THI NGHIEM VI SINH 2017

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬ BÀI GIẢNG THÍ NGHIỆM VI SINH Người soạn: PHẠM THỊ KIM THẢO Đà Nẵng, 2012 NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài mở đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài 1: Làm môi trường để gieo cấy vi sinh vật Bài 2: Phân lập nuôi cấy vi sinh vật Bài 3: Sử dụng kính hiển vi Bài 4: Quan sát hình thái tế bào vi sinh vật Bài 5: Định lượng vi khuẩn hiếu khí Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM Buổi 1(Bài 1) Kiểm tra Chuẩn bị môi trường bao gói dụng cụ (Bài 1) Buổi (Bài 2) - Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất (sv năm thao tác chuẩn bị mẫu gieo cấy, làm quen vói tử cấy) - Cấy chuyển chủng vi sinh vật khiết , chuẩn bị cho Buổi 3: (Bài Bài 4) Nhận xét buổi Thí nghiệm trước, bao gồm kết Thực hành Buổi 4: (Bài 5) Thực hành YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Quy tắc làm việc phóng thí nghiệm vi sinh vật - Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp vệ sinh phòng thí nghiệm - Mỗi người nhóm có nơi làm việc riêng, sử dụng dụng cự thiết bị dành riêng cho Thiếu phải hỏi cán hướng dẫn Tuyệt đối không lấy người khác - Trong phòng thí nghiệm không ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… mặc áo Blue làm việc - Không tự điều chỉnh sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm chưa hướng dẫn - Sau thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm xếp gọn gàng nơi làm việc - Trước khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng cồn Nguyên tắc làm việc với giống vi sinh vật Trong điều kiện phóng thí nghiệm, vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng đặc lỏng đựng ống nghiệm, bình thủy tinh đĩa Petri Dụng cụ thủy tinh môi trường dinh dưỡng khử trùng trước cấy, phải tiến hành theo quy tắc định để đảm bảo giữ cho giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn vi sinh vật môi trường xung quanh Trước cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm ( bình thủy tinh đĩa Petri): - Tên môi trường - Tên giống vi sinh vật - Ngày cấy Tất thao tác trực bên cạnh lửa đèn cồn tốt hết thực phòng cấy vô trùng Sau cấy, phải đặt ống nghiệm ( dụng cụ khác có nuôi cấy vi sinh vật) vào tủ ổn nhiệt (còn gọi tủ ấm) Đối với dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật dùng xong, cần phải khử trùng nồi áp xuất, đem rửa Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc dung xong lớp dung dịch khử trùng giữ yên ngày sau đổ môi trường cọ rửa Tiến hành ghi chép thí nghiệm: Trong sổ phải ghi chép đầy đủ điều có liên quan đến việc hoàn thành thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng theo trật tự định Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu ngày kết thúc 2/ Đối tượng nghiên cứu 3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm 4/ Nguyên tắc phương pháp phân tích sử dụng 5/Kết nhận Các số liệu phai ghi thành bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình vẽ, ghi chép tất số liệu thực nghiệm tính toán vào sổ CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Kiến thức lý thuyết: Củng cố kiến thức sau: Ảnh hưởng nhân tố vật lý, hóa học tồn phát triển vi sinh vật + Nhân tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH + Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn - Nguyên nhân gây nhiễm dụng cụ tiếp xúc với không khí, dụng cụ hay vật phẩm có vi sinh vật Kỹ thực hành: Hình thành rèn luyện kỹ năng: - Bao gói dụng cụ làm nút cho ống nghiệm - Khử trùng dụng cụ môi trường nồi hấp áp suất cao tủ sấy 1.2 MỘT SỐ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH Các dụng cụ thủy tinh a Ống nghiệm: sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút gòn không thấm nước hay nhựa chịu nhiệt Hình 1: Ồng nghiệm b Đĩa petri: gồm nắp lớn đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm,12cm c Ống hút (pipette) - Ống hút có chia độ - Ống hút Pasteur d Micropipettes đơn kênh (Pipetman) Đây pipet xác, cho phép ta hút lượng chất xác - Đặc điểm cấu tạo : Hình 2: Đĩa petri Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) tip tương ứng - Đặc điểm phân loại: Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành loại: Bảng 1.1: Các loại pipetman thể tích tương ứng STT Loại pipet P-2 P-10 P-20 P-100 P-200 P-1000 Giới hạn sử dụng (l) 0.1-2 0.5-10 2-20 10-100 50-200 100-1000 Độ chia nhỏ nhất(l) 0.002 0.02 0.2 0.2 0.2 2.0 Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích Chú ý: - Cắm loại tip pipet (tương ứng với thể tích cần hút) - Không dốc ngược pipetman hút hóa chất - Không chỉnh giới hạn thể tích qui định thân pipet - Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhỏ ) e Các dụng cụ thủy tinh khác: Becher, Bình cầu đáy đáy tròn, Bình tam giác (Erlen), Bình Roux Các dụng cụ thiết bị khác a Dây cấy - Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật môi trường đặc - Dây cấy vòng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập Vi sinh vật môi trường lỏng môi trường đặc - Dây cấy thước thợ: dùng để cấy loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Những loại dây cấy thường làm kim loại không bị oxy hóa nhiệt độ cao b Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh vật theo dõi tăng trưởng vi sinh vật c Lò Pasteur (xem phần sau) d Autoclave (xem phần sau) e Nồi chưng cách thủy 1.3 BAO GÓI DỤNG CỤ Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khô - Bao gói phải kín cẩn thận để sau khử trùng đảm bảo vô trùng dụng cụ lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm khâu: - Làm nút bông: cho ống nghiệm, bình tam giác - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ khác a Cách làm nút - Với ống nghiệm: + Lấy không thấm nước cuộn lại + Ấn vào cuộn Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm + Yêu cầu: Nút có kích thước độ chặt vừa phải Đầu nút tròn, gọn, phần lớn phần Lấy nút hay đóng vào dễ dàng Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều b Cách bao gói dụng cụ: Với dụng cụ sau làm nút cần bao gói phần có nút giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: - Cắt đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói - Quấn quanh phần đầu có nút - Cột lại thật chặt Yêu cầu: - Phần giấy bao bên phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn Có thể dùng hộp nhôm để đựng dụng cụ để khử trùng 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ - Khi khử trùng nhiệt: tế bào sinh dưỡng VSV bị tiêu diệt dễ dàng bào tử tồn nhiệt độ Khả chịu nhiệt vi sinh vật phụ thuộc vào: - Tính chất môi trường, Số lượng tế bào, Độ pH vật cần khử trùng - Do để khử trùng nhiệt hiệu cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp khoảng thời gian ngắn cần thiết để tiêu diệt toàn VSV bào tử chúng có dụng cụ cần khử trùng - Có thể khử trùng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt a Phương pháp nhiệt khô  Khử trùng tủ sấy: Được thực tủ sấy - Điều chỉnh thời gian nhiệt độ thích hợp (160 °C 2h 180°C 30 phút) Lưu ý: phải để nguội tới 60°C mở tủ lấy dụng cụ Tránh mở tủ lấy dụng cụ nhiệt độ tủ cao làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ Các dụng cụ sau sấy mà giấy bao có màu vàng đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát trùng) sử dụng dụng để nuôi cấy VSVđược  Khử trùng cách đốt que lửa nóng đỏ: Phương pháp dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau lấy nút Cách khử trùng: - Hơ dụng cụ lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến – lần Với dây mayxo đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy - Đợi dụng cụ nguội sử dụng để tránh vỡ vi khuẩn không bị tiêu diệt lấy giống b Khử trùng sức nóng ướt  Đun sôi nước Phương pháp sử dụng cần khử trùng nhanh dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc Cách tiến hành: - Dùng nước đổ ngập dụng cụ - Đun sôi từ 10 phút đến 1h  Đun cách thủy nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur) Phương pháp dùng để khử trùng nhanh thực phẩm dễ biến tính nhiệt độ cao, có tác dụng ức chế VSV bào tử Cách tiến hành: Đun nóng môi trường lên 65 – 70°C 15 – 30 phút  Hấp cách quãng 100°C (phương pháp Tyndal) Phương pháp dùng để khử trùng số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm Cách khử trùng: - Hấp trường 100°C từ 30 – 40 phút - Lấy để tủ ấm 24 bào tử vi khuẩn phát triển - Hấp môi trường lần thứ hai 100°C 30 – 40 phút tiêu diệt bào tử vừa nẩy mầm - Lặp lại trình – lần Kết quả: môi trường vừa khử trùng vừa đảm bảo không thay đổi chất lượng  Khử trùng nước bão hòa áp suất cao (Autoclave) Phương pháp thực nồi hấp vô trùng áp suất cao Đó thiết bị làm kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả tự động điều chỉnh nhiệt độ thời gian Nguyên tắc hoạt động: Làm tăng nhiệt để khử trùng vật nước áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van chặt chẽ Mối quan hệ áp suất nhiệt độ nồi biểu qua bảng sau: Phương pháp khử trùng nước bão hòa áp suất cao phương pháp phổ biến hiệu phương pháp khử trùng nhờ khả tiêu diệt tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật c Khử trùng lọc Sử dụng cho môi trường lỏng, trong, có độ nhầy yếu, không chịu nhiệt độ cao 600C Cho môi trường qua màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ đường kính vi khuẩn Khi đó, vi khuẩn bị giữ lại màng lọc dung dịch qua vô trùng Màng lọc thường màng cellulose d Diệt trùng xạ - Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng tia UV Dòng tia UV diệt trùng không khí phòng bệnh viện, phòng vô trùng Tia UV khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên mẫu vật - Tia âm cực: Diệt trùng dụng cụ giải phẩu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực tiêu diệt vật cho vào bao gói kín BÀI LÀM MÔI TRƯỜNG ĐỂ GIEO CẤY VI SINH VẬT Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường Dựa vào nguồn gốc, trạng thái lý học, mục đích sử dụng mà người ta có nhiều cách phân loại môi trường: Phân loại theo thành phần nguồn gốc: - Môi trường tự nhiên: dùng sản phẩm tự nhiên để pha chế (sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men…) thành phần hóa học sản phẩm không xác định chi tiết xác - Môi trường bán tổng hợp: Ngoài sản phẩm tự nhiên thêm số hóa chất có thành phần định - Môi trường tổng hợp: dùng hoàn toàn hóa chất có thành phần xác định để pha chế Phân loại theo trạng thái lý học: - Môi trường lỏng: dung dịch chất dinh dưỡng hòa tan nước - Môi trường đặc: môi trường lỏng có agar (1,5 – 2,5%) gelatin (10-20%) - Môi trường bán lỏng: 0,3 – 0,7% aga Phân loại theo mục đích sử dụng: - Môi trường bản: thành phần môi trường đặc biệt, thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác - Môi trường riêng biệt: Chỉ thích hợp cho số loài vi sinh vật định - Môi trường phân lập chẩn đoán: thích hợp cho loài vi sinh vật định để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa di truyền vi sinh vật & 1.1 LÀM MÔI TRƯỜNG  Nguyên tắc: Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hóa chất dinh dưỡng loài vi sinh vật Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ chất thành phần môi trường dinh dưỡng Đảm bảo điều kiện hóa, lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật  Chuẩn bị dụng cụ, nguyên vật liệu hóa chất Dụng cụ: - Cốc đong: 250ml, ống đong 250ml - Bình tam giác 250 làm nút - Micropipette 100-1000ml , đầu típ tương ứng  Tiến hành Pha chế Tùy theo mục đích phân lập, tiến hành cân đầy đủ thành phần môi trường ghi rõ bảng bảng vào cốc tích ứng với thể tích cần pha Quá trình cân cần lưu ý: - Phải chuẩn bị dụng cụ, hóa chất tập trung vị trí thao tác - Nếu môi trường đặc bổ sung aga sau chỉnh pH Sau cân đầy đủ thành phần môi trường, bổ sung nước cất khoảng 4/5 thể tích môi trường Tiến hành điều chỉnh pH (bước 3) Điều chỉnh pH Mỗi loài vi sinh vật phát triển khoản pH định Khi làm môi trường cần xác định pH điều chỉnh cho thích hợp + Muốn điều chỉnh độ pH môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaCl 10 % Ngoài dùng số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 + Muốn kiểm tra độ pH môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH - metre) Phương pháp nhanh nhạy cho độ xác cao Phân phối vào dụng cụ chứa -Tiến hành đổ dịch môi trường vào cốc đong, bổ sung nước cất định mức lên thể tích môi trường cần pha - Phân phối dịch môi trường vào bình tam giác, cân bổ sung 1,5 – 2% aga Lưu ý phân phối môi trường : - Tránh không cho dính môi trường lên miệng bình tam giác hay miêng ống nghiệm vị trí làm nút Có thể dùng phểu (Với việc chuẩn bị môi trường đặc phân phối vào ống nghiệm bổ sung aga vào cốc chứa dịch môi trường, phải đun chảy làm tan aga, phân phối lâu phải dùng phểu lọc nóng để giữ môi trường trạng thái lỏng) - Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ đậy nút lại (xoay sâu vào gần hết nút) + Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng lượng môi trường cần phân phối chiếm 1/4 thể tích ống nghiệm Nếu làm thạch đứng lượng môi trường cần phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm + Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích bình + Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ nút việc phân phối cần thực xong trước môi trường bị đông đặc Tiệt khuẩn môi trường Chế độ tiệt khuẩn môi trường cho loại môi trường có ghi sẵn với cách pha chế Tùy loại môi trường, tùy điều kiện cụ thể mà tiệt khuẩn theo phương pháp sau: - Phương pháp Pasto - Phương pháp Tindal - Phương pháp hấp nước bão hòa có áp suất nhở nồi hấp (autoclave) - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ khác a Cách làm nút - Với ống nghiệm: Lấy không thấm nước cuộn lại, ấn vào cuộn Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm Yêu cầu:Nút có kích thước độ chặt vừa phải Lấy vào dễ dàng Đầu nút tròn, gọn, phần lớn phần - Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều b Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút cần bao gói phần có nút giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: - Cắt đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói - Quấn quanh phần đầu có nút - Cột lại thật chặt Yêu cầu: - Phần giấy bao bên phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn Có thể dùng hộp nhôm để đựng dụng cụ để khử trùng BÀI PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT Trong thiên nhiên vật phẩm dùng để nghiên cứu thường chứa hỗn hợp nhiều loài vi sinh vật khác nhau, ta nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng, trao đổi chất, di truyền học đặc tính khác ta có vi sinh vật khiết Vi sinh vật khiết giống vi vật phát triển từ tế bào ban đầu riêng biệt Giống vi sinh vật khiết thường nhận từ canh trường vi sinh vật tập trung, canh trường thường có nhờ việc tạo điều kiện chọn lọc Vì muốn có giống khiết ta phải tiến hành làm hai bước: - Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung - Sau phân lập vi sinh vật khiết – Canh trường tập trung Canh trường tập trung canh trường số loài (hoặc có vài loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hẳn loài khác số lượng Phương pháp chủ yếu để nhận canh trường vi sinh vật tập trung dùng môi trường chọn lọc hay điều kiện chọn lọc Để có môi trường chọn lọc ta thay đổi thành phần môi trường, pH môi trường vài loại nguồn dinh dưỡng nguồn cacbon nguồn nitơ – Canh trường khiết Canh trường khiết canh trường mà tất vi sinh vật sinh từ tế bào ban đầu Việc phân lập canh trường khiết bước vô quan trọng trình nghiên cứu vi sinh vật & 2.1 PHÂN LẬP  Nguyên tắc - Tách rời tế bào vi sinh vật - Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết: gồm bước: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết vi sinh vật  Hóa chất - Mẫu thí nghiệm chứa vi sinh vật - Canh trường tập trung vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Canh trường khiết - Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, Que trang Đĩa petri, bình tam giác, ống falcon 15ml, Đèn cồn  Thực Phân phối môi trường vào đĩa petri - Đun chảy lỏng thạch, để nguội đến 50 -60 °C - Mở giấy bọc hộp, đặt lên bàn phẳng Tay phải cầm bình ống môi trường chảy lỏng, giữ nghiên, dùng tay trái xoay rút nút ra, vô khuẩn miệng bình (miệng ống nghiệm) đèn cồn Dùng tay trái mở nắp hộp vừa phải nhanh tay rót vào hộp lượng môi trường thích hợp - Nhanh chóng đậy nắp hộp lại xoay tròn hộp từ từ bàn, để thạch dàn thành lớp đáy hộp Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên Hé mở nắp hộp để yên lúc thạch đặc lại hoàn toàn Đậy nắp hộp, lật ngược hộp cho đáy lên - Cần ý thạch cho vào hộp đĩa Petri không làm vô khuẩn lại nữa, nên đổ phải làm nhanh, cẩn thận, đảm bảo không bị nhiễm khuẩn từ bên - Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, phẳng, lớp thạch không dày mỏng (thường – mm) Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Chuẩn bị ống fancol chứa 9ml nước muối vô trùng 0,85% (đã vô trùng) Cân xác 1g mẫu đất cho vào ống fancol chứa sẵn ml dung dịch nước muối, vortex khoảng phút, để lắng – 10 phút, nồng độ mẫu 10-1, tiếp tục hút 1ml dịch pha loãng ống thứ cho vào ống thứ vortex để lắng ta nồng độ 10-2 , tiến hành lặp lại ta có nồng độ khác 10-4, 10-5, 10-6 Nuôi cấy mẫu  Hút 100 μl dịch pha loãng nồng độ 10-5, 10-6, phân phối vào đĩa Petri, nồng độ cấy lên đĩa Dùng que trang, trải dịch mẫu lên bề mặt môi trường nuôi cấy, đến thấy mặt thạch khô dừng lại.Ghi rõ nội dung sau lên đĩa petri trước gieo cấy: Tên môi trường, ngày gieo cấy, mức độ pha loãng, tên nhóm nghiên cứu  Đặt hộp đĩa petri gieo cấy vi sinh vật vào tủ ấm ủ nhiệt độ 30°C, 24h Quan sát khuẩn lạc (KL), mô tả đặc điểm khuẩn lạc mọc đĩa thạch + Hình dạng: tròn, bầu dục hay hình dạng xác định + Kích thước: to, nhỏ cách đo đường kính khuẩn lạc + Bề mặt KL: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo, xếp loại S, R hay M Dạng S(smooth): KL xám nhạt trong, bờ đều, mặt lồi đều, bóng lõm Dạng R(rough): KL thường dẹt có bề mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô Dạng M ((Mucous) KL đục, tròn, lồi khuẩn lạc S, quánh dính + Mép khuẩn lạc phẳng hay lỗi lõm, cưa + Độ KL: mền, cứng hay dai, có khả bám vào môi trường hay không Màu sắc khuẩn lạc môi trường Làm Sử dụng que ria, nhặt khuẩn lạc riêng rẽ từ canh trường tập trung cấy ria sang canh trường khiết chuẩn bị cho vi sinh vật Đặt hộp đĩa gieo cấy vào tử ấm 30 °C nuôi Vi khuẩn 24h; Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn 42 – 72 h Quan sát đặc điểm khuẩn lạc môi trường & 2.2 PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT  Nguyên tắc Mọi thao tác gieo cấy phải thực điều kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn Môi trường dụng cụ cấy phải khử trùng  Các phương pháp cấy a Phương pháp cấy chuyền vào ống nghiệm - Cấy ống thạch đứng: thường nuôi cấy bảo quản VSV yếm khí ( dùng que cấy thẳng) Sau lấy sinh khối, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch Đâm sát đáy ống nghiệm đâm thành đường: đường đường sát thành ống Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường - Cấy ống thạch nghiêng: bảo quản VSV hiếu khí tùy tiện ( dùng que cấy nhọn que cấy vòng) Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu: hình chữ chi, vòng xoắn, vạch ngang song song b Cấy hộp đĩa petri Sử dụng que cấy tròn cấy theo hình dạng sau: - Theo hình chữ chi toàn mặt thạch - Theo đường song song - Theo hình chữ chi góc Sử dụng que trang: BÀI 3: SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Việc nghiên cứu hình thái tế bào vi sinh vật mà kích thước chúng đo micromet ( 1μm = 10-3mm), thục nhờ kính hiển vi có độ phóng đại đối tương nghiên cứu lên hàng trăm lần (kính hiển vi quang học) lên hàng vạn lần (kính hiển vi điện tử) Để nghiên cứu hình thái, cấu tạo trạng thái sống chết tế bào vi sinh vật, người ta thường dùng phương pháp làm tiêu vi sinh vật để quan sát kính hiển vi Có thể làm loại tiêu bản: - Tiêu tạm thời - Tiêu cố định & 3.1 KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Cấu tạo kính hiển vi quang học: gồm có hệ thống Hệ thống giá đỡ gồm: Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu Hệ thống phóng đại gồm: - Thị kính: phận kính hiển vi mà người ta để mắt để soi kính, có loại ống đôi ống đơn (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, dùng để tạo ảnh thật vật cần quan sát) - Vật kính: phận kính hiển vi quay phía có vật mà người ta muốn quan sát, có độ phóng đại vật kính: x10, x40, x100 (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trò kính lúp để quan sát ảnh thật) Hệ thống chiếu sáng gồm: - Nguồn sáng (gương đèn) - Màn chắn, đặt vào tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng qua tụ quang - Tụ quang, dùng để tập trung tia ánh sáng hướng luồng ánh sáng vào tiêu cần quan sát Vị trí tụ quang nằm gương bàn để tiêu Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng Hệ thống điều chỉnh: - Ốc vĩ cấp - Ốc vi cấp - Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống - Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng tụ quang - Núm điều chỉnh chắn - Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu (trước, sau, trái, phải) Cách sử dụng kính hiển vi quang học - Đặt tiêu lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ giọt dầu soi để soi chìm phiến kính soi vật kính x100 - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp - Điều chỉnh ánh sáng - Điều chỉnh tụ quang: vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang đoạn giữa, vật kính x100 - Điều chỉnh cỡ chắn tương ứng với vật kính - Hạ vật kính sát vào tiêu (mắt nhìn tiêu bản) - Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên nhìn thấy hình ảnh mờ vi trường - Điều chỉnh ốc vi cấp để hình ảnh rõ nét Cách bảo quản KHV - Đặt kính hiển vi chỗ, xa nóng chỗ ẩm ướt - Cầm kính hiển vi thân kính, tay đỡ chân kính Phải để đứng kính hiển vi, không để kính nghiêng - Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay dung dịch lên bàn kính - Không để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi - Lau thị kính vật kính giấy lau kính trước sau dùng Khi soi với vật kính dầu, thấm giấy lau kính với giọt xylen để lau vật kính Sau lau với xylen, phải lau khô giấy lau kính, không xylen làm bong thấu kính gắn vật kính - Trước cất kính hiển vi, để vật kính nhỏ vị trí quan sát hạ thấp ống kính ốc lớn Vặn nhẹ nhàng, đừng ấn mạnh ống kính Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ quang kính xuống Nếu tụ quang kính bẩn, lau giấy lau kính khô - Để gương nghiêng, mặt phẳng phía để tránh bụi - Che kính hiển vi bao kính Cất kính vào chỗ kính, để lui vào phía trong, đừng để mấp mé phía & 3.2 TIÊU BẢN VI SINH VẬT Vi sinh vật đem làm tiêu để quan sát kính hiển vi có hai dạng sống chết Cả hai dạng nhuộm màu không nhuộm màu Để quan sát khả chuyển động, tạo thành bào tử, sinh sản vi sinh vật người ta thường làm tiêu vi snh vật sống, làm tiêu vi sinh vật sống theo cách: - Tiêu giọt ép: Dùng để xác định hình thái tế bào vi sinh vật, xác định kính thước xếp chúng, phương thức sinh bào tử, khả di động Làm tiêu giọt ép - Tiêu giọt treo : Dùng để quan sát sinh sản vi snh vật, hình thành nảy mần bào tử, phát khả di động phản ứng tế bào vi sinh vật với loại kích thích Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn Phương pháp làm tiêu tạm thời có nhuộm màu  Nguyên tắc : Phương pháp sử dụng thuốc nhuộm không độc với vi sinh vật, pha loãng nồng độ 0,01 – 0,001% đảm bảo cho tế bào vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm màu  Dụng cụ hóa chất: - Phiến kính kính vô trùng - Que cấy, Đèn cồn, giấy thấm - Nước muối sinh lý 0,85% - Dung dịch màu xanh metylen 0,001% cồn  Tiến hành :  Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính  Dùng que cấy pipet lấy cach trường vi sinh vật đặt lên phiến kính Với canh trường đặc cho trước lên phiến kính vài giọt nước muối sinh lí (0,5 – 0,85%) sau hòa canh trường vi sinh vật vào Lưu ý: lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều ( nhiều bị trào ngoài) ( tiêu khô hay tạo thành bọt khí gây khó khăn cho việc quan sát)  Ép kính lên giọt canh trường: trước tiên để kính nghiên 60° cạnh phiến kính tiếp xúc với mép giọt canh trường cho canh trường chảy cạnh bề mặt tiếp xúc kính phiến kính  Quan sát tiêu vật kính (x 10) (x 40)  Đặt tiêu lên khay kính quan sát BÀI QUAN SÁT HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào đa số chúng có kích thước 0,2- 2,0µm Hình dáng tế bào hình que, hình cầu, hình phẩy, hình xoắn, tồn đơn lẻ hay kết đôi, kết chuổi, kết chùm Quan sát vi khuẩn nói chung cần quan sát đặc điểm mang tính đặc trưng như: hình dáng, kiểu liên kết, khả di động, hình thành bào tử, bắt màu thuốc nhuộm 4.1 Quan sát hình thái vi khuẩn Vật liệu thuốc thử: Dịch chứa vi khuẩn bacillus subtilic Phiến kính, kính Thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% Làm tiêu giọt ép có nhuộm màu để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Về hình dạng vi khuẩn chia thành nhóm: - Cầu khuẩn: có hình tròn, hình cầu tùy theo kiểu phân cắt mà người ta gọi song cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn - Trực khuẩn: có hình que , chiều dài lớn chiều rộng nhiều - Xoắn khuẩn: vi khuẩn có tế bào hình xoắn: nhiều vòng Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn Phân biệt vi khuẩn Gram (Phương pháp nhuộm Gram) Nguyên tắc : Dựa khả bắt màu tếbào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác + Loại phức chất thứ giữnguyên màu thuốc nhuộm nên không bịrửa trôi xửlý cồn Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram dương + Loại phức chất thứhai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xửlý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổsung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram âm Vật liệu thuốc thử Vi khuẩn bacillus subtilic; vi khuẩn E.coli (được nuôi cấy qua đêm) Thuốc nhuộm: tím kết tinh (crystal violet); safarin; iodine Nước cất; cồn 95% Cách tiến hành : - Làm tiêu :  Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi phiến kính (hai đầu phiến kính)  Dùng que cấy lấy chút khuẩn lạc chúng làm vết bôi theo thứtựsau: Bên trái phiến kính Bacillus subtilis Bên phải phiến kính Escherichia coli Ở phiến kính Bac.subtilis trộn lẫn với E coli  Để khô vết bôi không khí cố định nhẹ đèn cồn - Nhuộm tiêu  Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi  Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút  Nhuộm lugol phút  Rửa nước  Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu nhỏtừ từ giọt cồn tan hết màu  Rửa nước  Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ10 - 30 giây  Làm khô soi tiêu với vật kính dầu - Kết quả:  Vết bôi Bac sublitis màu tím - gram dương  Vết bôi Bac sublitis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím  Vết bôi E.Coli màu hồng - gram âm 4.3 Quan sát tế bào nấm men Để quan sát tế bào nấm men sống chết, ta dùng phương pháp nhuộm đơn giản Làm tiêu giọt ép Tế bào nấm men có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào có kích thước lớn, có khả nẩy chồi Quan sát dạng - Tế bào riêng lẻ - Tế bào giai đoạn nảy chồi 4.4 Quan sát nấm mốc Các phương pháp khảo sát vi nấm tương tự phương pháp khảo sát Vi khuẩn kí sinh trùng đòi hỏi nghiêm khắc Sinh viên cần phải thận trọng học môn vi nấm, nấm sinh bào tử, bào tử phát tán không khí, ta dễ hít phải bào tử nấm bào tử nấm bám vào da Vì vậy, theo phương pháp vô trùng để + Tự bảo vệ bảo vệ người làm việc + Giữ canh cấy nguyên vẹn, không bị bội nhiễm tác nhân khác – Bệnh phẩm để xét nghiệm tìm vi nấm: có nhiều loại bệnh phẩm: lỏng, đặc, rắn,… vậy, có nhiều cách lấy bệnh phẩm Cần phải lấy phương pháp để bảo đảm kết xét nghiệm xác – Phương pháp phát vi nấm gồm có nhiều kỹ thuật khác nhau: + Khảo sát trực tiếp: mắt thường kính hiển vi + Nhuộm: tiêu phết nấm sinh thiết mô (lát cắt) + Cấy nấm + Xét nghiệm sinh hóa + Phương pháp miễn dịch sinh học phân tử + Tiêm vào thú nuôi phòng thí nghiệm – Khảo sát trực tiếp dùng kính hiển vi xác định chẩn đoán thấy nấm bệnh phẩm, không thấy nấm loại trừ nhiễm nấm Vật liệu Nấm Aspergillus, nấm Trichoderma môi trường PDA Tiến hành: Lưu ý: Luôn giữu đĩa petri có nấm mốc trạng thái đậy nắp, không môi trường xung quanh nhiễm bào tử nấm mốc Tuyệt đối không ngửi nấm mốc, bào tử gây bệnh Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát: - Đặc điểm sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay vách ngăn - Đặc điểm quan sinh sản: hình dạng, cách xếp phận quan sinh sản - Hình dạng, cấu tạo, cách xếp bào tử Cách quan sát: - Làm tiêu nấm mốc không nhuộm màu - Vẽ hình nhận xét hình dạng chung sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách xếp bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính giống nấm mốc 4.5 Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn (Actinomycetes) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình dạng bào tử - Đặc điểm cuống sinh bào tử - Phương thức hình thành chuỗi bào tử Cách quan sát : Làm tiêu giọt ép với xạ khuẩn cấy thạch nghiêng Bài 5: ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ Định lượng vi sinh vật xác định số lượng vi sinh vật tổng số hay số lượng vi sinh vật riêng biệt đơn vị vật phẩm đem nghiên cứu (trên gam, ml dung dịch ) Việc xác định quan trọng, cho ta khái niệm so sánh hay khái niệm thực chất khu hệ vi sinh vật sinh khối vi sinh vật riêng biệt nuôi cấy Ta có hai phương pháp định lượng: - Định lượng trực tiếp - Định lượng gián tiếp(đếm khuẩn lạc) I Phương pháp đếm khuẩn lạc 3.1 Nguyên tắc: Là phương pháp định lượng vi sinh vật cách gieo cấy lượng vi sinh vật định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường đặc hộp đĩa petri sau đếm số khuẩn lạc mọc Phương pháp định lượng này, tính tế bào vi sinh vật sống nên kết xác hơn, tốn thời gian, công sức 3.2 Dụng cụ hóa chất - Pipet, micropipet 100-1000ml, đầu típ 1ml, Ống Fancol 15 ml, Đĩa petri - Máy vortex, Tủ ấm - Chuẩn bị Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :20g Nước cất vừa đủ :1000ml pH sau trùng : 7.0 ± 0.2, Hấp trùng 121 °C/15 phút 3.3 Tiến hành: Đồng mẫu pha loãng Cân gam mẫu rắn hút 1ml mẫu nước vào ống falcon chứa 9ml nước muối 0.85% vô trùng, đồng mẫu máy vortex phút, thu nồng độ 10-1 Chuẩn bị ống nghiệm pipet vô trùng Dùng pipet hút 9ml nước muối vô trùng vào ống nghiệm Sử dụng micropipet hút 1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc máy vortex ta độ pha loãng 10-2 Tiến hành tương tự ta nồng độ Lưu ý pha loãng: - Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào vệ sinh mẫu, kinh nghiệm người thực - Thao tác bên lửa đèn cồn, dụng cụ pipet, ống nghiệm phải vô trùng Khi pha loãng sử dụng micropipet phải đổi đầu típ cho lần hút 1ml từ nồng độ pha loãng đầu đến nồng độ để tránh sai số - Mỗi lần lấy mẫu phải lắc Đổ hộp cấy mẫu Có cách cấy mẫu: Cách 1:  Trộn dịch cấy vào thạch cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch nhiệt độ 45 - 50°C  Đậy nút lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối môi trường  Đổ thạch vào đĩa petri khử trùng  Xoay tròn đĩa để thạch phân bố mặt đĩa  Để yên cho môi trường đông đặc ủ nhiệt độ thích hợp Cách 2:  Hút 0,1 ml dịch cần nghiên cứu cho vào đĩa petri có môi trường đặc  Dùng que trang trải khắp mặt đĩa  Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Dùng bút lông ghi lên đĩa ( tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng ) - Lật ngược đĩa đặt vào tủ ấm 30 °C 48 -72 h ( 48h mang đếm sơ bộ, 72 đếm thức) Tính kết Đếm số khuẩn lạc/ đĩa/các nồng độ Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính toán Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí: A: tổng số tế bào /1ml (1g) mẫu (cfu/g(ml)) N: tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa ni : số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: Thể tích mẫu cấy vào đĩa fi : độ pha loãng tương ứng Làm tròn kết có được, giữ lại số có nghĩa biểu thị kết dạng thập phân 1.0 9.0 nhân với 10n (n số mũ) Trường hợp khuẩn lạc mọc loang, vết loang tính khuẩn lạc Nếu số khuẩn lạc loang chiếm 1/3 đĩa ghi nhận đánh dấu kết nhận II Sử dụng buồng đếm (định lượng trực tiếp) Cấu tạo buồng đếm: Cách tra mẫu vào buồng đếm Cách đếm: Tiến hành - Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, tra 15 - 20 l dịch vào bề mặt buồng đếm kề với cạnh kính - Dịch huyền phù tế bào điền đầy ô theo chế mao dẫn Buồng đếm chuẩn bị có vùng không gian nằm kính buồng đếm điền đầy dịch huyền phù tế bào, rãnh xung quanh không bị dính ướt - Di chuyển nhẹ khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy khoang Khi dịch nằm có bề dày 0.1mm - Bắt đầu đếm tế bào sau nhỏ giọt dịch từ – phút Đếm số tế bào ô vuông lớn (corner square) ô trung tâm (middle square), ghi nhận tính số tế bào 1ml (1 gam) theo công thức sau: N= [a/b x 400/0.1] x 103 x 10n N: số tế bào 1ml (1 gam) mẫu nghiên cứu a: số tế bào ô lớn (80 ô vuông nhỏ) b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn (80) 400: tổng số ô vuông nhỏ ô trung tâm 103 số chuyển đổi mm3 thành ml(1000 mm3 = ml) 10n: độ pha loãng mẫu ... có vi sinh vật khiết Vi sinh vật khiết giống vi vật phát triển từ tế bào ban đầu riêng biệt Giống vi sinh vật khiết thường nhận từ canh trường vi sinh vật tập trung, canh trường thường có nhờ vi c... vi sinh vật dạng khiết: gồm bước: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết vi sinh vật  Hóa chất - Mẫu thí nghiệm chứa vi. .. loại vi sinh vật khác - Môi trường riêng biệt: Chỉ thích hợp cho số loài vi sinh vật định - Môi trường phân lập chẩn đoán: thích hợp cho loài vi sinh vật định để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh