảng 50.000 đến 120.000 Năm 2009, Chapman ước tính số loài còn sinh tồn đã được miêu tả là 85.000 Nhuyễn thể là nhóm xếp thứ 2 sau chân khớp về số lượng loài

Việc sử dụng động vật nhuyễn thể như: trai, sò, vẹm, ngao… làm động vật chỉ thị cho các nghiên cứu về y tế (như mối nguy hại cho sức khỏe con người), môi trường (như đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường biển) ngày càng phổ biến Các động vật này có thể tích lũy các chất gây độc qua hai con đường chính:

- Trong quá trình sinh trưởng, các loài này hút nước, ngậm, ép nước và giữ lại các loài phù du, trong đó có chất độc sẽ không thoát ra được mà tích lũy lại trong ruột và thịt của nhuyễn thể

- Thông qua việc hấp thụ trực tiếp chất độc qua các mang

1.2 Giới thiệu về độc tố sinh học biển

Trong tự nhiên, các loài tảo độc tồn tại trong môi trường cùng với loài vi tảo hay còn gọi là sinh vật phù du có ích khác Thông thường, chúng tồn tại với mật độ nhất định và ít gây hại cho môi trường Nhưng khi gặp điều kiện phù hợp (dinh dưỡng, độ mặn, nhiệt độ…) tảo độc có thể bùng phát trong thời gian ngắn với mật

độ lên đến hàng triệu tế bào/ lít, tạo ra hiện tượng nước biển nở hoa (blooms) và đi

kèm với nó là những thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế và môi trường Trong 5000 loài sinh vật phù du biển, có khoảng 300 loài có khả năng gây ra hiện tượng nước biển nở hoa Trong đó có khoảng 40 loài có khả năng sinh độc tố cho cá, giáp xác, nhuyễn thể và con người [34] Phần lớn các loài tảo sinh độc tố thuộc 3 nhóm tảo là

tảo lam (Cyanobacteria), tảo giáp (Dinophyta) và tảo roi (Haptophyta) Độc tố do

tảo sinh ra gồm nhiều nhóm khác nhau và là nguyên nhân trực tiếp của nhiều dạng ngộ độc khác nhau: liệt cơ (Paralytic Shellfish Poisoning - PSP), tiêu chảy (Dirrahetic Shellfish Poisoning - DSP), mất trí nhớ (Amnesic Shellfish Poisoning- ASP), độc thần kinh (Neurptoxic Shellfish Poisoning - NSP)

Hải sản, trong đó có các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ như sò, hàu, vẹm, ngao

có khả năng hấp thu và tích lũy độc tố từ môi trường tự nhiên thông qua quá trình lọc hút thức ăn Trong nhuyễn thể, độc tố được tích lũy chủ yếu trên đường tiêu hóa Khi con người tiêu thụ các loài nhuyễn thể có tích lũy độc tố sẽ gây ra ngộ độc với các triệu chứng và mức độ đa dạng Tại Mỹ, hàng năm có từ 3,3 đến 12,3 triệu người bị ngộ độc các độc tố sinh học biển dẫn đến 3.900 trường hợp tử vong Độc

tố sinh học biển đã tác động tiêu cực đến môi trường và nền kinh tế (du lịch, nuôi trồng và chế biến hải sản)

Bảng 1.1 Báo cáo về các trường hợp bị ngộ độc nhuyễn thể

Loại ngộ độc Năm Thực phẩm

liên quan

Số bệnh nhân Địa điểm Tham

1.3 Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy DSP

DSP được xác định vào năm 1976 khi một trường hợp ngộ độc do ăn phải sò

có nhiễm độc tố xảy ra ở đông nam Nhật Bản DSP có liên quan đến việc ăn phải các loài nhuyễn thể 2 mảnh vỏ như vẹm, sò điệp hay ngao mà có tích lũy độc tố do

loài tảo Dinophysis sản xuất [12] Độc tố DSP có thể được chia thành các nhóm

khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc hóa học Nhóm độc tố có cấu trúc acid bao gồm acid okadaic (OA) và dẫn xuất của nó có tên dinophysistoxins (DTXs) Nhóm thứ hai trung tính, bao gồm các polyether-lacton của nhóm pectenotoxin (PTXs) Nhóm thứ ba là polyether-sulfat và dẫn xuất của yessotoxin (YTXs) [17] Trong đó, OA và các dẫn xuất DTX1, DTX2 là những độc tố được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm DSP do khả năng gây tiêu chảy mạnh của chúng

OR4

O

O O

H

R2O

kể giữa các loài tảo, có thể thay đổi theo vùng và thay đổi theo mùa ở một loài [17] Với bản chất thân dầu, các độc nhóm DSP dễ dàng tích lũy được trên các sinh vật biển tiêu thụ tảo và nhanh chóng lan rộng đến các loài ăn thịt chúng trong chuỗi

thức ăn, trong đó có con người

1.3.3 Tính chất lý hóa

DSP là hợp chất thân dầu có chuỗi carbon dài, chứa các vòng polyether Chúng có thể được hòa tan trong các dung môi như aceton, chloroform, methylen chlorid, methanol hay dimethyl sulfoxit [19] Một số tính chất hóa lý của nhóm độc

tố DSP được thể hiện trong bảng sau:

phân tử

C44H68O13 804.4661

C45H70O13 818.4817

C44H68O13 804.4661

và 160 µg/kg cho DTX1 Với đường uống, liều gấp 16 lần [19]

Con người tiêu thụ động vật có vỏ có chứa độc tố DSP vượt mức cho phép sẽ gặp các triệu chứng tiêu chảy, buồn nôn, nôn mửa và đau bụng Các triệu chứng bắt đầu 30 phút đến một vài giờ sau khi ăn và phục hồi hoàn toàn trong vòng 3 ngày

Liều thấp nhất của OA và DTX1 cần thiết để tạo ra trên các triệu chứng ở người lớn

đã được ước tính là 40 và 36 mg tương ứng [5] Trong trường hợp ngộ độc nặng, nạn nhân có thể thấy ngứa, tê môi, khó thở…và có thể chết vì liệt cơ hô hấp trong vòng 2 - 24 giờ sau khi ăn

Bảng 1.4 Giới hạn về hàm lượng độc tố DSP và phương pháp phát hiện theo quy

định của một số nước và khu vực

Quy định Độc tố Sản phẩm Mức giới hạn Phương

Động vật

có vỏ

0,16 mg OA/kg 0,16 mg AZA-1/kg

MBA LC-MS

Hội đồng dinh

dưỡng [26]

OA, DTX1, DTX2

Nhuyển thể hai mảnh vỏ

0,16 mg OA/kg

MBA LC-MS

Hiệp hội Châu

Âu [16]

OA, DTXs, PTX cùng YTXs AZAs

Nhuyển thể hai mảnh vỏ

0,16 mg OA/kg

1 mg YTX/kg 0,16 mg AZA/kg LC-MS/MS

Tiêu chuẩn Việt

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh

DSP âm tính hoặc:

- Tổng OA + DTXs + PTX: 160 μg/kg

- Yessotoxin: 1 mg/kg

- Azaspiracid: 160 μg/kg

HPLC

Cơ chế gây độc của nhóm OA được giải thích là do OA ức chế serin,

threonin phosphatase PP1 và PP2A dẫn tới làm tăng quá trình phosphoryl hóa của các protein kiểm soát sự bài tiết natri ra khỏi tế bào biểu mô ruột dẫn đến mất thụ động chất lỏng, gây tiêu chảy [19]

1.3.5 Tình hình ngộ độc DSP

Báo cáo lâm sàng sớm nhất của DSP là từ Hà Lan năm 1961 Tuy nhiên, cấu trúc của các độc tố nhóm DSP chỉ được làm sáng tỏ 15 năm sau ở Nhật Bản Các trường hợp DSP đã được ghi nhận trên toàn thế giới, hay gặp nhất ở Nhật Bản, Hoa

Kì và một số nước châu Âu Ở Hoa Kỳ, các tiểu bang, các ca bệnh giống DSP lẻ tẻ

đã được ghi lại trên Bờ Đông từ năm 1980, trùng hợp với sự phát hiện của Dinoflagellates sản xuất độc tố trong các lớp vỏ sò hến Trong 2002, những trại nuôi sò ốc ở vịnh Chesapeake, Virginia, đã đóng cửa trong thời gian ngắn vì Dinophysis spp Gần đây hơn, ở Texas, các khu vực thu hoạch đã đóng cửa hơn 1 tháng vì sự bùng phát của tảo Dinophysis gây ô nhiễm khu vực nuôi hàu với hàm lượng OA vượt quá mức qui định của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược (FDA); tuy nhiên không có ca bệnh nào được báo cáo [25]

Tại Việt Nam, một nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ 12/2003 theo dõi số lượng tảo và định lượng độc tố DSP trong trai ở vùng biển phía bắc từ Thái Bình đến Thanh hóa Các loài: D.caudata, D.fortii, D.miles, D.rotundata, D.mitra, D hastate, trong đó D.caudata phổ biến nhất, được tìm thấy quanh năm, dao động trong khoảng 0 - 3000 cá thể/L, số lượng nhiều khi nhiệt độ

5/2002-ấm từ tháng 2 đến tháng 10 và đạt mật độ cao khi độ mặn 8 - 34 PSU Mật độ cao nhất ghi nhận: 3128 tế bào/L ở 22˚C, 8,2 PSU, Thanh Hóa, 2/2003 OA được phát hiện ở phần ăn được của con trai ở nồng độ thấp, mức cao nhất là 80 ng OA/100 g (Thanh Hóa, 8/2002) DTX1 không được phát hiện ở tất cả các mẫu [30] Nhiều sự kiện tảo nở hoa cũng đã được báo cáo ở nhiều địa phương khác Đợt thủy triều đỏ khủng khiếp nhất từ trước tới nay tại vùng biển Bình Thuận được ghi nhận vào tháng 7/2002, người ta phát hiện 1 lít nước có chứa đến 39 triệu tế bào Năm 2008 khi có đợt thủy triều đỏ ở vùng biển Thuận Quý, 1 lít nước biển ở ven bờ và ước

lượng khoảng vài triệu tế bào Tháng 6 và tháng 7/2014, thủy triều đỏ tạo nên các trận bọt biển màu đỏ vàng ở bãi biển Mũi Né – Hòn Rơm Tháng 9/2016, loài tảo Hairoi - Creratium furca nở hoa gây thủy triều đỏ ở Thanh Hóa với mật độ khoảng 8 triệu tế bào/lít nước biển Tuy nhiên, chưa có thống kê chính xác nào về các trường hợp ngộ độc do độc tố DSP

1.3.6 Các phương pháp hay dùng để xác định DSP

a) Thử nghiệm MBA (Mouse BioAssay)

Hiện nay, các xét nghiệm sinh học chuột (MBA) vẫn là phương pháp tham khảo cho việc phát hiện các độc tố thân dầu [14] Tính độc trong phương pháp MBA được thể hiện bằng đơn vị chuột (MU) Một MU được định nghĩa là lượng độc tố tối thiểu có khả năng giết chết một con chuột 20 g trong vòng 24 giờ sau khi tiêm phúc mạc [38] Độc tố được chiết ra từ thịt nhuyễn thể bằng aceton, sau đó đem cô đặc đến khi còn cặn Cặn thu được hòa tan vào một lượng nhỏ thể tích 1% Tween 60, sau đó tiêm phúc mạc vào chuột có khối lượng khoảng 20 g và theo dõi

sự sống sót của chuột từ 24 – 48 giờ Tại nhiều nước, giới hạn qui định được đặt ở mức 0,05 MU/g nhuyễn thể [35]

Tuy nhiên, thử nghiệm trên chuột chỉ cho thấy tổng độc tính của tất cả độc tố trong một mẫu mà không phân biệt được các độc tố Một nhược điểm quan trọng nữa của MBA là vấn đề đạo đức chống lại việc sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm Ngoài ra, MBA tốn thời gian và có thể cung cấp cho kết quả dương tính giả

do nhiễu bởi các độc tố khác như Saxitoxin, Gymnodimin, Spirolides hoặc bởi axit béo [5]

b) Thử nghiệm sinh hóa

OA được biết đến như là chất ức chế protein serine/threonine phosphatase Protein serine/threonine phospahatses (PPs) được phân thành 4 nhóm chính: PP1, PP2A, PP2B và PP2C [11] OA ức chế các PPs ở các mức độ khác nhau: ức chế mạnh nhất PP2A, tiếp theo là PP1 và PP2B; không ức chế lên PP2C [31] Dựa trên

sự ức chế đặc hiệu này, phương pháp thử nghiệm ức chế PP2A được đề xuất và phát triển để xác định độc tố nhóm DSP [20], [24], [36] Phương pháp này có ưu điểm là

đơn giản và nhanh chóng, độ nhạy và độ chính xác cao, phát hiện được độc tố ở nồng độ 34,8 ng/g Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp là sự biến động của chất lượng enzym (độ tinh khiết và độ ổn định), giá cả của chúng và khả năng cung cấp kết quả dương tính giả do PP2A bị ức chế bởi các chất khác trong nền mẫu

Phương pháp thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays) xác định độc tố nhóm DSP dựa trên sự thừa nhận cấu trúc của độc tố bằng việc sử dụng các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng [6] Các bộ thử nghiệm ELISA đã được phát triển và sẵn có trên thị trường Bộ kiểm tra DSP-Check® được sản xuất tại khu công nghiệp UBE, Tokyo, Nhật Bản

đã được sử dụng trên khắp thế giới để kiểm tra OA và DTX1 với giới hạn phát hiện

20 ng/g Bộ thử nghiệm có độ nhạy cao, độ đặc hiệu và tốc độ phân tích nhanh hơn

so với LC Một số kit thử nghiệm ELISA có trên thị trường và giới hạn phát hiện của chúng được thể hiện ở bảng sau

Bảng 1.5 Giới hạn phát hiện DSP của một số bộ kit ELISA thương mại

Bộ Kit Beacon Bio Scientific Biosense/ Abraxis Europroxima

Giới hạn

phát hiện 50 μg/kg 30 μg/kg 100 μg/kg 49,6 μg/kg (sò)

48,2 μg/kg (ốc)

c) Sắc ký lỏng với detector huỳnh quang (LC-FLD)

Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang được ứng dụng để xác định và định lượng độc tố DSP từ những năm 1990 Phương pháp này có lợi thế về

độ nhạy, nhanh chóng, chính xác và độ đặc hiệu [28] Độc tố DSP mang nhóm cacboxyl có thể được chuyển đổi thành các dẫn xuất este phát huỳnh quang (dẫn xuất 9-anthryldiazomethan (ADAM) để phân tích HPLC với detector huỳnh quang

Các phương pháp ADAM là rất nhạy cảm đối với độc tố DSP, có thể phát hiện ít nhất là 10 pg của dẫn xuất OA tiêm vào cột Tuy nhiên, giới hạn phát hiện của phương pháp không chỉ bị hạn chế bởi độ nhạy của detector mà còn bị ảnh hưởng bởi nhiễu nền, do đó, giới hạn phát hiện thực tế của phương pháp chỉ khoảng

100 ng/g nhuyễn thể Nếu chỉ phân tích độc tố trong tuyến tiêu hóa thì giới hạn phát

hiện trong khoảng 10 đến 20 ng/g nhuyễn thể Một nhược điểm nữa của phương pháp là độ tinh khiết thấp của thuốc thử ADAM và sự hiện diện của rất nhiều phản ứng khác xảy ra đồng thời trong quá trình tạo dẫn xuất nên cần phải làm sạch bằng cột silica sau bước tạo dẫn xuất Ngoài ra, các dẫn chất khác của độc tố nhóm DSP không còn nhóm carboxyl tự do thì không thể thực hiện được phương pháp này [19]

d) LC-MS

Trong thập niên gần đây, sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) được phát triển và ngày càng được sử dụng rộng rãi để xác định trực tiếp nhóm độc tố DSP [27], [33] do nó có độ nhạy và độ chọn lọc cao Đặc biệt, hệ thống sắc ký lỏng khối phổ chập ba (LC-MS/MS) [10], [29], [32], [37] đã được chứng minh trở thành một công cụ phân tích có giá trị để xác định và định lượng độc tố và chất chuyển hóa của chúng ở nồng độ rất thấp

Nghiên cứu gần đây sử dụng phương pháp LC-MS/MS để xác định độc tố DSP:

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu gần đây

TLTK Điều kiện phân tích Kỹ thuật Kết quả

[23]

Mẫu: trai, sò, sò điệp, hàu

Dung môi chiết: methanol

LC-LOQ: 0,02 mg/kg

[22]

Mẫu: hàu, sò, trai

Dung môi chiết: methanol

LC-LOD µg/kg

LOQ µg/kg

DTX1 1,06 3,55 DTX 1,65 5,12

1.4 Phương pháp LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance

liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận

khối phổ (Mass spectrometry – MS)

1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khái niệm: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên

cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di

chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,

phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2]

Nguyên tắc: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động và được cho qua cột

bằng dòng chất liên tục (pha động) Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di

chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào sự tương tác giữa

chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các

thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính

và định lượng [1]

1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của

các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

của chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ

số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử

a Bộ nạp mẫu: chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị

khối phổ Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc

ký

b Nguồn ion: có nhiệm vụ ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử

mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối m/z (khối lượng ion/điện tích) Các kỹ thuật ion hóa gồm: ion hóa phun điện tử ( ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI)

Trong đó, kiểu ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực

c Bộ phận phân tích khối: có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác

nhau thành từng phần riệng biệt, có nhiều bộ phân tích khối khác nhau như: tứ cực (Quadrupole), tứ cực chập ba (Triple quadrupole), bẫy ion (Ion trap), ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube) Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị với

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS

Bộ phân tích tứ cực chập ba gồm ba tứ cực ghép nối với nhau

Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion đƣợc chuyển từ Q2 để đi tới

Q0

Hình 1.4 Mô hình bộ phân tích 3 tứ cực

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm các loài: Vẹm (Perna viridis), hàu (Crasostrea revularis), sò (Anadara granosa) và ngao (Meretrix meretrix) được thu

thập tại một số tỉnh gồm: Phú Yên, Sài Gòn, Đà Nẵng, Thanh Hóa và Nam Định trong khoảng thời gian từ tháng 4/2016 đến tháng 4/2017

2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị

+ Máy lắc xoáy Labico L46

+ Máy ly tâm lạnh Kubota 6500

+ Máy cô nitơ Hanon HN200

+ Cân phân tích TE214S (thang đọc đến 0,1 mg)

+ Các dụng cụ: ống ly tâm 10 ml, 50 ml, vial 1,8 ml, bình định mức 5ml, micropipet loại 100 µL, 1000 µL và đầu côn tương ứng

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện LC-MS/MS

+ Thông số hoạt động của thiết bị MS, điều kiện phân mảnh

+ Điều kiện sắc ký lỏng

- Thẩm định phương pháp phân tích

+ Độ đặc hiệu/ chọn lọc của phương pháp

+ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

+ Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

+ Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Ứng dụng phương pháp: Áp dụng phương pháp để xác định và định lượng hàm lượng độc tố OA, DTX1 và DTX2 trong một số mẫu thu thập được từ tháng 4/2016 đến tháng 4/2017

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chuẩn bị mẫu

* Lấy mẫu:

Bảng 2.2 Các mẫu thu thập và địa điểm lấy mẫu

Mẫu Địa điểm lấy mẫu

+ Dùng nước sạch rửa phần bên ngoài, tách lấy phần thịt nhuyễn thể

+ Phần thịt có thể mang đi tiến hành phân tích, nếu chưa sử dụng thì bảo quản ở -80˚C