Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam. Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VIỆN KIỂM NGHIỆM VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM QUỐC GIA Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Lê Đình Chi 2.PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Phản biện 1: …………………………………………………………… …………………………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………………………… …………………………………………………………… Phản biện 3: …………………………………………………………… …………………………………………………………… Luận án bảo vệ trường Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại:…………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Vào hồi……giờ……….ngày………tháng………năm……… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường đại học Dược Hà Nội A - GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề có tầm quan trọng thường trực đảm bảo chất lượng sống cộng đồng nhận quan tâm sát toàn xã hội Trong lĩnh vực này, cộm việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” tác nhân gây hại tới sức khỏe người, có độc tố mang nguồn gốc tự nhiên độc tố vi nấm loại hạt ngũ cốc, độc tố vi tảo vi khuẩn loại nhuyễn thể Trong số này, độc tố tảo đơn bào hai roi sản xuất nguyên nhân gây nhiều hội chứng ngộ độc người, có hội chứng tiêu chảy ngộ độc thủy sinh vật vỏ cứng (diarrheic shellfish poisoning – DSP) với tác nhân nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) dẫn xuất gọi chung dinophysistoxin (DTX) Hiện Việt Nam, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn có quy định giới hạn tổng OA, DTX pectenotoxin (PTX) 160 ppb Tuy nhiên, việc đánh giá nguy có mặt độc tố nhóm OA nhuyễn thể Việt Nam chưa thực cách có hệ thống Bên cạnh đó, phương pháp thức TCVN 8341:2010 cho phép xác định OA, không cho phép xác định DTX, phương pháp bán định lượng chuột (MBA) không đặc hiệu với riêng nhóm OA, khơng cho phép phân biệt OA DTX Do đó, cần phát triển phương pháp đặc hiệu để xác định OA DTX hải sản, cần có nghiên cứu đánh giá thực tế có mặt OA DTX hải sản để kiểm soát hiệu sát thực tế nhóm độc tố Việt Nam Do vậy, luận án “Nghiên cứu xác định độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 số nhuyễn thể hai mảnh vỏ biển Việt Nam sắc ký lỏng khối phổ” thực Mục tiêu luận án Luận án thực nhằm hướng tới góp phần đưa giải pháp kỹ thuật tin cậy áp dụng vào đánh giá hàm lượng OA, DTX1 DTX2 nhuyễn thể, đánh giá thực tế nhiễm độc tố vùng biển Việt Nam Các nội dung nghiên cứu luận án triển khai theo mục tiêu sau: v Mục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 sắc ký lỏng khối phổ v Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng độc tố kể số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ lấy vùng biển Việt Nam Những đóng góp luận án v Lần Việt Nam xây dựng thành công phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS để phân tích đồng thời OA, DTX1 DTX2 nhuyễn thể + Thiết lập phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 tự nhuyễn thể với quy trình chiết độc tố methanol kết hợp làm cột chiết pha rắn Strata-X phân tích LC-MS/MS sử dụng nguồn ion hóa ESI (-) với q trình tách sắc ký cột HPLC C18 Cortecs chế độ rửa giải gradient với LOD nhạy cho độc tố (1 ng/g) + Thiết lập phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 tự nhuyễn thể với quy trình chiết độc tố methanol kết hợp làm ly tâm lạnh oC, định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 toàn phần nhuyễn thể với quy trình chiết độc tố methanol, thủy phân NaOH để chuyển độc tố OA, DTX1, DTX2 dạng ester dạng độc tố tự xử lý làm dịch sau thủy phân chiết lỏng-lỏng (dung môi isopropyl acetat) kết hợp ly tâm lạnh oC phân tích độc tố LCMS/MS sử dụng nguồn ion hóa ESI (-) với trình tách sắc ký cột UPLC C18 Zorbax Eclipse Plus chế độ rửa giải đẳng dòng với thời gian phân tích nhanh (6 phút) LOD nhạy cho độc tố (1 ng/g) Đặc biệt, xử lý mẫu nhuyễn thể để phân tích OA, DTX1 DTX2 dạng tự toàn phần, luận án nghiên cứu sử dụng ly tâm lạnh để làm dịch xử lý mẫu trước phân tích OA, DTX1, DTX2 LC-MS/MS v Lần Việt Nam, phương pháp LC-MS/MS sử dụng để đánh giá hàm lượng OA, DTX1, DTX2 tự toàn phần số lượng lớn mẫu nhuyễn thể lấy mẫu tỉnh, thành phố ven biển Việt Nam (Nam Định, Thanh Hóa, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu) + Đã phân tích 188 mẫu nhuyễn thể (59 mẫu vẹm, 48 mẫu hàu, 34 mẫu ngao, 27 mẫu sò huyết, 20 mẫu sò lơng lấy vòng 12 tháng, từ tháng 4/2016 đến tháng 3/2017, phát thấy 23 mẫu có độc tố (21 mẫu có OA, mẫu có DTX2) + Đã khẳng định có mặt độc tố nhóm OA nhuyễn thể Việt Nam (có mặt 5/6 địa điểm lấy mẫu, 4/5 nhóm nhuyễn thể lấy mẫu, xuất 9/12 tháng lấy mẫu) Ý nghĩa luận án Luận án giải mục tiêu nghiên cứu đề ra, đạt kết có ý nghĩa thực tiễn ý nghĩa khoa học cao: + Đã xây dựng phương pháp phân tích OA, DTX1, DTX2 LCMS/MS với độ nhạy tốt, với lựa chọn tách sắc ký cột HPLC cột UPLC, điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể để phân tích OA, DTX1, DTX2 dạng tự toàn phần Phương pháp thẩm định chứng tỏ phù hợp cho ứng dụng phân tích độc tố nhuyễn thể + Đã lấy mẫu nhuyễn thể tỉnh, thành phố dọc bờ biển Việt Nam để phân tích OA, DTX1, DTX2 dạng tự toàn phần, từ thu thơng tin thực nghiệm giá trị có mặt độc tố nhuyễn thể Việt Nam, có ý nghĩa thực tiễn cao việc đánh giá nguy ảnh hưởng tới sức khỏe người mức độ cần thiết kiểm soát độc tố cách phù hợp Bố cục luận án Luận án gồm chương, với 44 hình, 28 bảng, 156 tài liệu tham khảo (gồm tài liệu tiếng Việt 151 tài liệu tiếng nước ngoài) Luận án dài 144 trang, gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1: Tổng quan (40 trang); Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (10 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (69 trang); Chương 4: Bàn luận (20 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang) B - NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã trình bày tập hợp có hệ thống nội dung liên quan tới luận án, bao gồm: - Khái niệm độc tố sinh vật biển, bao gồm nguồn gốc phát sinh độc tố này, đối tượng tích lũy độc tố làm trung gian gây phơi nhiễm độc tố người, tóm tắt q trình nghiên cứu số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc cho người - Nguồn gốc, cấu trúc hóa học, độc tính quy định kiểm soát độc tố gây hội chứng DSP: loại tảo hai roi sản xuất độc tố nhóm OA gây DSP, cấu trúc hóa học độc tố nhóm OA, chế gây độc độc tính độc tố nhóm OA, quy định kiểm sốt nước nước giới hạn độc tố gây DSP nhuyễn thể - Tổng quan tóm lược phương pháp phân tích độc tố nhóm OA, gồm phương pháp xử lý mẫu để chiết độc tố từ nhuyễn thể, phương pháp làm dịch chiết, phương pháp thủy phân để chuyển dẫn xuất ester độc tố dạng độc tố tự do, phương pháp định lượng độc tố nhóm OA (phương pháp sinh học, phương pháp hóa lý) - Tổng quan ứng dụng sắc ký khối phổ phân tích độc tố nhóm OA: đặc trưng khối phổ độc tố nhóm OA, ứng dụng phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA LC-MS LC-MS/MS (kỹ thuật ion hóa, điều kiện phân tích, lựa chọn phân tích khối) Các nghiên cứu khoa học chứng minh loại hải sản chứa độc tố gây độc cho người (hay độc tố sinh vật biển) thực không sản xuất độc tố mà tích lũy độc tố ăn sinh vật sản xuất độc tố vật chủ ký sinh sinh vật Những sinh vật sản xuất độc tố sinh vật biển chủ yếu vi khuẩn, vi tảo Tảo đơn bào hai roi tác nhân sản xuất độc tố gây nhiều hội chứng ngộ độc người, có hội chứng tiêu chảy ngộ độc thủy sinh vật vỏ cứng (hay hội chứng DSP) Nhóm độc tố gồm OA chất dẫn xuất gọi chung DTX OA phân lập từ loài bọt biển Halichondria okadai vào năm 1981 Các DTX đặt tên theo chi Dinophysis gồm dinophysistoxin-1 (DTX1) dinophysistoxin-2 (DTX2) DTX1 đượcphân lập năm 1982 dẫn xuất OA (acid 35(R)-methyl okadaic), DTX2 phân lập năm 1992 đồng phân cấu tạo OA Ba độc tố OA, DTX1, DTX2 độc tố dạng tự Ngoài ra, OA DTX tồn dạng ester, gọi chung DTX3 Các độc tố dạng tự có độc tính cao dẫn xuất ester, ester bị thuỷ phân giải phóng dạng tự độc Các độc tố nhóm OA gây độc thông qua ức chế enzym serin/threonin phosphatase PP1 PP2A, làm thay đổi yếu tố liên kết tế bào biểu mô ruột kiểm soát khả thấm chất tan, dẫn tới chất lỏng thụ động, gây tiêu chảy Bên cạnh đó, số nghiên cứu cho thấy OA DTX có tác dụng gây độc tế bào, gây đột biến gen mạnh kích thích phát triển khối u Các trường hợp xảy DSP người từ sau năm 1978 ghi nhận châu Âu (Pháp, Bỉ, Tây Ban Nha, Anh), Bắc Mỹ (Canada, Mỹ), Nam Mỹ (Argentina, Chile), châu Á (Trung Quốc) Tại Việt Nam chưa thức ghi nhận xuất DSP, song xác nhận có mặt lồi tảo sinh độc tố gây DSP D.caudata, D.miles, D.rotundata vùng biển Việt Nam Hiện Việt Nam có quy định giới hạn tổng OA, DTX pectenotoxin (PTX) 160 ppb Tuy nhiên, việc kiểm soát chưa áp dụng tất lô mẻ hải sản nuôi trồng, đánh bắt đưa thị trường tiêu thụ Đồng thời, thực tế mức độ nhiễm OA DTX hải sản nói chung nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng chưa đánh giá triệt để tồn diện Bên cạnh đó, mặt kỹ thuật phân tích, phương pháp thứcTCVN 8341:2010 cho phép xác định OA, không cho phép xác định DTX, phương pháp bán định lượng chuột (MBA) khơng đặc hiệu với riêng nhóm OA Hiện tại, sẵn có chất chuẩn OA, DTX1, DTX2 dạng tự do, thành phần, tỷ lệ dạng ester hoá độc tố (gọi chung DTX3) thay đổi đa dạng không theo quy luật chưa biết đầy đủ, nên việc phân tích độc tố nhóm OA thực chủ yếu dạng tự do, phân tích dạng ester hố cần thuỷ phân để giải phóng thành độc tố tự kể sau tiến hành xác định tổng lượng độc tố trừ lượng độc tố tự Vì vậy, xác định tổng lượng độc tố nhóm OA cần thêm giai đoạn thuỷ phân mẫu, sau phân tích dịch sau thuỷ phân để tìm tổng lượng CHƯƠNG 2.NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị 2.1.1 Dung mơi, hóa chất chất chuẩn 2.1.1.1 Chất chuẩn Chất chuẩn acid okadaic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX1) dinophysistoxin-2 (DTX2) Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Canada (National Research Council Canada – NRCC): - Chuẩn OA: dung dịch 8,4 µg/ml methanol (SKS: 20141119), - Chuẩn DTX1: dung dịch 10,4 µmol/L (tương đương 8,5 µg/ml) methanol (SKS: 20151209), - Chuẩn DTX2: dung dịch 3,8 µg/ml methanol (SKS:20150819) 2.1.1.2 Dung mơi, hóa chất - Methanol, acetonitril, aceton, isopropyl acetat, nước trao đổi ion đạt tiêu chuẩn tinh khiết dành cho LC-MS/MS 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 2.1.2.1 Thiết bị phân tích - Máy sắc ký lỏng khối phổ với nguồn ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization – ESI) gồm máy sắc ký lỏng siêu hiệu LC20AD-XR (Shimadzu, Nhật) kết nối thiết bị khối phổ ba tứ cực ABSciex Triple Quad 5500 (Sciex, Mỹ) - Ngồi có máy ly tâm lạnh, cân phân tích Sartorius CP224S (Sartorius, Thụy Sĩ) với d = 0,1 mg, thiết bị đồng mẫu Ika T50 (Ika, Đức), tủ lạnh sâu, thiết bị phụ trợ khác Tất thiết bị thuộc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, kiểm tra hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng tiêu chuẩn ISO-IEC 17025 2.1.2.2 Dụng cụ phân tích - Cột HPLC Cortecs C18 (100 ´ 4,6 mm, 3,5 µm) (Waters, Mỹ) - Cột UPLC Zorbax Eclipse Plus C18 (50 ´ 2,1 mm, 1,8 µm) (Agilent, Mỹ) - Cột chiết pha rắn: Strata-X (Phenomenex, Mỹ), Oasis HLB (Waters, Mỹ), Strata C18 (Phenomenex, Mỹ) - Dụng cụ xác: micropipette (Eppendorf, Đức) thể tích từ 10 – 500 µl, pipet thủy tinh xác từ – 10 ml, ống ly tâm có nắp xoắn dung tích 15-50 ml, ống eppendorf dung tích ml, v.v 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Mẫu nhuyễn thể lấy địa phương Mẫu nhuyễn thể thuộc nhóm (vẹm xanh, hàu, sò huyết, sò lơng ngao) tiến hành lấy địa phương vùng bờ biển Việt Nam: - Nam Định: lấy mẫu xã Hải Lý, huyện Hải Hậu - Thanh Hóa: lấy mẫu xã Hải Bình, huyện Tĩnh Gia - Đà Nẵng: lấy mẫu cảng cá Thọ Quang, thành phố Đà Nẵng - Bình Định: lấy mẫu chợ cá Hải Cảng, thành phố Quy Nhơn - Phú Yên: lấy mẫu phường Xuân Yên, thị xã Sông Cầu - Bà Rịa - Vũng Tàu: lấy mẫu cảng cá Bến Đá, Bà Rịa - Vũng Tàu Quá trình lấy mẫu tiến hành từ tháng 4/2016 đến tháng 3/2017, với tổng cộng 188 mẫu nhuyễn thể lấy, gồm 59 mẫu vẹm, 48 mẫu hàu, 34 mẫu ngao, 27 mẫu sò huyết, 20 mẫu sò lơng 2.2.2 Mẫu thêm chuẩn Để thực số nội dung nghiên cứu, chất chuẩn OA, DTX1 DTX2 thêm xác vào mẫu thịt nhuyễn thể không chứa độc tố xay nhuyễn, đồng hóa xử dụng để thực phép thử tương ứng 2.2.3 Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố Mẫu chuẩn sử dụng thẩm định phương pháp Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Canada (National Research Council Canada – NRCC) thịt vẹm có chứa độc tố OA, DTX1 DTX2 biết trước hàm lượng dạng tự tổng lượng Hàm lượng độc tố chứng mẫu chuẩn tổng hợp bảng 2.2 Bảng 2.1 Hàm lượng độc tố mẫu chuẩn OA 1,07 2,40 Hàm lượng tự (µg/g) Tổng hàm lượng (µg/g) DTX1 1,07 1,10 DTX2 0,86 2,20 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể 2.3.1.1 Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ - Xác định ion sơ cấp: Tiến hành phân tích khối phổ độc tố chế độ quét toàn phổ (full scan) chế độ chọn lọc ion (SIM) để xác định giá trị m/z ion tạo thành độc tố - Tối ưu hóa loại dung môi (declustering potential – DP) để chọn điều kiện cho cường độ ion sơ cấp tốt với độc tố - Xác định ion thứ cấp: đưa dung dịch chuẩn độc tố nồng độ 100 ng/ml vào hệ thống MS, tiến hành ghi phổ ion sơ cấp chế độ theo dõi ion thứ cấp (product ion scan) để phát ion thứ cấp tạo thành - Tối ưu hóa điều kiện buồng va chạm tạo ion thứ cấp độc tố: Lựa chọn ion thứ cấp để sử dụng cho việc phân tích độc tố với chế độ theo dõi đa phản ứng (Multireaction monitoring – MRM) làm ion định lượng ion định tính cho độc tố 2.3.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký Dựa vào đặc điểm lý hóa OA, DTX1, DTX2, tham khảo nghiên cứu công bố, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký khác pha tĩnh, pha động (loại dung môi, tỷ lệ thành phần pha động), điều kiện sắc ký khác (tốc độ dòng, chế độ rửa giải, v.v.) để tìm điều kiện sắc ký phù hợp cho việc tách độc tố khỏi mẫu, có thành phần pha động tương thích với detector MS/MS cho đáp ứng pic tốt detector MS/MS 2.3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể a/ Lựa chọn dung môi chiết độc tố: Tiến hành khảo sát mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn mẫu nhuyễn thể thực nhiễm độc tố để chọn loại dung môi chiết, điều kiện chiết phù hợp cho phép có hiệu suất chiết tốt b/ Khảo sát quy trình làm dịch chiết độc tố từ nhuyễn thể - Đánh giá mức độ cần thiết phải làm dịch chiết độc tố từ nhuyễn thể - Khảo sát thiết lập điều kiện làm dịch chiết để lựa chọn quy trình phù hợp 2.3.1.4 Khảo sát điều kiện thủy phân để phân tích độc tố tồn phần a/ Khảo sát, lựa chọn điều kiện thủy phân độc tố dạng ester Dựa nguyên tắc thủy phân ester độc tố dung dịch NaOH, tiến hành tối ưu hóa đánh giá phù hợp số điều kiện then chốt trình thủy phân (nhiệt độ, thời gian thủy phân ) để có hiệu suất thủy phân cao để chuyển OA, DTX1, DTX2 dạng ester dạng tự do, đồng thời không làm lượng độc tố tự có mẫu từ trước thủy phân (nếu có) b/ Thiết lập điều kiện làm dịch thủy phân Sau trình thủy phân, thực đánh giá ảnh hưởng mẫu thủy phân tới việc phân tích LC-MS/MS Trong trường hợp kết thực nghiệm cho thấy dịch thủy phân ảnh hưởng đáng kể tới kết phân tích LC-MS/MS, tiến hành khảo sát lựa chọn quy trình làm dịch thủy phân cho phép loại trừ ảnh hưởng mẫu tới phân tích LC-MS/MS bảo tồn lượng độc tố 2.3.1.5 Thẩm định phương pháp Sau trình khảo sát, xây dựng phương pháp, phương pháp phân tích OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể LC - MS/MS gồm điều kiện sắc ký quy trình xử lý mẫu thích hợp thẩm định tồn diện tiêu sau: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính khoảng nồng độ cơng tác, độ độ xác, độ nhạy (gồm LOQ LOD) 2.3.2 Phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể 2.3.2.1 Lựa chọn số lượng cá thể cho mẫu nhuyễn thể Dựa quy định, nghiên cứu công bố để lựa chọn số lượng cá thể tạo thành mẫu phù hợp đại diện cho tình trạng nhiễm độc tố lồi nhuyễn thể tương ứng địa phương lấy mẫu 2.3.2.2 Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể Để đảm bảo bảo tồn lượng độc tố mẫu nhuyễn thể ổn định từ lấy mẫu phân tích, độ bền độc tố nhuyễn thể khảo sát điều kiện sau: - Bảo quản mát thùng xốp có đá lạnh để vận chuyển mẫu từ nơi lấy phòng thí nghiệm - Bảo quản ngăn lạnh tủ lạnh dân dụng để lưu mẫu tạm thời lấy mẫu dài ngày - Bảo quản tủ lạnh sâu chuyên dụng: đánh giá khả lưu mẫu lâu dài chờ xử lý phân tích độc tố LC-MS/MS 2.3.2.3 Lựa chọn địa điểm, khoảng thời gian lấy mẫu - Địa điểm: lựa chọn lấy mẫu địa phương ven biển: Nam Định, Thanh Hóa, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Bà Rịa – Vũng Tàu - Khoảng thời gian lấy mẫu: 12 tháng (4/2016 – 3/2017) 2.3.3 Phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể biện giải kết 2.3.3.1 Tiến hành phân tích mẫu thực Tiến hành phân tích định tính có mặt độc tố (OA, DTX1, DTX2) định lượng hàm lượng toàn phần tự độc tố (nếu có mức LOQ) mẫu nhuyễn thể lấy 2.3.3.2 Các tiêu chí đánh giá kết phân tích độc tố nhuyễn thể Về định tính, kết luận tất lần phân tích độc lập cho kết định tính khẳng định có mặt độc tố.Về định lượng, lấy kết trung bình thu từ tối thiểu lần phân tích độc lập 2.3.3.3 Các hướng biện giải, bàn luận kết Những trường hợp mẫu nhuyễn thể phát thấy độc tố xem xét bàn luận theo hướng sau:ảnh hưởng thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, loại nhuyễn thể, mức hàm lượng độc tố phát thấy mẫu nhuyễn thể so với giới hạn cho phép quy định quản lý chất lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ hành CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích OA, DTX1 DTX2 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích OA, DTX1, DTX2 LC – MS/MS 3.1.1.1 Điều kiện detector MS/MS Bước để xây dựng phương pháp phân tích độc tố OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể thiết lập điều kiện tối ưu cho việc phân tích độc tố khối phổ hai lần Những điều kiện bao gồm nhóm chính: - Lựa chọn ion sơ cấp điều kiện khối phổ tối ưu để tạo ion sơ cấp - Lựa chọn điều kiện bắn phá ion sơ cấp ion thứ cấp sử dụng vào việc định tính định lượng độc tố Với kỹ thuật ion hóa ESI-, ion sơ cấp chọn ion [M-H]- (m/z 803 với OA, DTX2 m/z 817 với DTX1), ion thứ cấp để định lượng ion m/z 255 (ion thứ cấp có cường độ lớn nhất), ion thứ cấp để định tính ion m/z 563 Tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 so với ion m/z 255 phải nằm khoảng % - 13 % Các điều kiện detector MS/MS lựa chọn sau tối ưu hóa bảng 3.2 Bảng 3.2 Điều kiện tách chùm ion sơ cấp tạo ion thứ cấp độc tố nhóm DSP Độc tố Ion sơ cấp (m/z) OA 803 DTX1 817 DTX2 803 Ion thứ cấp (m/z) 255 563 255 563 255 563 DP (V) -85 -85 -85 CE(eV) -60 -55 -60 -55 -60 -55 CXP (V) -17 -17 -17 -17 -17 -17 Hình 3.1 Phổ ESI – MS/MS OA, DTX1 DTX2 3.1.1.2 Điều kiện sắc ký Đã tiến hành tối ưu hóa thành phần pha động, điều kiện rửa giải loại cột sắc ký để thu điều kiện cho phép tách hoàn toàn độc tố, OA DTX2 (hai độc tố có cơng thức phân tử, đồng phân cấu tạo nhau) a/ Điều kiện sắc ký cột UPLC Zorbax Eclipse Plus sau: - Cột: C18 Zorbax Eclipse Plus (2,1 ´ 50 mm, 1,8 µm) - Pha động: acetonitril – nước (35:65, tt:tt) chứa 0,1 % acid formic 0,01 M amoni format acetonitril nước - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: µl b/ Điều kiện sắc ký cột HPLC Cortecs sau: - Cột: C18 Cortes (4,6 ´ 100 mm, 3,5 µm) - Pha động: acetonitril – nước chứa 0,1% acid formic acetonitril nước, tỷ lệ theo chương trình gradient dung mơi bảng 3.3 - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Bảng 3.3.Chương trình gradient dung mơi cho cột Cortecs Thời gian (phút) Tỷ lệ acetonitril (%) Tỷ lệ nước (%) 70 30 10 90 11 10 90 11,5 70 30 15 70 30 10 3.1.2 Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1, DTX2 từ nhuyễn thể 3.1.2.1 Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố dạng tự a/ Quy trình chiết làm cột chiết pha rắn Khoảng g thịt nhuyễn thể xay nhuyễn đồng hóa chiết lần với ml methanol ml methanol Sau lần chiết, ly tâm 14.000 vòng/phút phút lấy dịch Gộp dịch chiết methanol cạn luồng khí nitơ hòa tan trở lại ml hỗn hợp methanol – nước (1:5, tt:tt) Cột chiết pha rắn Strata-X hoạt hóa ml methanol ml nước khử ion Nạp dịch hòa tan qua cột StrataX tốc độ khoảng ml/phút, rửa cột ml H2O rửa giải ml methanol, cô cạn luồng nitơ hòa tan lại cắn 500 µl methanol tiêm vào hệ thống LC – MS/MS b/ Quy trình chiết làm ly tâm lạnh Khoảng g thịt nhuyễn thể xay nhuyễn đồng hóa chiết lần với ml methanol ml methanol ống ly tâm dung tích 15 ml Sau lần chiết mẫu nhuyễn thể methanol, để ống chiết máy ly tâm lạnh 4oC 10 phút, sau ly tâm 4oC với tốc độ 14.000 vòng/phút phút, hút dịch Sau trình chiết, cạn dịch chiết methanol luồng khí nitơ, hòa tan cắn 500 µl methanol rổi tiêm vào hệ thống LC – MS/MS 3.1.2.2 Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố dạng tồn phần Đã thiết lập quy trình thủy phân xử lý dịch thủy phân: a/ Quy trình sử dụng ly tâm lạnh kết hợp chiết lỏng - lỏng sau thủy phân Khoảng g thịt nhuyễn thể xay nhuyễn đồng hóa chiết lần với ml methanol ml methanol Sau q trình chiết, cạn dịch chiết methanol dười luồng khí nitơ, hóa tan cắn 500 µl methanol Thêm 150 µl NaOH 2,5 M, lắc xốy 30 giây đun cách thủy 76oC 30 phút, sau thêm 150 µl HCl 2,5 M lắc xốy 30 giây Pha lỗng dịch sau thuỷ phân với 0,2 ml H2O chiết ml isopropyl acetat Lấy lớp isopropyl acetat bên trên, sau cạn luồng nitơ, cắn hòa tan 500 µl methanol, ly tâm 4oC phút với tốc độ 14000 vòng/phút, dịch dùng đưa vào hệ thống LC–MS/MS b/ Quy trình xử lý qua cột chiết pha rắn sau thủy phân Khoảng g thịt nhuyễn thể xay nhuyễn đồng hóa chiết lần với ml methanol ml methanol ống ly tâm dung tích 15 ml Sau lần chiết, ly tâm 14.000 vòng/phút 11 phút lấy dịch Gộp dịch chiết methanol cạn luồng khí nitơ hòa tan trở lại 500 µl methanol Thêm 150 µl NaOH 2,5 M, lắc xoáy 30 giây đun cách thủy 76 oC 30 phút, sau thêm 150 µl HCl 2,5 M lắc xốy 30 giây Cột chiết pha rắn Strata-X hoạt hóa ml methanol ml H2O khử ion Thêm 2,2 ml nước vào dịch thủy phân, loắc xoáy 30 giây nạp qua cột Strata-X tốc độ khoảng ml/phút, rửa cột ml H2O rửa giải ml methanol Cô cạn dịch rửa giải luồng khí nitơ hòa tan trở lại 500 µl methanol, tiêm vào hệ thống LC – MS/MS Trong hai quy trình này, quy trình a đơn giản lựa chọn để thiết lập phương pháp phân tích OA, DTX1 DTX2 tồn phần 3.1.3 Khảo sát thiết lập bảo quản nhuyễn thể Đã thiết lập điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể sau: - Vận chuyển mẫu nhuyễn thể thực thùng xốp kín có đá khơ bảo quản thời gian tổng cộng không 48 - Trong trường hợp thực đợt lấy mẫu nhiều ngày, bảo quản mẫu nhuyễn thể ngăn đá tủ lạnh thời gian tổng cộng không 14 ngày chờ vận chuyển mẫu phòng thí nghiệm - Bảo quản dài ngày mẫu nhuyễn thể để chờ xử lý mẫu phân tích mẫu tủ lạnh âm sâu -78 oC Thời gian bảo quản tủ lạnh âm sâu không tháng tiến hành xử lý mẫu phân tích 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích OA, DTX1 DTX2 3.2.1 Điều kiện phương pháp thẩm định 3.2.1.1 Phương pháp phân tích độc tố tự cột Cortecs Sử dụng điều kiện xử lý mẫu mục 3.1.2.1.a, điều kiện phân tích sắc ký mục 3.1.1.2.b điều kiện detector MS/MS mục 3.1.1.1 3.2.1.2 Phương pháp phân tích độc tố tự toàn phần cột Zorbax Sử dụng điều kiện xử lý mẫu mục 3.1.2.1.b phân tích độc tố tự mục 3.1.2.2.a phân tích độc tố tồn phần, điều kiện phân tích sắc ký mục 3.1.1.2.a điều kiện detector MS/MS mục 3.1.1.1 3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích độc tố tự cột Cortecs 3.2.2.1 Độ đặc hiệu Phương pháp đặc hiệu với OA, DTX1, DTX2 với số điểm IP cho độc tố (ion sơ cấp [M-H]- (m/z 803 với OA, DTX2 m/z 817 với DTX1) ion thứ cấp m/z 255 563 tạo từ ion sơ cấp phân tích mẫu thử LC – MS/MS chế độ MRM), trình tách sắc ký cột Cortecs tách riêng độc tố, cho phép xác định vị trí pic độc tố theo thời gian lưu (xem hình 3.18), tỷ lệ đáp ứng ion m/z 12 563 so với ion m/z 255 dung dịch chuẩn khoảng %, mẫu thử có độc tố đảm bảo khoảng ± 50 % so với dung dịch chuẩn A B OA DTX2 C DTX1 D OA DTX2 E DTX1 F Hình 3.18 Đánh giá độ đặc hiệu cột Cortecs (A: sắc ký đồ mẫu nhuyễn thể không chứa độc tố; B: sắc ký đồ MeOH; C, D: sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp; E, F: sắc ký đồ mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn độc tố) 3.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống Kết đánh giá dung dịch chuẩn độc tố OA, DTX1, DTX2 phân tích lặp lại lần cho thấy phương pháp đạt yêu cầu thích hợp hệ thống có độ lặp lại tốt thời gian lưu (RSD ≤ 0,5 %) diện tích pic (RSD ≤ 0,9 %) với độc tố, tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 ion m/z 255 xấp xỉ %, với RSD ≤ 1,4 % phân tích lặp lại 3.2.2.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc Quan hệ tuyến tính nồng độ độc tố OA, DTX1, DTX2 với đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 255 khảo sát khoảng nồng độ từ ng/ml – 100 ng/ml (tại nồng độ 5, 10, 20, 50, 100 ng/ml) Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ này, với độc tố có quan hệ tuyến tính tốt nồng độ độc tố đáp ứng diện tích pic sắc ký đồ với r > 0,99 3.2.2.4 Độ xác - Độ lặp lại ngày: Mẫu vẹm xanh không chứa độc tố thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 mức nồng độ 12,5 ng/g, 25,0 ng/g 50,0 ng/g, tiến hành xử lý mẫu độc lập lần mức thêm chuẩn ngày phân tích Mức RSD nồng độ độc tố định lượng lần phân tích giao động từ 2,0 % đến 4,2 %, đạt yêu cầu độ xác AOAC 13 - Độ xác trung gian: Các mẫu vẹm xanh không chứa độc tố thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 nồng độ tương tự đánh giá độ lặp lại ngày xử lý mẫu phân tích thành lần độc lập ngày khác Mức RSD nồng độ độc tố định lượng lần phân tích giao động từ 2,0 % đến 3,7 %, đạt yêu cầu độ xác AOAC - Ảnh hưởng nhuyễn thể lên độ xác phương pháp: thêm độc tố mức 25 ng/g vào mẫu khơng chứa độc tố khác (hàu, sò huyết, sò lơng, ngao) RSD với độc tố dao động từ 3,4 % - 4,8 % mẫu, đạt yêu cầu độ xác AOAC mức nồng độ Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ xác phân tích độc tố dạng tự nhuyễn thể 3.2.2.5 Độ - Đánh giá tỷ lệ tìm lại mẫu thêm chuẩn mục 3.2.2.4, tỷ lệ thu hồi tính chung độc tố mức 12,5 ng/g 89,4 % – 99,9 %, mức 25,0 ng/g từ 90,0 % – 99,9 %, mức 50,0 ng/g từ 90,5 % - 99,7 %, đạt yêu cầu độ AOAC - Đánh giá tỷ lệ thu hồi mức thêm chuẩn 25,0 ng/g loại mẫu nhuyễn thể (xem 3.2.2.4), tỷ lệ thu hồi độc tố nằm khoảng 88,2 % - 99,1 %, đạt yêu cầu độ AOAC Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ phân tích độc tố dạng tự nhuyễn thể 3.2.2.6 Độ nhạy Để xác định LOQ LOD phương pháp với OA, DTX1, DTX2 hai tiêu chí sau tính đến: - Tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) pic độc tố với ion thứ cấp m/z 255 dùng để định lượng phải đạt 10 LOQ LOD - Tỷ lệ đáp ứng ion thứ cấp m/z 563 so với ion thứ cấp m/z 255 phải đạt khoảng ± 50 % giá trị trung bình thu mẫu chuẩn để đảm bảo độ tin cậy định tính Kết thực nghiệm cho thấy với độc tố LOQ 2,5 ng/g LOD 1,0 ng/g 3.2.3 Phương pháp phân tích OA, DTX1, DTX2 tự toàn phần cột Zorbax Eclipse Plus 3.2.3.1 Độ đặc hiệu Do sử dụng điều kiện MS/MS, phương pháp có độ đặc hiệu điểm IP, tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 ion m/z 255 tương tự 3.2.2.1 Quá trình tách sắc ký cột Zorbax Eclipse Plus cho phép 14 tách riêng độc tố sắc ký đồ, nhờ định danh phân biệt nhờ thời gian lưu (xem hình 3.21) Như vậy, phương pháp đủ đặc hiệu để phân tích OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể B A OA DTX2 C OA DTX2 E DTX1 DTX1 D F Hình 3.21 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu cột Zorbax Eclipse Plus (A: MeOH; B: mẫu nhuyễn thể không chứa độc tố; C, D: dung dịch chuẩn độc tố; E, F: mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn độc tố) 3.2.3.2 Độ thích hợp hệ thống Kết đánh giá dung dịch chuẩn độc tố OA, DTX1, DTX2 phân tích lặp lại lần cho thấy phương pháp đạt yêu cầu thích hợp hệ thống có độ lặp lại tốt thời gian lưu (RSD ≤ 0,4 %) diện tích pic (RSD ≤ 1,6 %) với độc tố, tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 ion m/z 255 xấp xỉ %, với RSD ≤ 2,0 % phân tích lặp lại 3.2.3.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc Quan hệ tuyến tính nồng độ độc tố OA, DTX1, DTX2 với đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 255 khảo sát khoảng nồng độ từ ng/ml – 100 ng/ml (tại nồng độ 5, 10, 20, 40, 80 100 ng/ml) Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ này, với độc tố có quan hệ tuyến tính tốt nồng độ độc tố đáp ứng diện tích pic sắc ký đồ với r > 0,99 3.2.3.4 Độ xác a Phân tích độc tố tự - Độ lặp lại ngày: Mẫu vẹm xanh không chứa độc tố thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 mức nồng độ 2,5 ng/g, 5,0 ng/g 20,0 ng/g 40,0 ng/g, mẫu chuẩn chứa 1,07 ppm OA, DTX1 0,86 ppm DTX2 tiến hành xử lý mẫu độc lập lần ngày phân tích Mức RSD nồng độ độc tố định lượng lần phân tích mẫu thêm chuẩn giao 15 động từ 1,1 % đến 8,0 %, mẫu chuẩn dao động từ 2,6 % - 3,6 % tính chung độc tố, đạt yêu cầu độ xác AOAC - Độ xác trung gian: Các mẫu vẹm xanh không chứa độc tố thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 nồng độ tương tự đánh giá độ lặp lại ngày xử lý mẫu phân tích thành lần độc lập ngày khác Mức RSD nồng độ độc tố định lượng lần phân tích giao động từ 1,9 % đến 8,1 %, đạt yêu cầu độ xác AOAC - Ảnh hưởng nhuyễn thể lên độ xác phương pháp: thêm độc tố mức 20 ng/g vào mẫu khơng chứa độc tố khác (hàu, sò huyết, sò lơng, ngao) RSD với độc tố dao động từ 3,9 % - 5,1 % mẫu, đạt yêu cầu độ xác AOAC mức nồng độ b Phân tích độc tố tồn phần - Độ lặp lại ngày: tiến hành thủy phân lần mẫu hàu có OA dạng tự dẫn xuất, mẫu hàu có DTX2 dạng tự dẫn xuất, mẫu chuẩn có tổng lượng OA 2,4 ppm, DTX1 1,1 ppm DTX2 2,2 ppm Tiến hành phân tích tổng lượng độc tố, đánh giá độ giao động kết định lượng độc tố lần phân tích RSD 3,1 % mẫu có tổng hàm lượng OA khoảng 9,7 ng/g, RSD 3,3 % mẫu có tổng hàm lượng DTX2 khoảng 10,3 ng/g, RSD 4,9 % với OA, 4,4 % với DTX1, 4,3 % với DTX2 mẫu chuẩn, đạt yêu cầu độ xác AOAC - Độ xác trung gian: tiến hành thủy phân lần mẫu hàu có OA mẫu hàu có DTX2 dạng tự dẫn xuất ngày khác Tiến hành phân tích tổng lượng độc tố, đánh giá độ giao động kết thu lần phân tích RSD 2,9 % mẫu có hàm lượng OA khoảng 9,7 ng/g, RSD 3,0 % mẫu có hàm lượng DTX2 khoảng 10,3 ng/g, đạt yêu cầu độ xác AOAC Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ xác phân tích dạng tự tổng lượng độc tố OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể 3.2.3.5 Độ a Phân tích độc tố tự Đánh giá độ tiến hành mẫu thêm chuẩn, mẫu thêm chuẩn vào nhuyễn thể khác mẫu chuẩn 3.2.3.4.a Trên mẫu thêm chuẩn, tỷ lệ thu hồi tính chung độc tố mức thêm chuẩn 2,5 ng/g từ 73,4 % - 112,9 %, mức 5,0 ng/g từ 92,1 % 109,8 %, mức 20,0 ng/g từ 89,4 % - 101,1 %, mức 40 ng/g từ 88,7 % 99,5 %, mẫu thêm chuẩn 20,0 ng/g vào nhuyễn thể khác 16 từ 87,7 % - 98,4 %, mẫu chuẩn từ 89,9 % - 99,5 % Kết đạt yêu cầu độ AOAC mức nồng độ tương ứng b Phân tích độc tố toàn phần Đánh giá độ thực mẫu chuẩn 3.2.3.4.b Xét chung độc tố, tỷ lệ thu hồi từ 88,9 % - 99,8 %, đạt yêu cầu độ AOAC mức nồng độ tương ứng Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ phân tích dạng tự tổng lượng độc tố OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể 3.2.3.6 Độ nhạy Tiến hành đánh giá độ nhạy theo tiêu nêu 3.2.2.6, kết thực nghiệm cho thấy với độc tố LOQ 2,5 ng/g LOD 1,0 ng/g OA (1) OA (2) DTX2 (3) DTX2 (4) OA OA (5) (6) DTX2 (7) (8) (9) (10) OA Hình 3.24 Một số sắc ký đồ phân tích MS/MS (1-4: dung dịch chuẩn hỗn hợp;5: mẫu hàu 1; 6: mẫu vẹm 12;7: mẫu hàu 10; 8: mẫu vẹm khơng phát có độc tố;9: mẫu sò huyết 5; 10: MeOH; số thứ tự mẫu nhuyễn thể bảng 3.25) 3.3 PHÂN TÍCH OA, DTX1, DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ Sử dụng phương pháp thẩm định, luận án phân tích 188 mẫu nhuyễn thể lấy tỉnh khác Trong đó, 19 mẫu phát thấy độc tố dạng tự (17 mẫu có OA, mẫu có DTX2) mẫu phát 17 thấy OA dạng dẫn xuất sau thủy phân (xem bảng 3.25).Không mẫu phát thấy DTX1 Tỷ lệ phát độc tố cao sò huyết (22,2 %), tới hàu (20,8 %), sò lơng (10,0 %), vẹm (6,8 %), riêng ngao không phát mẫu nhiễm độc tố Một số sắc ký đồ đại diện mẫu thực trình bày hình 3.24 Bảng 3.25 Tổng hợp kết mẫu phát có độc tố ST T Loài nhuyễn thể Thời điểm lấy mẫu Nơi lấy mẫu Loại độc tố phát thấy 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Hàu Hàu Hàu Hàu Sò huyết Hàu Sò huyết Vẹm Hàu Hàu Sò lơng Vẹm Hàu Hàu Sò huyết Sò huyết Sò lơng Sò huyết Sò huyết Hàu Hàu Vẹm Vẹm 11/2016 11/2016 9/2016 2/2017 12/2016 10/2016 9/2016 12/2016 2/2017 3/2017 4/2016 4/2016 6/2016 9/2016 11/2016 11/2016 12/2016 1/2017 3/2017 3/2017 4/2016 9/2016 12/2016 Thanh Hoá Thanh Hoá Thanh Hoá Thanh Hoá Nam Định Thanh Hoá Nam Định Bình Định Thanh Hố Thanh Hố Thanh Hố Phú n Thanh Hố BR-VT Bình Định Nam Định Thanh Hố Nam Định Nam Định Thanh Hoá Thanh Hoá Phú Yên Phú Yên OA OA OA OA OA OA OA OA DTX2 DTX2 OA OA OA OA OA OA OA OA OA OA OA OA OA Hàm lượng độc tố tự (ng/g) (TB±SD, n = 3) 9,5 ± 0,1 5,1 ± 0,1 4,7 ± 0,2 4,3 ± 0,1 3,9 ± 0,1 3,1 ± 0,2 3,1 ± 0,2 4,4 ± 0,1 6,4 ± 0,3 + + + + + + + + + + - Hàm lượng độc tố toàn phần ng/g (TB±SD, n = 3) 10,7 ± 0,4 8,2 ± 0,3 9,7 ± 0,3 10,4 ± 0,3 11,3 ± 0,7 5,1 ± 0,3 4,9 ± 0,3 2,9 ± 0,3 5,2 ± 0,3 10,3 ± 0,6 + + + + + + + + + + + + + Tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 so với ion m/z 255 (%, TB ±SD, n = 3) 8,6 ± 0,4 8,3 ± 0,3 8,5 ± 0,3 8,8 ± 0,5 8,8 ± 0,3 8,5 ± 0,5 8,3 ± 0,6 8,6 ± 0,3 8,5 ± 0,5 8,4 ± 0,4 8,0 ± 0,6 8,3 ± 0,4 8,1 ± 0,7 8,4 ± 0,4 8,5 ± 0,5 8,3 ± 0,6 8,2 ± 0,3 8,6 ± 0,7 8,5 ± 0,8 8,7 ± 0,9 7,9 ± 0,6 8,2 ± 0,4 8,7 ± 0,6 Chú thích: “-”: khơng phát thấy,“+” : phát thấy mức thấp LOQ; BR-VT: Bà Rịa - Vũng Tàu Trong địa điểm lấy mẫu, riêng Đà Nẵng (số mẫu lấy 12 mẫu) khơng phát thấy mẫu có độc tố Tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố cao Thanh Hóa (có 12 mẫu 10 mẫu phát OA mẫu phát DTX2 tổng số 62 mẫu chiếm 19,3 %), tới Nam Định (có mẫu phát OA tổng số 42 mẫu chiếm 11,9 %) Bình Định (có 18 mẫu phát OA tổng số 24 mẫu chiếm 8,3 %), Phú Yên (có mẫu phát OA tổng số 36 mẫu chiếm 8,3 %), Bà Rịa-Vũng Tàu (có mẫu phát OA tổng số 12 mẫu chiếm 8,3 %) Theo thời gian lấy mẫu, tỷ lệ phát độc tố nhuyễn thể cao vào quý 4/2016 (phát mẫu có độc tố tổng số 51 mẫu chiếm 17,6 %), đến quý 1/2017 (phát mẫu có độc tố tổng số 51 mẫu chiếm 11,9 %), thấp vào quý 2/2016 ( phát mẫu có độc tố tổng số 42 mẫu chiếm 9,5 %) thấp quý 3/2016 (phát mẫu có độc tố tổng số 44 mẫu chiếm 9,1 %) CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1.Về phương pháp phân tích xây dựng Nghiên cứu xây dựng quy trình tách độc tố OA, DTX1, DTX2 cột siêu hiệu Zorbax Eclipse Plus cột hiệu cao Cortecs Với cột Cortecs, thành phần pha động sử dụng đơn giản hơn, gồm acetonitril nước chứa 0,1 % acid formic sử dụng chương trình gradient Với cột Zorbax, thành phần pha động có thêm amoni format sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng So với nhiều phương pháp sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS khác cơng bố, quy trình phân tích cột UPLC Zorbax Eclipse Plus xây dựng luận án đơn giản hơn, không cần rửa giải gradient cho thời gian phân tích nhanh Quy trình phân tích cột HPLC Cortecs cho thời gian phân tích nhanh số phương pháp khác cột HPLC Hai quy trình phân tích sắc ký luận án thẩm định chứng minh phù hợp để tách OA, DTX1, DTX2, cung cấp giải pháp kỹ thuật thích hợp với hệ thống HPLCMS phổ biến hệ thống UPLC-MS tiên tiến Trong nghiên cứu này, bên cạnh sử dụng ion thứ cấp m/z 255 m/z 563 ion sơ cấp [M-H]- để định tính cho độc tố (đảm bảo số điểm định danh IP 4, đáp ứng yêu cầu Châu Âu), tỷ lệ cường độ ion thứ cấp m/z 255 563 đưa vào tiêu chí định tính độc tố Trong khn khổ tìm hiểu kết cơng bố liên quan tới định tính, định lượng OA DTX, nhóm nghiên cứu chưa thấy có đề cập tới việc đánh giá tỷ lệ cường độ ion thứ cấp phân tích LC – MS/MS Như vậy, phương pháp xây dựng có điểm so với kết công bố trước quy định giới hạn tỷ lệ cường độ ion thứ cấp phân tích định tính Điều cho phép đảm bảo chắn kết phát độc tố nhuyễn thể, hạn chế nguy dương tính giả Phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS xây dựng luận án cho độ đặc hiệu cao phân tích OA, DTX1, DTX2 19 nhờ đặc điểm detector MS/MS, điều với phương pháp định lượng chuột MBA hay phương pháp HPLC với detector huỳnh quang TCVN 8341:2010 đặc hiệu với OA, không phát DTX Bên cạnh đó, phương pháp MBA hay phương pháp TCVN 8341:2010 không đánh giá phần độc tố dạng ester nhuyễn thể, phương pháp xây dựng luận án cho phép đánh giá tổng lượng độc tố, bao gồm dạng ester Phương pháp phân tích xây dựng có độ nhạy cao, với LOQ = 2,5 ng/g LOD = 1,0 ng/g Mức LOD, LOQ nhạy so với số phương pháp công bố Với quy định Việt Nam giới hạn cho phép độc tố nhóm OA nhuyễn thể (£ 160 ng/g tính theo OA) hay giới hạn chặt châu Âu (£ 45 ng/g tính theo OA), phương pháp xây dựng đáp ứng tốt độ nhạy, phương pháp TCVN 8341:2010 khơng đáp ứng yêu cầu kiểm soát độc tố nhuyễn thể Về điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể, luận án đưa phương án chiết độc tố đơn giản methanol, sử dụng lượng dung môi khối lượng nhuyễn thể thấp nhiều so với số phương pháp công bố mà đảm bảo chiết hết độc tố nhuyễn thể Việc làm dịch chiết trước phân tích LC – MS/MS thiết lập theo cách, sử dụng cột SPE (Strata-X) ly tâm lạnhở oC, cách sử dụng ly tâm lạnhcho phép làm dịch chiết nhanh, đơn giản, tốn so với dùng cột SPE phương pháp mới, chưa có tài liệu tham khảo sử dụng ly tâm lạnh để làm dịch chiết Bên cạnh quy trình làm cột SPE đơn giản số quy trình cơng bố, khơng cần có thêm bước làm bổ sung trước nạp cột Để phân tích độc tố tồn phần, luận án thiết lập điều kiện thủy phân với thời gian thủy phân 30 phút, ngắn so với thời gian từ 40 phút trở lên số nghiên cứu Đồng thời, nghiên cứu xây dựng cách xử lý dịch thủy phân chiết lỏng-lỏng với dung môi isopropyl acetat kết hợp ly tâm lạnh oC cột SPE (Strata-X) đảm bảo thu hồi tốt lượng độc tố có mẫu loại trừ ảnh hưởng dịch thủy phân tới kết phân tích LC – MS/MS 4.2 Về kết phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể Kết thực nghiệm 188 mẫu nhuyễn thể cho thấy độc tố gây DSP thuộc nhóm OA diện phổ biến nhuyễn thể Việt Nam theo địa phương (xuất 5/6 tỉnh lấy mẫu), thời gian (xuất 9/12 tháng lấy mẫu) loại nhuyễn thể (xuất 4/5 loại lấy 20 mẫu) Như vậy, nguy xảy DSP Việt Nam có việc kiểm sốt độc tố nhóm OA cần thiết Tuy nhiên, cần khẳng định nguy DSP hữu song không mức cao, tất mẫu phát thấy độc tố mức thấp, 1/10 giới hạn cho phép (160 ng/g tính theo OA) Trong độc tố phân tích, OA độc tố xuất phổ biến (21/23 mẫu có độc tố), đến DTX2 (2/23 mẫu có độc tố), khơng phát thấy mẫu có DTX1 So với số nghiên cứu sử dụng phương pháp MBA, tỷ lệ nhiễm độc tố mức nhiễm độc tố nhuyễn thể phát cao so với kết phân tích LC-MS/MS luận án, chứng tỏ thiếu đặc hiệu MBA dẫn tới dương tính giả, cho thấy cần thiết phải sử dụng LC – MS/MS kỹ thuật có độ đặc hiệu tương đương để phân tích khẳng định lại kết MBA kết phân tích dương tính với MBA Phương pháp TCVN 8341:2010 cần xem lại tính phù hợp phương pháp khơng cho phép phân tích DTX1, DTX2 DTX3 nhuyễn thể Kết mẫu nhuyễn thể cho thấy tỷ lệ phát thấy độc tố nhuyễn thể cao điểm lấy mẫu miền Bắc vào quý quý (tương ứng thời kỳ mùa mưa miền Nam cuối thu, đôngvà đầu xuân miền Bắc Việt Nam) Đây kết tổng hòa từ yếu tố địa lý, khí hậu khác biệt thành phần loại mẫu nhuyễn thể lấy theo địa điểm thời gian 4.3 Về nguy ảnh hưởng tới sức khỏe hướng kiểm soát độc tố nhóm OA nhuyễn thể tương lai Hội chứng DSP xảy người dễ lẫn với nguyên nhân ngộ độc khác nên hồn tồn có khả khơng ghi nhận đầy đủ Việt Nam Vì vậy, có mặt phổ biến độc tố nhóm OA nhuyễn thể ghi nhận trình thực luận án cho thấy việc tăng cường giám sát an toàn vệ sinh nhuyễn thể mặt độc tố đắn, cần thực sát sao, chặt chẽ tương lai, với việc quy định sử dụng kỹ thuật thích hợp đủ đặc hiệu, đủ nhạy LC - MS/MS làm phương pháp chuẩn để phát độc tố nhóm OA nhuyễn thể KẾT LUẬN Luận án “Nghiên cứu xác định độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 số nhuyễn thể hai mảnh vỏ biển Việt Nam sắc ký lỏng khối phổ” hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: 21 Đã nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đồng thời độc tố gây tiêu chảy OA, DTX1 DTX2 nhóm nhuyễn thể lấy mẫu vùng bờ biểnViệt Nam v Đã xác định điều kiện LC - MS/MS phù hợp để phân tích đồng thời độc tố OA, DTX1 DTX2 Xây dựng điều kiện để tách độc tố cột Cortecs C18 với chế độ rửa giải gradient cột Zorbax Eclipse Plus C18 với chế độ rửa giải đẳng dòng, phá thiện định lượng độc tố MS/MS với nguồn ion hóa ESI chế độ ion âm, độc tố lựa chọn ion gần phân tử proton [M-H]-để tiếp tục phân tích chế độ MRM sau bắn phá tạo ion thứ cấp, ion thứ cấp m/z 255 sử dụng để định lượng, có mặt ion thứ cấp m/z 563 tỷ lệ đáp ứng ion so với ion m/z 255 sử dụng định tính khẳng định có mặt độc tố v Đã khảo sát lựa chọn dung môi điều kiện để chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể, lựa chọn MeOH làm dung mơi chiết thích hợp Đã thiết lập quy trình làm dịch chiết cột chiết pha rắn Strata-X ly tâm lạnh 4oC để phân tích OA, DTX1 DTX2 dạng tự LC-MS/MS v Đã thiết lập điều kiện thủy phân để chuyển độc tố OA, DTX1 DTX2 từ dạng ester dạng độc tố tự điều kiện làm dịch thủy phân chiết lỏng-lỏng với isopropyl acetat kết hợp ly tâm lạnh oC chiết pha rắn cột Strata-X v Đã đánh giá độ ổn định độc tố nhuyễn thể điều kiện bảo quản mát vận chuyển, bảo quản lạnh để lưu trữ tạm thời bảo quản lạnh sâu để lưu trữ dài hạn, từ thiết lập điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể từ lấy mẫu đến phân tích v Từ điều kiện phân tích LC - MS/MS điều kiện xử lý mẫu thiết lập được, xây dựng thẩm định phương pháp: - Phương pháp phân tích độc tố OA, DTX1, DTX2 dạng tự LCMS/MS cột Cortecs sử dụng làm dịch chiết mẫu chiết pha rắn cột Strata-X - Phương pháp phân tích độc tố OA, DTX1, DTX2 dạng tự toàn phần LC-MS/MS cột Zorbax Eclipse Plus với xử lý dịch chiết để phân tích độc tố tự ly tâm lạnh phân tích độc tố tồn phần thủy phân kiềm kết hợp làm chiết lỏng-lỏng ly tâm lạnh oC Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ nhạy cao, cho phép định lượng độc tố OA, DTX1 DTX2 nhuyễn thể với LOQ cho độc tố 2,5 ng/g, cho phép phát độc tố với LOD mức ng/g LOD, LOQ phương pháp thấp nhiều giới hạn cho phép (160 ng/g), phương pháp xây dựng 22 đủ độ nhạy để đánh giá mức độ nhiễm độc tố OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể Đã tiến hành phân tích độc tố OA, DTX1 DTX2 dạng tự toàn phần 188 mẫu nhuyễn thể thuộc nhóm (vẹm, hàu, ngao, sò huyết, sò lơng) lấy địa phương ven biển Việt Nam (Nam Định, Thanh Hóa, Đà Nẵng, Bình Định, Phú n, Bà Rịa - Vũng Tàu) vòng 12 tháng Kết phát thấy 23 mẫu có độc tố, gồm 21 mẫu có OA, mẫu có DTX2, mức thấp nhiều giới hạn quy định cho phép khơng phát mẫu có độc tố DTX1 Tuy nhiên, kết luận án cho thấy độc tố gây tiêu chảy, OA, có mặt phổ biến nhuyễn thể vùng bờ biển Việt Nam theo nhóm nhuyễn thể (có 4/5 nhóm lấy mẫu) lẫn vùng địa lý (phát thấy mẫu 5/6 địa phương lấy mẫu) KIN NGH ă Cỏc c quan chc nng cn cú biện pháp phù hợp để nâng cao nhận thức người nuôi trồng, đánh bắt thủy hải sản, có nhuyễn thể, mối nguy hiểm tiềm tàng ca c t hi sn ă Cn thc hin thường xuyên, chặt chẽ việc giám sát độc tố hải sản để đảm bảo an toàn ca hi sn lu hnh trờn th trng ă Trong kiểm sốt độc tố nhóm OA nhuyễn thể, thay phương pháp TCVN 8341:2010 tại, quan chức nên xem xét quy định sử dụng LC-MS/MS làm kỹ thuật thức để phân tích độc tố Đồng thời, thay phát triển phương pháp cố định, nên quy định cụ thể độ nhạy, độ tin cậy mà phương pháp LC-MS/MS cần đạt để sử dụng phân tích độc tố nhóm OA nhuyễn thể Như vừa đảm bảo độ tin cậy kết phân tích, vừa cho phép phòng thí nghiệm đưa giải pháp kỹ thuật phù hợp cách linh hoạt tùy thuc iu kin trang thit b sn cú ă Cn tiếp tục triển khai nghiên cứu đánh giá toàn diện, dài hạn thực trạng, nguy có mặt độc tố vi tảo khác ngồi nhóm độc tố gây tiêu chảy nhuyễn thể hai mảnh vỏ tìm hiểu khả có mặt độc tố vi tảo nói chung, có độc tố gây tiêu chảy, nhóm sinh vật biển khác ngồi nhuyễn thể hai mảnh vỏ 23 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN TỚI ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Tống Thị Thanh Vượng, Vũ Ngọc Khánh, Trần Cao Sơn, Lê Đình Chi, Lê Thị Hồng Hảo (2016), “Xây dựng quy trình xác định acid okadaic Vẹm xanh LC-MS/MS”, Tạp chí Nghiên cứu dược thông tin thuốc, tập 7, số 4+5, trang 97 - 102 Tống Thị Thanh Vượng, Trần Thị Hằng, Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Lê Đình Chi (2017), “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ba độc tố acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 dạng tự nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng siêu hiệu kết nối khối phổ hai lần (UPLC - MS/MS)”, Tạp chí Dược học, số 495, trang 21 - 24 Tống Thị Thanh Vượng, Lê Thị Hồng Hảo, Lê Đình Chi (2017), “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời tổng hàm lượng ba độc tố acid okadaic, dinophysistoxin-1 dinophysistoxin-2 nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng siêu hiệu kết nối khối phổ hai lần (UPLC- MS/MS)”, Tạp chí Dược học, số 500, trang 13 - 16 Lê Đình Chi, Tống Thị Thanh Vượng, Lê Thị Hồng Hảo (2018), “Đánh giá hàm lượng ba độc tố acid okadaic, dinophysistoxin-1 dinophysistoxin-2 sò lơng sò huyết số vùng ven biển Việt Nam”, Tạp chí Dược học, số 502, trang 20 - 23 Tong Thi Thanh Vuong, Le Thi Hong Hao, Tu Binh Minh, Le Dinh Chi (2018), “Spatial and seasonal variation of diarrheic shellfish poisoning (DSP) toxins in bivalve mollusks from some coatal regions of Vietnam and assessment of potential health risks”, Marine Pollution Bulletin, 133, 911-919 24 ... KẾT LUẬN Luận án Nghiên cứu xác định độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 số nhuyễn thể hai mảnh vỏ biển Việt Nam sắc ký lỏng khối phổ” hoàn thành mục tiêu. .. lượng độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 sắc ký lỏng khối phổ v Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng độc tố kể số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ lấy vùng biển Việt Nam. .. để xác định OA DTX hải sản, cần có nghiên cứu đánh giá thực tế có mặt OA DTX hải sản để kiểm soát hiệu sát thực tế nhóm độc tố Việt Nam Do vậy, luận án Nghiên cứu xác định độc tố gây tiêu chảy