Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố okadaic acid, DTX1, DTX2 trong vẹm vỏ xanh

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ NGỌC KHÁNH Mã sinh viên: 1101270 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ OKADAIC ACID, DTX1, DTX2 TRONG VẸM VỎ XANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ NGỌC KHÁNH Mã sinh viên: 1101270 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ OKADAIC ACID, DTX1, DTX2 TRONG VẸM VỎ XANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Tống Thị Thanh Vƣợng TS Trần Cao Sơn Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia HÀ NỘI – 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, em hoàn thành khóa luận Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tống Thị Thanh Vượng tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em suốt trình thực đề tài viết khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia, PGS TS Lê Thị Hồng Hảo tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Cao Sơn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em gửi lời cảm ơn tới anh chị, người làm việc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Vũ Ngọc Khánh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố sinh học biển 1.2 Độc tố sinh học biển thủy sản 1.3 Khái quát chung độc tố nhóm Okadaic acid (OA) 1.3.1 Nguồn gốc tích tụ độc tố 1.3.2 Tính chất 1.3.3 Độc tính 1.3.4 Cơ chế gây độc 1.3.5 Triệu chứng ngộ độc 1.3.6 Tình hình ngộ độc 1.4 Các phương pháp xác định độc tố gây tiêu chảy 1.4.1 Thử nghiệm sinh học 1.4.2 Thử nghiệm sinh hóa 1.4.3 Thử nghiệm hóa học 1.5 Tổng quan tóm lược sắc ký lỏng khối phổ 13 1.6 Tóm lược phương pháp làm chiết pha rắn .16 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.2 Nguyên vật liệu-trang thiết bị 18 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.2 Dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 iii 2.3.1 Khảo sát phương pháp 19 2.3.2 Thẩm định phương pháp .19 2.3.3 Ứng dụng phương pháp 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp phân tích độc tố nhóm OA .20 2.4.2 Quy trình thẩm định phương pháp 21 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Khảo sát phương pháp phân tích DSP 24 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 24 3.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng 27 3.1.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 28 3.2 Thẩm định phương pháp 34 3.2.1 Tính đặc hiệu 34 3.2.2 Xác định khoảng tuyến tính 36 3.2.3 Độ lặp lại độ thu hồi 38 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 39 3.2.5 Bàn luận 40 3.3 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Hiệu hội cộng đồng phân tích Analytical Communites thức Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa hóa học áp suất ionization khí Amnesic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây trí APCI ASP nhớ CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lượng va chạm CI Chemical ionization Ion hóa hóa học CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy DTX1 Dinophysistoxin - DTX2 Dinophysistoxin - EI Electron impact Ion hóa va chạm điện tử ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử GC Gas Chromatography Sắc ký khí ghép khối phổ GS Ion Source Gas Khí nguồn ion HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IP Identification point Điểm nhận dạng IS Ionspray Voltage Thế phun ion LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần mass spectrometry v LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ MU Mouse unit Đơn vị chuột NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây độc thần kinh PSP Paralytic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây liệt R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi S/N Signal to noise ratio Tỉ số tín hiệu nhiễu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độc tính tương đương số độc tố DSP Bảng 1.2 Liều gây ngộ độc cấp tính độc tố DSP sau tiêm vào phúc mạc Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC-MS để xác định độc tố DSP 10 Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn in hóa ESI 24 Bảng 3.2 Kết bắn phá ion mẹ 24 Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá ion độc tố nhóm DSP 26 Bảng 3.4 Chương trình gradient 27 Bảng 3.5 Khảo sát qui trình chiết mẫu 30 Bảng 3.6 Khảo sát cột SPE .31 Bảng 3.7 Khảo sát thể tích rửa giải .32 Bảng 3.8 Ion mẹ ion độc tố gây tiêu chảy nhóm OA 34 Bảng 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic nồng độ độc tố gây tiêu chảy nhóm OA 36 Bảng 3.10 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định OA nhuyễn thể 38 Bảng 3.11 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX1 nhuyễn thể 38 Bảng 3.12 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX2 nhuyễn thể 39 Bảng 3.13 LOD LOQ độc tố DSP .39 Bảng 3.14 Kết phân tích độc tố DSP số mẫu thực 41 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Tảo độc chuỗi thức ăn Hình 1.2 Cấu trúc hóa học độc tố DSP Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo nguyên lý hoạt động thiết bị khối phổ 134 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa hoạt động hệ ESI-MS/MS 14 Hình 1.5 Bộ phân tích tứ cực chập ba 15 Hình 2.1 Mô hình thực nghiệm .20 Hình 3.1 Phổ khối ion mẹ OA DTX2 25 Hình 3.2 Phổ khối ion mẹ DTX1 .25 Hình 3.3 Phổ khối ion OA DTX2 26 Hình 3.4 Phổ khối ion DTX1 26 Hình 3.5 Sắc đồ ion tổng 28 Hình 3.6 Khảo sát qui trình chiết mẫu 29 Hình 3.7 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng qui trình chiết .30 Hình 3.8 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng cột chiết pha rắn SPE .31 Hình 3.9 Đồ thị khảo sát thể tích dung môi chiết .32 Hình 3.10 Qui trình xử lý mẫu tối ưu 34 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng 35 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL mẫu trắng thêm chuẩn OA DTX2 35 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL mẫu trắng thêm chuẩn DTX1 .35 Hình 3.14 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ OA .37 Hình 3.15 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ DTX1 37 Hình 3.16 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ DTX2 38 Hình 3.17 LOD OA DTX2 40 Hình 3.18 LOD DTX1 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo ước tính Tổ chức nông lương (FAO) nửa xuất thủy sản giới bắt nguồn từ nước phát triển 80% nhập thuộc nước phát triển Các sản phẩm từ thủy sản nguồn thu ngoại tệ quan trọng nước phát triển, có Việt Nam Một thị trường nhập lớn ngành thủy sản Việt Nam Liên minh Châu Âu (EU) Theo quy định Ủy ban liên minh Châu Âu, yêu cầu để nước khối EU xuất thủy sản vào EU phải thực chương trình giám sát dư lượng độc hại thủy sản nuôi (bao gồm nhuyễn thể hai mảnh vỏ) Đồng thời, thủy sản phải phân tích tiêu theo qui định EU trước xuất với đòi hỏi nghiêm ngặt kỹ thuật phân tích Hai nội dung liên quan đến kỹ thuật đóng vai trò việc thực chương trình định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả sinh độc tố) phân tích độc tố sinh học biển, độc tố gây tiêu chảy nhóm gây độc phổ biến Trong loài nhuyễn thể, vẹm vỏ xanh (Perna viridis) loài có nguy nhiễm độc tố tiêu chảy lớn Một số phương pháp ứng dụng để xác định độc tố gây tiêu chảy nhuyễn thể bao gồm phương pháp thử sinh học, phương pháp sinh hóa, phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Trong số đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phương pháp đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh xác Do đó, chọn đề tài: "Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2 vẹm vỏ xanh" Với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2 vẹm vỏ xanh LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để phân tích số mẫu vẹm Việt Nam 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích áp dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để tách xác định độc tố DSP: Okadaic acid, Dinophysistoxin-1, Dinophysistoxin-2 mẫu vẹm, thu kết sau: Đã khảo sát chọn điều kiện tối ưu cho hệ thống LC-MS/MS  Khảo sát điều kiện bắn phá ion mẹ, ion xác nhận định lượng chất  Chọn pha tĩnh cột Cortecs T M C18 (4,6 x 100 mm, 3,5 µm)  Chọn chương trình gradient tốc độ dòng pha động: Kênh A: HCOOH 0,1%; Kênh B: ACN Chương trình gradient (bảng 3.4) Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút Đã khảo sát đưa quy trình xử lý mẫu tối ưu (Hình 3.10) Thẩm định phương pháp  Xây dựng đường chuẩn, phương trình hồi quy tuyến tính độc tố, hệ số tương quan tuyến tính R ≥ 0,998  Nghiên cứu đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi phương pháp: Hiệu suất thu hồi đạt từ 63,1% đến 94,0%  Xác định giới hạn phát LOD độc tố vẹm từ 0,6 µg/kg – µg/kg Giới hạn định lượng từ µg/kg – µg/kg Áp dụng phương pháp 20 mẫu vẹm tỉnh Việt Nam Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu thêm độc tố biển khác ASP, NSP, PSP…  Mở rộng thêm đối tượng phân tích với loài khác ngao, sò, cua TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa Phân Tích, Tập 2, NXB Y Học Bộ Y Tế (2011), Kiểm nghiệm Dược phẩm, NXB Y Học Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thủy sản nghề muối (2010), ''Nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Xác định hàm lượng độc tố gây tiêu chảy (DSP) - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao'', Tiêu chuẩn Quốc Gia TCVN 8341:2010 Nguyễn Ngọc Lâm, Đoàn Như Hải (1996), Thực vật phù du biển có hại nguồn nước Việt Nam Trung tâm Kiểm tra Chất lượng vệ sinh thủy sản (1998), "Sản phẩm thủy sản đông lạnh - Thịt nghêu luộc", Tiêu chuẩn Ngành 28TCN118:1998 Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, NXB Khoa học & Kỹ thuật Tiếng Anh Alexander J., Audunsson GA., Benford D., Cockburn A., Cradevi J-P., Dogliotti E., Domenico AD., Fernandez-Cruz ML., Fink-Gremmels J., van Leeuwen R., van Peteghem C., Verger P (2008), Marine biotoxins in shellfish – Okadaic acid and analogues, pp.588-589 Alexander J., Benford D., Cockburn A., Cradevi J-P., Dogliotti, Domenico AD., Fernandez-Cruz ML., Fink-Gremmels J., Furst P., Galli C., Grandjean P., Gzyl J., Heinemeyer G., Johansson N., Mutti A., Schlatter J., van Leeuwen R., van Peteghem C., Verger P (2008), Marine biotoxins in shellfish – Yessotoxin group, pp.906-907 Andersen P (1996), Design and implementation of some harmful algal monitoring systems, IOC Technical series, No 44, UNESCO 10 Arjen Gerssen (2009), The analysis of lipophilic marine toxins, pp.33-83 11 Aune T., Yasumoto T., Engeland E (1991), ''Light and scanning electron microscopic studies on effects of marine algal toxins toward freshly prepared hepatocytes'', Journal of Toxicology and Environmental Healh 34, pp.1-9 12 Bébhine Carey, Maria José Fidalgo Sáez, Brett Hamilton, John O' Halloran, Frank N A M van Pelt, Kevin J James (2012), ''Elucidation of the mass fragmentation pathways of the polyether marine toxins, dinophysistoxins, and identification of isomer discrimination processes'', Rapid Communication in Mass Spectrometry 13 Botana LM., Rodriguez-Vieytes M., Alfonso A., Louzao MC (1996), ''Phycotoxins: paralytic shellfish posoning and diarrhetic shellfish poisoning'', Handbook of food analysis - residues and other food component analysis, Volume 2, pp.1147-1169 14 EURLMB, EU (2011), "Harmonised Standard Operating Procedure for Determination of Lipophilic Marine Biotoxins in Molluscs by LC– MS/MS", European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins 15 Daranas, Antonio H., Manuel Norte, and José J Fernández (2001), "Toxic marine microalgae." Toxicon 39.8, pp.1101-1132 16 Egmond, Hans P., M E Van Apeldoorn, and G J A Speijers (2004), Marine biotoxins, No 80 Food & Agriculture Org 17 Elie Fux, Daniel McMillan, Ronel Bire, Philipp Hess (2007), ''Development of an ultra - performance liquid chromatography - mass spectrometry method for the detection of lipophilic marine toxins'', Journal of Chromatography A 18 FAO (2004), "Marine biotoxins FAO food and nutrition paper, 80", pp.5392 19 Hallegraeff, G M., M A McCausland, and R K Brown (1995), "Early warning of toxic dinoflagellate blooms of Gymnodinium catenatum in southern Tasmanian waters." Journal of plankton research 17.6, pp.11631176 20 Hirofumi Goto, Tomoji Igarashi, Megumi Yamamoto, Manami Yasuda, Reiji Sekiguchi, Masatoshi Watai, Kenji Tanno, Takeshi Yasumoto (2000), ''Quantitative determination of marine toxins associated with diarrhetic shellfish poisoning by liquid chromatography coupled with mass spectrometry'', Journal of Chromatography A 21 Holland P., McNabb P (2003), Inter-laboratory Study of an LC-MS Method for ASP&DSP Toxins in Shellfish, Cawthron Report No 790, Nelson, New Zealand, Cawthron Institute 22 Honkanen RE., ''Characterization Codispoti BA., Tse K., Boynton AL (1994), of natural toxins with inhibitory activity against serine/threonine protein phosphatases'', Toxicon, pp.32-339 23 Hummert C., Reichelt M., Luckas B (1997), ''Automatic HPLC-UV Determination of Domoic Acid in Mussels and Algae'', Chromatographia 45, pp.284-288 24 Lee J.S., Yanagi T., Kenna R., Uasumoto T (1987), ''Fluorimetric determination of diarrhetic shellfish toxins by high-performance liquid chromatography'', Agric Biol Chem, 51, pp.877-881 25 Levine L., Fujiki H., Yamada K., Ojika M., Gjika H.B., Van Vunakis H (1988), ''Production of antibodies and development of a radioimmunoassay for okadaic acid'', Toxicon 26, pp1123 26 Nobuhiro Fusetani, William Kem (2009), Marine Toxins: An Overview, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp.26-28 27 O’Neil M.J (2001), The Merk Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 13th Edition, White house station, NJ: Merk&Co,Ins, pp.1119-1220 28 Robert E, Ardrey (2003), Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction, John Wiley & Sons, pp.7-73 29 Rosa Draisci, Luca Lucentini, Luigi Giannetti, Plerpaolo Boria, Angelo Stacchini (1995), Detection of diarrhoetic shellfish toxins in mussels from Italy by ionspray liquid chromatography-Mass spectrometry PHỤ LỤC: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ Khảo sát thể tích rửa giải ml ml ml Khảo sát cột làm SPE C18 Strata-X HLB Sắc đồ thêm chuẩn nồng độ khác ng/mL 10 ng/mL 20 ng/mL Sắc đồ dung môi mẫu trắng Okadaic acid Dinophysistoxin-1 Dinophysistoxin-2 Mẫu thực tế Vẹm Huế Vẹm Đà Nẵng Vẹm Cần Thơ Vẹm Sài Gòn Vẹm Cần Thơ thêm chuẩn 10 ng/mL