Báo cáo thí nghiệm vi sinh

Cô Phượng dạy thay cô Ái, hướng dẫn pha môi trường và các bước thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của các loại vsv Pha môi trường, làm nút bông Ngâm và sấy ống Durham Rót môi trường vào ống nghiệm Hấp tiệt trùng. Cô Phượng phổ biến lịch thi Lấy môi trường ra để nguội Cho vi sinh vật vào và đuổi khí Nhỏ sáp đèn cầy lên miệng ống nghiệm và để vào tủ ấm Kết thúc thí nghiệm, ra về Cô Phượng dạy thay cô Ái, hướng dẫn pha môi trường và các bước thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của các loại vsv Pha môi trường, làm nút bông Ngâm và sấy ống Durham Rót môi trường vào ống nghiệm Hấp tiệt trùng. Cô Phượng phổ biến lịch thi Lấy môi trường ra để nguội Cho vi sinh vật vào và đuổi khí Nhỏ sáp đèn cầy lên miệng ống nghiệm và để vào tủ ấm Kết thúc thí nghiệm, ra về Cô Phượng dạy thay cô Ái, hướng dẫn pha môi trường và các bước thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của các loại vsv Pha môi trường, làm nút bông Ngâm và sấy ống Durham Rót môi trường vào ống nghiệm Hấp tiệt trùng. Cô Phượng phổ biến lịch thi Lấy môi trường ra để nguội Cho vi sinh vật vào và đuổi khí Nhỏ sáp đèn cầy lên miệng ống nghiệm và để vào tủ ấm Kết thúc thí nghiệm, ra về

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

1.BÀI 1: QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH

HIỂN VI

1. MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

- Quan sát đặc điểm hình thái của vi sinh vật: nấm men, vi khuẩn, nấm mốc

- Làm quen và biết cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật

- Biết làm tiêu bản vi sinh vật để quan sát dưới kính hiển vi

2. LÝ THUYẾT

2.1. Giới thiệu về vi sinh vật

Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhân sơ hoặc nhân thực có kích thước rất nhỏ, không quan sát được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi Kích thước vi sinh vật thường được đo

bằng micromet Thuật ngữ vi sinh vật không tương đương với bất

kỳ đơn vị phân loại nào trong phân loại khoa học Nó bao gồm cả virus,

vi khuẩn(bao gồm cả cổ khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật

2.2. Giới thiệu về kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả

kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thủy tinh Kính hiển vi quang học là dạng kính hiển

vi đơn giản, lâu đời nhất và cũng là phổ biến nhất

Hình 1-1: Kính hiển vi quang học

– Cấu tạo của kính hiển vi quang học:

(1) Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra

ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, chophép thay đổi dễ dàng

(2) Giá điều chỉnh vật kính

(3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ

thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn,cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại Trênvật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống

(4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh

(6) Giá đặt mẫu vật

(7) Hệ thống đèn, gương tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật.

(8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật

(9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn

 Cách sử dụng kính hiển vi

– Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu

– Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt

– Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc

to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống) cho đến khi vật kính gần sát

- Ngâm phiến kính và lam kính trong petri chứa còn 70°

- Lấy phiến kính ra, lau khô bằng giấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn

- Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt nước vô khuẩn nhỏ lên phiến kính

- Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau đó lấy một phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên que cấy

- Trộn đều vi sinh vật trên que cấy vào giọt nước và dàn mỏng giọt nướctrên phiến kính

- Lấy lam kính lau khô bằng giấy và hơ nhẹ lướt qua ngọn lửa đèn cồn, sau đó đậy lên phiến kính để cố định vi sinh vật quan sát

- Dùng giấy thấm xung quanh, đảm bảo xung quanh lam kính khô

- Quan sát hình thái nấm men, vi khuẩn, nấm mốc dưới kính hiển vi

4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

- Quan sát được đặc điểm của nấm mốc Penicillium: chuỗi đính bào

tử, phân nhánh, có vách ngăn

- Thời gian điều chỉnh kính hiển vi để quan sát rõ nét còn lâu

5. ỨNG DỤNG

– Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật

– Nhận định sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần khảo sát: có hay không

– Quan sát, nhận biết được sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật

6. NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM

Ngày 04/09/2018

12h45 Cô Phượng hướng dẫn nội quy phòng thí nghiệm

13h Cô Ái hướng dẫn cấu tạo kính hiển vi và cách lấy mẫu quan

2.BÀI 2: QUAN SÁT NẤM MEN

1. MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

- Đánh giá canh trường nấm men, tỷ lệ nảy chồi vàtỷ lệ sống chết

- Quan sát số lượng và chất lượng nấm men

2. LÝ THUYẾT

2.1. Khái quát về nấm men

Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong công nghiệp, hầu hết nấm men là đơn bào, không chuyển động Hình dạng và kích thước của chúng thay đổi tùy điều kiện môi trường Nói chung nấm men

có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục,…có kích thước tương đối lớn, chiều dài từ 6 – 10μm có khi 12 - 18μm, có chiều ngang từ 4 - 8 μm

Về cấu tạo tế bào, gồm thành tế bào và tế bào chất Trong tế bào chất

có nhiều cơ quan con khác nhau, không bào và các chất chứa đựng khác như: glycogen, granuloza, chất béo, volutin,…

Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi, phân chia hoặc tạo thành bào tử hữu tính

Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau:

- Ở nấm men trẻ (qua 12 – 16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao

- Ở nấm men trưởng thành ( 24 – 48 giờ): kích thước điển hình, không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao

- Ở nấm men già (đã nuôi cấy từ 72 giờ trở lên): màng dày nhẵn, tế bào chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn

 Nguyên tắc quan sát nấm men sống và chết:

 Quan sát lượng nấm men nảy chồi:

- Đây là một việc làm quan trọng khi đánh giá chất lượng canh trường nấm men để cho vào thùng lên men

- Trong canh trường nấm men cho vào thùng lên men, lượng tế bào đang nảy chồi ít nhất phải chiếm từ 10-15%

- Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh sản mạnh, số tế bào nảy chồi

có thể đạt đến 70-80%

2.2. Phương pháp đếm số tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm:

Phạm vi áp dụng: đếm một số loài nấm men và vi khuẩn

Mục đích: theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các quá trình lênmen thực hiện trên môi trường lỏng

Cấu tạo buồng đếm:

- Buồng đếm là một phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật

- Trên bề mặt buồng đếm, có đục 4 rãnh song song với chiều rộng và chia bề mặt thành 3 khoang chính A, B và C Chiều cao của hai

khoang A, C là như nhau Khoang giữa B thấp hơn hai khoang bên A

và C một đoạn h Giá trị h được gọi là chiều cao của buồng đếm

- Khoang B được chia tiếp thành 2 khoang nhỏ B1 và B2 nhờ một rãnh đục song song với chiều dài của bề mặt buồng đếm

- Trên mỗi khoang nhỏ, người ta kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình vuông hoặc hình chữ nhật Một ô lớn được chia tiếp thành các ô nhỏ hơn

- Buồng điếm có kèm theo lá kính để đậy Lá kính có bề mặt hình vuông

- Muốn tính tỷ lệ tế bào sống chết, ta đếm số tế bào chết và tổng số tếbào chung (sống và chết) trên 5 kính trường rồi suy ra phần trăm tế bào sống chết Nếu nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng, lượng tế bào chết không quá 2-4%

3.2. Quan sát lượng nấm men nảy chồi:

- Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kính trộn đều, đậy lá kính lại, đặt lên kính hiển vi quan sát Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy chồi rồi suy raphần trăm

- Tế bào được xem là đang nảy chồi, tức là những tế bào có tế bào con

bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹthì phải tính hai tế bào

3.3. Quan sát tỷ lệ sống chết:

Trong bài thí nghiệm này, ta dùng xanh metylen để nhuộm màu, phân biệt tế bào sống và tế bào chết

Cơ sở của việc nhuộm màu nấm men.

- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn tế bào sống

- Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu

- Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2

- Làm tiêu bản

- Nhuộm màu trước khi ép lamen mỏng lên lam kính

- Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men.

- Đem tiêu bản đi quan sát dưới kính hiển vi tại 5 điểm khác nhau 3.4. Đánh giá nhiễm vi sinh vật của canh trường:

- Trong khi thực hiện thí nghiệm 1 và 2, quan sát xem canh trường có

bị nhiễm VSV lạ hay không

3.5. Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường (dùng buồng

đếm Thomas):

Cách tiến hành:

- Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 70o

- Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2

- Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên buồng đếm, dùng giấy thấm, sau đó tiến hành quan sát bằng kính hiển vi, đếm tổng số tế bào trong 10 ô vuông lớn của buồng đếm.Cấu tạo buồng đếm Thomas:

- Buồng đếm là một phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật Trên bề mặt buồng đếm, có đục bốn rãnh song song với chiều rộng và chia bề mặt thành 3 khoang chính A, B và C Chiều cao của 2 khoang A và C

là như nhau Khoang giữa B thấp hơn 2 khoang A và C một đoạn h Giá trị h được coi là chiều cao buồng đếm Khoang B được chia tiếp thành 2 khoảng nhỏ B1 và B2 nhờ một rảnh đục song song với chiều dài của bề mặt buồng đếm Trên mỗi khoang nhỏ, người ta có kẽ một lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình vuông hoặc hình chữ nhật Một số ô lớnđược chia tiếp thành các ô nhỏ hơn Buồng đếm có kèm theo lá kính

để đậy Lá kính có bề mặt hình vuông và rất phẳng Chiều cao của

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

3.6. Quan sát tỉ lệ nảy chồi

Bảng 2-1: Tỉ lệ nảy chồi của nấm men

Hình 2-4: Sự sinh trưởng nấm men dưới kính hiển vi.

*Nhận xét: Tỉ lệ nảy chồi trung bình của nấm men này là 18,6% Như vậy, loại nấm men này đang trong giai đoạn sinh trưởng

3.7. Quan sát tỉ lệ sống chết của nấm men

% tếbàochết

Hình 2-5: Nhuộm xanh nấm men bằng metylen

3.8. Đánh giá canh trường:

Tỷ lệ nảy chồi nằm trong khoảng cho phép (18,6%), chứng tỏ nấm men đang trong giai đoạn sinh trưởng, tuy nhiên không thích hợp để lên men vì

tỷ lệ nảy chồi thích hợp cho quá trình lên men là 70-80%

Khả năng tìm thấy tế bào chết trong mẫu rất thấp, chỉ khoảng 15,6% Sau khi nhuộm thì tế bào bị nhuộm xanh toàn bộ còn tế bào sống chỉ viền xanhngoài

3.9. Đếm tế bào nấm men trong 1mL canh trường:

Công thức:

Trong đó: A- số tế bào trung bình của buồng đếm

h- chiều cao buồng đếm (mm), có giá trị 0.1 mm

S- diện tích một ô đếm mm2), có giá trị (1/250) mm2

F- hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm

Hình 2-6: Nấm men trên buồng đếm Thomas

- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

- Chỉ thích hợp với tế bào có kích thược lớn (nấm men, nấm mốc)

- Khó đạt độ chính xác cao

- Không thích hợp trong huyền phù hay mật độ thấp

4. ỨNG DỤNG CỦA NẤM MEN:

- Nấm men bánh mì: Saccharomyces cerevisiae được sử dụng nhằm tạo ra CO2 làm nở cấu trúc khối bột đồng thời tạo ra các cấu tử tạo hương trong quá trình trao đổi chất của nó

Hình 2-7: Ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì Ứng dụng trong sản xuất đồ uống có cồn:

- Saccharomyces cerevisiae kết hợp với vi khuẩn butyric tạo ra hương thơm mạnh và đặc trưng trong sản xuất rượu Rum

- Saccharomyces carlbergeois lên men bia – kiểu lên men chìm thường

để sản xuất bia có độ cồn thấp và bia vàng Sử dụng nấm men chìm

để sản xuất bia sẽ tốn thời gian hơn nhưng bia thu được trong hơn đống thời nấm men dễ lọc và dễ thu hồi để sử dụng hơn

- Lên men rượu vang: saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme

invectara có khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy, trong quá trình lên men, ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với những nòi của men này chỉ đạt khoảng 8- 10 % thể tích

Rượu vang Ứng dụng trong nước mắm, nước chấm, nước tương, tương ớt

- Chiết xuất nấm men khi sản xuất nước mắm nước chấm sẽ tăng thêm vị Umami mà không cần sử dụng thêm MSG và I+G, bổ sung thêm đạm (1% chiết xuất nấm men tăng thêm 1 độ đạm), khử vị chát của muối, khử mùi khó chịu của cá, làm tròn vị của nước mắm nước tương

14h25 Tiến hành cho thuốc nhộm

14h30 Cả nhóm đếm số tế bào nấm men mẫu đậm đặc

15h Cả nhóm đếm số tế bào nấm men mẫu pha loãng 1/10

16h30 Kết thúc thí nghiệm và ra về

3.BÀI 3: QUAN SÁT VI KHUẨN

1. MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

- Mô tả và phân biệt được đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý của

vi khuẩn, nhận biết được từng loại vi khuẩn

- Rèn luyện kỹ năng sử dụng kính hiển vi

- Thông thạo thao tác làm tiêu bản giọt treo, giọt ép, phương pháp nhuộm gram

2. SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

2.1. Giới thiệu về vi khuẩn

Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân phức tạp, thuộc nhóm Prokaryotes Nhân tế bào chỉ gồm một chuỗi ADN không có thành phần protein không có màng nhân

Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy, hình sợi Kích thước thay đổi tuỳ theo các loại hình và trong một loại hình kích thước cũng khác nhau So với virus, kích thước của vi khuẩn lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học Dựa vào loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:

Cầu khuân là loại vi khuẩn có hình cầu Nhưng có nhiều loại không hẳn

hình cầu thí dụ như hình ngọn nến như phế cầu khuẩn - Diplococcus

pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae).

Kích thước của vi khuẩn thường thay đổi trong khoảng 0,5 (1μ = 10-3 mm).Tuỳ theo từng loài mà chúng có những dạng khác nhau

Đặc tính chung của cầu khuẩn:

- Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau

- Có nhiều loài có khả năng gây bệnh cho người và gia súc

- Không có cơ quan di động

- Không tạo thành bào tử

Trực khuẩn là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que Kích thước

của chúng thường từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 μ Thường gặp các loài trực khuẩn sau đây:

 Bacillus (viết tắt là Bac)

Trực khuẩn gram dương, sinh bào tử Chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào Vì thế khi tạo thành bào tử tế bào không thay đổi hình dạng chúng thường thuộc loài hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc

 Vi khuẩn lactic:

Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu, và dạng que, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn lactic thuộc dạng yếu Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Để sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn carbon, chúng cần nitơ một phần dưới dạng các acid amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

 Lactobacillus

Vi khuẩn gram dương, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng tạo acid lactic, có thểlên men đồng hình hoặc dị hình, catalase âm tính và có khả năng lên menglucose

2.2. Chuẩn bị tiêu bản và cố định vi khuẩn trên phiến kính:

- Quá trình cố định vi khuẩn bằng nhiệt hoặc bằng dung môi sẽ giúp ngăn chặn sự tự thủy phân của vi khuẩn, làm thay đổi hình dạng của

tế bào Mặt khác cũng giúp tế bào vi khuẩn bám chặt vào phiến kính không bị rửa trôi

- Làm tiêu bản giọt ép: là phương pháp đơn giản nhất quan sát trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn

- Làm tiêu bản giọt treo: để quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi trong thời gian lâu hơn

2.3. Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp nhuộm này sử dụng hai màu khác nhau, dùng để phân biệt

tế bào vi khuẩn Gram âm G- và vi khuẩn Gram dương G+ Vi khuẩn G+ có thành tế bào dày, bao gồm nhiều lớp peptidoglycan Vi khuẩn G- có lớp peptidoglycan mỏng và lớp lipopoly-saccharide

Trong phương pháp nhuộm Gram, tím tinh thể được sử dụng như màu thứ nhất Tím tinh thể cũng là màu bazo, làm cho tất cả các tế bào vi khuẩn trên tiêu bản bắt màu Iod là chất cẩn màu, có khả năng tạo phức chất với tím tinh thể Phức chất này không tan trong tế bào vi khuẩn , do đó làm cho tế bào bắt màu rõ hơn Ethanol được dùng trong bước tiếp theo để tẩy màu khỏi tế bào G-, trong khi tế bào G+ vẫn giữ màu Sau đó tế bào G-được nhuộm lại bằng màu thứ 2 thường là safranin Khi quan sát dưới kính hiển vi, tế bào G+ có màu tím của tím tinh thể, còn tế bào G- sẽ có màu đỏ của safranin

Một số lỗi hay gặp khi nhuộm Gram:

- Hơ nóng khi cố định vi khuẩn lên phiến kính có thể làm vỡ tế bào, từ

đó màu của tế bào G+ có thể bị rửa trôi làm cho tế bào G+ trở thành

G-

- Lớp tế bào trên phiến kính quá dày làm cho quá trình nhuộm màu không tốt hay quá trình tẩy màu bằng ethanol không tốt, từ đó tế bào G- có thể xuất hiện như tế bào G+

- Bước tẩy màu bằng ethanol là quan trọng: nếu thời gian tẩy màu quá ngắn sẽ làm cho vi khuẩn G- được thể hiện như vi khuẩn G+ Nếuthời gian quá dài thì ngược lại, tế bào G+ sẽ có màu của tế bào G-

- Tế bào già thường không bắt màu chính xác Cần phải nhuộm màu

tế bào chưa tới 24 giờ nuôi cấy

3. CÁCH TIẾN HÀNH

 Nguyên vật liệu và thuốc nhuộm:

- Cầu khuẩn: Streptococus thermophillus

- Trực khuẩn: Bacillus subtilis, E.Coli, Acetobacter xylium

- Lactic: Lacto acidophillus

- Dung dịch tím tinh thể

Đối với môi trường lỏng chứa vi khuẩn đã pha loãng

- Dùng que cấy lấy và dàn đều môi trường lỏng chứa vi khuẩn

đó lên phiến kính (Tiến hành lấy mẫu gần đèn cồn)

Đối với môi trường rắn chứa vi khuẩn chưa pha loãng

- Nhỏ một giọt nước vô khuẩn lên phiến kính

- Dùng que cấy lấy và dàn đều mẫu cùng với nước vô khuẩn trên phiến kính

- Lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho không tạo thành bọt khí giữa lam kính và phiến kính

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi

 Làm tiêu bản giọt treo

- Ngâm phiến kính lõm và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên ngọn lửa đèn cồn

- Hơ nóng đỏ que cấy, làm nguội dùng để lấy môi trường chứa vi khuẩn

- Bôi vaselin lên bốn góc của lam kính

- Lắc dung dịch có vi khuẩn và lấy hai đầu que cấy đầy dịch lên lam kính

- Đặt phiến kính lên lam kính

- Lật ngược phiến kính nhanh sao cho giọt dung dịch không chảy

ra ngoài

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi từ độ phóng đại nhỏ nhất

3.2. Nhuộm Gram và quan sát

 Đối với E.Coli và Bacillus subtilis

Chuẩn bị tiêu bản cố định vi khuẩn

- Ngâm phiến kính và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên ngọn lửa đèn cồn

- Dùng que cấy sau khi đã hơ nóng đỏ và làm nguội để lấy mẫu dần mỏng trên phiến kính

- Để khô, cố định bằng nhiệt (hơ sơ trên ngọn lửa đèn cồn)

- Nhỏ vài giọt tím tinh thể lên tiêu bản và để trong vòng 1 phút

- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây

- Nhỏ vài giọt dung dịch lugol lên tiêu bản và để trong vòng 10 giây

- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây

- Nhỏ ethanol lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây

- Nghiêng tiêu bản và rửa trôi lại bằng nước

- Nhỏ safranin lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây

- Rửa lại bằng nước, để khô, lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho không tạo bọt khí giữa lam kính và phiến kính

- Quan sát dưới kính hiển vi

4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

- Kefir là hỗn hợp nấm men và vi khuẩn, vừa có trực khuẩn vừa có liên

cầu khuẩn, vừa có Gram (+) vừa có gram (-), không có khả năng di chuyển

- Streptococus thermophillus vi khuẩn Gram (+), liên cầu khuẩn, hình cầu hoặc hình trứng, kết thành chuỗi ngắn, không có khả năng di chuyển di chuyển

- Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram

(+), đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động

- E coli là trực khuẩn Gram (-), vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ, có

hình que, thường đứng riêng rẽ, có thể từng đôi hoặc chuỗi ngắn, có khả năng di động

- Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, đứng riêng

lẻ hay tập trung thành sợi ngắn

- Acetobacter xylium là vi khuẩn Gram (-), hình que, có khả năng di

Hình 3-10 Lactobacillus acidophilus ở độ phóng đại x400.

Hình 3-11 Bacillus subtilis ở độ phóng đại x400

Hình 3-12 E.coli ở độ phóng đại x400.

Hình 3-13 Acetobacter xylinum ở độ phóng đại x400

5. ỨNG DỤNG

Ngày nay với những thành tựu của khoa học hiện đại, người ta đã tìm ranhững biện pháp hạn chế tác hại do vi khuẩn gây ra, ví dụ như việc chếvacxin phòng bệnh, sử dụng chất kháng sinh,

Bên cạnh đó, có một số vi khuẩn có lợi và có ứng dụng nhiều các lĩnh vựcthực phẩm, y học, công nghệ

5.1 Streptococus thermophillus

– Ứng dụng trong lên men sữa, sản xuất sữa chua, sản xuất phô mai

5.2 Bacillus subtilis

– Ứng dụng hữu ích trong môi trường

– Sản xuất enzyme sử dụng làm chất phụ gia trong chất tẩy rửa giặt ủi

– Có hoạt động tự nhiên diệt nấm, được sử dụng như một tác nhânkiểm soát sinh học

– Như một tác nhân để hỗ trợ điều trị các bệnh đường tiêu hóa và tiếtniệu sử dụng rộng rãi ở Tây Âu và Trung Đông như một loại thuốcthay thế kháng sinh

– Có thể chuyển đổi một số vật liệu nổ thành các hợp chất nito vô hại,carbon dioxide và nước

– Xử lý chất thải hạt nhân phóng xạ an toàn (ví dụ như thỏi IV vàplutonium IV)

– Được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chấtthải mạch nha

– Một số chủng của vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa đường trongthực vật thành dẫn xuất axít béo, chất thường được dùng để sảnxuất nhiên liệu.

– E coli cùng các vi khuẩn khác trong hệ vi khuẩn chí đường ruột góp

phần vào nhiều chức năng quan trọng trong sự sống của con người – Sản xuất insulin

– Tuy vậy, một khi vì lý do gì đó chúng bị lạc vào chỗ khác ngoài hệ

tiêu hóa thì chúng có thể gây bệnh Ví dụ E coli gây bệnh nhiễm

trùng tiểu, bệnh viêm màng não…Một số E.Coli gây bệnh đường ruộtnhư tiêu chảy ra máu

5.4 Lactobacillus acidophilus

– Thường được bổ sung vào các chế phẩm lên men từ sữa trong côngnghiệp sản xuất các loại enzyme amylase (một enzyme phângiải carbohydrate), từ công dụng này chúng thường được gọi là lợikhuẩn (vi khuẩn có lợi)

– Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose Khônglên men được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xyloseo

– Giúp cho việc sinh ra hay hấp thu vitamin B (folic acid, niacin), giúpgiảm cholesterol trong máu và giải được một số độc tố

– Sinh ra một số chất kháng sinh mạnh trong ruột bao gồmacidophilin, acidolin, lactocidin và bacteriocin giúp ngăn chặn khảnăng sinh trưởng của một số loài vi sinh vật gây bệnhnhư Campylobacter listeria và Staphylococci

– Sinh enzyme lactase giúp phân giải đường sữa Làm giảm sự pháttriển của các u bướu, có khả năng trung hòa hiệu quả và ngăn chặncác chất gây ung thư Làm giảm cholesterol trong máu

– Là một loại lợi khuẩn được ứng dụng vào chế phẩm sinh học Dùng

để sản xuất men và chất diệt khuẩn lactocidin, ức chế sinh trưởng sốlượng vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho vật nuôi Tăng cường khángsinh tự nhiên và hệ miễn dịch đường ruột

6. NHÂT KÝ THÍ NGHIỆM

Ngày 18/09/2018

12h45 Cô Phượng dặn dò trước thí nghiệm

13h15 Cô Ái hướng dẫn bài “Quan sát vi khuẩn”

13h50 Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 1

14h40 Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 2

15h15 Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 3

15h45 Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 4, 5, 616h15 Nhóm tiến hành làm tiêu bản giọt treo mẫu vi khuẩn số 3,

6

17h Kết thúc thí nghiệm và ra về

4.BÀI 4: QUAN SÁT NẤM MỐC

1. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

- Quan sát hình dạng các loại nấm mốc và bào tử của nó.

- Phân loại nấm mốc trong bài thí nghiệm dựa vào đặc điểm của nó.

- Ôn lại và nắm đặc điểm hình thái nấm mốc.

- Quan sát hình thái khuẩn ty (có vách ngăn không), bào tử (trần hay kín).

2. SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

Một số nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có vách ngăn (đơn bào) Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nho khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm có thể tăng trưởng chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.

Nấm mốc (nấm sợi) được nhận diện bằng đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi Tế bào nấm thường được phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử cuống mang bào tử có thể phân nhánh hay không phân nhanh Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm là báo tử kín hay bào tử trần.

Hai giống nấm Aspergillus và Penicillium thuộc nhóm nấm bất hoàn Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn Bào tử vô tính là bào tử trần.

Mucor và Rhizopus thuộc lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes Hệ sợi không có vách ngăn và có thể có rễ giả Bào tử vô tính là bào tử kín Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp Rhizopus có cuống mang bào từ không phân nhánh Mucor có cuống mang bào tử phân nhánh.

- Lấy một miếng bang dính trog suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm, sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho bang dính dính chặt vào phiến kính.

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi.

 Giá không phân nhánh

 Có rễ giả

Hình 4-15 Rhizopus sp quan sát qua kính

hiển vi

4.3. Aspergillus sp.

Nhận xét

 Bào tử hở

 Đầu khuẩn ty phình to có đính thể hình chai

- Mucor thường sử dụng ttrong sản xuất chao, nước tương, người ta sử

dụng Mucor để lên men đậu hũ, khi đó nó sẽ tiết ra enzyme đểchuyển biến protein, chất béo, glucid trong đậu thành những phân tửđơn giản như acid amin, acid béo, các đường đơn Như vậy chao cómùi thơm đặc biệt Ngày nay để hạn chế khả năng tạp nhiễm gây hư

Hình 4-16: Aspergills quan sát qua

kính hiển vi

hỏng chao, người ta tiến hành phân lập và sản xuất bột bào tửMucor.sp để sản xuất.

- Rhizopus là nấm sợi được tìm thấy nhiều trên trái cây hay rau quả bịthổi rữa, phân động vật và trên bánh mì Đây là loại gây bệnh phổbiến, chúng là nguyên nhân gây các bệnh nhiễm trùng nguy hiểmthậm chí chết người Bên cạnh đó, Rhizopus sp được ứng dụng trongsản xuất chao và temped (là một bánh thu được từ phương pháp lênmen bề mặt với nấm R oligosporus của những hạt đậu)

- Penicillium là một chi nấm có tầm quan trọng lớn trong môi trường

tự nhiên cũng như sản xuất thực phẩm và thuốc

Vài thành viên của chi được dùng để sản xuất penicillin - một khángsinh có thể giết chết hoặc ngừng sự phát triển của một số loại vi khuẩntrong cơ thể Vài loài được dùng để làm pho mát, ví dụ Phó-mátCamembert

- Sản xuất Amylase từ Aspergillus oryzae

Một số loài nấm sợi thường được sử dụng để sản xuất sinh khối protein

Mốc Aspergillus oryzae được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước, như sản

xuất nước tương (xì dầu), súp miso và rượu sake ở Nhật Bản hay làmtempeh ở Java

Mốc hoa cau được dùng để sản xuất tương, loại thực phẩm phổ biến ở

Việt Nam, cũng chính là Aspergillus oryzae, tuy nhiên tương sản xuất

thủ công lại có độ an toàn không cao, bởi những loại mốc tốt và không

độc như Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae lại rất dễ lẫn lộn với những loại mốc nguy hiểm có độc tố gây ung thư khác là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus

6. NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM

Ngày 25/09/2018

13h Cô Ái hướng dẫn quan sát nấm mốc, giới thiệu hình ảnh

các loại nấm mốc qua kính hiển vi

13h30 Cùng với nhóm 3 quan sát 4 loại nấm mốc

16h45 Rửa và sấy khô mỗi bạn 5 ống nghiệm, 2 hộp petri và 1

que trang

17h15 Kết thúc thí nghiệm và ra về

5.BÀI 5: LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH

VẬT

1 MỤC TIÊU:

- Tiệt trùng dụng cụ để đảm bảo vô khuẩn trong quá trình nuôi cấy

- Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống visinh

vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học củachúng

2 PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT:

7. Môi trường nuôi cấy là nguồn dưỡng chất được tạo ra nhằm cung cấpđầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triểncủa vi sinh vật

1 Theo cấu trúc

- Môi trường lỏng: thường sử dụng để nhân giống, lên men hay nghiên

cứu một số đặc tính của vi sinh vật Môi trường lỏng không chứa chấtlàm đặc môi trường như agar, gelatin, …

- Môi trường rắn (môi trường đặc): thường được tạo thành bằng cách

cho một hàm lượng nhỏ agar hay gelatin vào môi trường lỏng để làmđặc môi trường Môi trường rắn thường được sử dụng để phân lập visinh vật, để quan sát hình thái khuẩn lạc hoặc để nghiên cứu một sốđặc tính khác…

- Môi trường bán rắn: có hàm lượng các chất tạo độ đặc ít hơn so với

môi trường rắn, cấu trúc dạng dẻo Được sử dụng trong một sốtrường hợp, ví dụ để xác định khả năng chuyển động của một số loài

vi khuẩn

2 Theo thành phần

- Môi trường tổng hợp: thành phần hóa học xác định, thường được

chuẩn bị từ những hợp chất hóa học tinh khiết có công thức hóa họcxác định Có độ lặp lại cao

- Môi trường tự nhiên: thường bao gồm những hợp chất chưa được xác

định rõ thành phần, không có công thức hóa học rõ ràng (pepton,cao thịt,…) Có độ lặp lại tùy thuộc vào nhà sản xuất

- Môi trường hòa tan chuẩn bị sẵn: môi trường pha trộn sẵn dạng bột,

để tiện lợi cho người sử dụng Sử dụng rất đơn giản bằng cách hòatan vào nước một hàm lượng nhất định là đã có đủ tất cả các thànhphần dinh dưỡng cần thiết

3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

1 Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc

- Khi làm việc và nghiên cứu vi sinh vật, để tránh bị lây nhiễm từ những

vi sinh vật không mong muốn trong môi trường xung quanh, ta cầnphải đảm bảo sao cho môi trường, bề mặt làm việc, cũng như nhữngdụng cụ tiến hành thí nghiệm trong điều kiện vô khuẩn

- Sự vô trùng của nơi làm việc không những phụ thuộc vào phươngpháp tiệt trùng mà còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện và sự thônggió nói làm việc Nơi làm việc không được có sự thông khí ngay cả khikhông khí đó đã được lọc.

2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật

a. Môi trường Hansen đặc

8. Cân các thành phần và pha môi trường theo bảng sau:

b. Môi trường Hansen lỏng

24. Cách làm tương tự như làm Môi trường Hansen đặc, chỉ khác ở điểmvới Hasen lỏng thì ta không cho Agar vào môi trường

 Đối với môi trường Hansen đặc và lỏng mỗi sinh viên cần chuẩn bị:

37. Cuối cùng đem tiệt trùng ở 1210C trong khoảng 15 phút

 Đối với môi trường PCA mỗi sinh viên càn chuẩn bị: 2 ống ½

38. Thao tác chuẩn bị ống nghiệm:

39. Trong thời gian đợi các môi trường được đồng hóa, tiến hành làm nútbông và giấy cho 7 ống nghiệm

40. Sau khi môi trường đã hóa lỏng, tiến hành rót vào các ống nghiệm

- Tay trái cầm ống nghiệm

- Tay phải kẹp nút bông bằng ngón tay út và ngón áp út, kéo ra

- Nhanh chóng rót môi trường vào ống nghiệm và đậy nút bông lại

 Chú ý: Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi

trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phânphối cần thực hiện xong trước khi môi trường rắn bị đông đặc