Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn. Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn. Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn. Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống
MỤC LỤC MỤC LỤC HÌNH BÀI 1: QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM • Quan sát đặc điểm hình thái vi sinh vật: nấm men, vi khuẩn, nấm mốc • Làm quen biết cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật • Biết làm tiêu vi sinh vật để quan sát kính hiển vi SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT 2.1 Giới thiệu vi sinh vật Vi sinh vật sinh vật đơn bào đa bào nhân sơ nhân thực có kích thước nhỏ, khơng quan sát mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi Kích thước vi sinh vật thường đo micromet Thuật ngữ vi sinh vật không tương đương với đơn vị phân loại phân loại khoa học Nó bao gồm virus, vi khuẩn (bao gồm cổ khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật 2.2 Giới thiệu kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh vật thể nhỏ phóng đại nhờ hệ thống thấu kính thủy tinh Kính hiển vi quang học dạng kính hiển vi đơn giản, lâu đời phổ biến Hình 1.1 Kính hiển vi quang học – Cấu tạo kính hiển vi quang học: (1) Thị kính: Có thể từ đến thấu kính thủy tinh cho phép tạo ảnh cuối vật qua hệ quang học Độ phóng đại thị kính nhỏ, thường 10x, lắp đặt ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng (2) Giá điều chỉnh vật kính (3) Vật kính: thấu kính quan trọng hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, (hoặc hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn Nhờ có giá điều chỉnh, vật kính khác xoay để thay đổi trị số phóng đại Trên vật kính ghi trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x Trong số vật kính đặc biệt, người ta sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải hệ thống (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao mẫu vật để lấy nét trình tạo ảnh (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật (8) Hệ thống độ, thấu kính hội tụ để hội tụ tạo chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát phần khác theo ý muốn Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng gương phản chiếu – Đặt tiêu lên bàn kính cho vật mẫu nằm trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm dễ bị hỏng mắt – Mắt nhìn vật kính từ phía kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống) vật kính gần sát kính tiêu – Mắt nhìn vào thấu kính, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều ngược lại (vặn lên) nhìn thấy vật cần quan sát – Điều chỉnh ốc nhỏ để nhìn vật mẫu rõ 2.3 Làm tiêu để quan sát – Làm tiêu giọt ép: phương pháp đơn giản nhất, quan sát trực tiếp chuyển động vi khuẩn – Làm tiêu giọt treo: quan sát vi khuẩn thời gian lâu hơn, vi khuẩn treo lam kính đặt phiến kính lõm CÁCH TIẾN HÀNH + Ngâm phiến kính lam kính petri chứa cồn 70° + Lấy phiến kính ra, lau khô giấy, hơ lửa đèn cồn + Dùng đũa thủy tinh lấy giọt nước vô khuẩn nhỏ lên phiến kính + Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau lấy phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên que cấy + Trộn vi sinh vật que cấy vào giọt nước dàn mỏng giọt nước phiến kính + Lấy lam kính lau khô giấy hơ nhẹ lướt qua lửa đèn cồn, sau đậy lên phiến kính để cố định vi sinh vật quan sát + Dùng giấy thấm xung quanh, đảm bảo xung quanh lam kính khơ + Quan sát hình thái nấm men, vi khuẩn, nấm mốc kính hiển vi KẾT QUẢ NHẬN XÉT Hình 1.1 Nấm men Hình 1.2 Nấm sợi Penicillium - Nhận xét: Quan sát đặc điểm nấm men qua kính hiển vi: hình cầu Đặc điểm nấm mốc Penicillium: chuỗi đính bào tử, phân nhánh, có vách ngăn Thời gian điều chỉnh kính hiển vi để quan sát rõ nét lâu ỨNG DỤNG – Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật – Nhận định có mặt vi sinh vật mẫu cần khảo sát: có hay khơng – Quan sát, nhận biết khác loại vi sinh vật BÀI 2: QUAN SÁT NẤM MEN MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM • Đánh giá canh trường nấm men, tỷ lệ nảy chồi tỷ lệ sống chết • Quan sát số lượng chất lượng nấm men SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT • • • • • 2.1 Khái quát nấm men Nấm men nhóm vi sinh vật dùng nhiều công nghiệp, hầu hết nấm men đơn bào, khơng chuyển động Hình dạng kích thước chúng thay đổi tùy điều kiện mơi trường Nói chung nấm men có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục,… có kích thước tương đối lớn, chiều dài từ – 10μm có 12 - 18μm, có chiều ngang từ - μm Về cấu tạo tế bào, gồm thành tế bào tế bào chất Trong tế bào chất có nhiều quan khác nhau, không bào chất chứa đựng khác như: glycogen, granuloza, chất béo, volutin,… Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi, phân chia tạo thành bào tử hữu tính Trong q trình phát triển, hình thái nấm men thay đổi sau: + Ở nấm men trẻ (qua 12 – 16 nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa có bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao + Ở nấm men trưởng thành (24 – 48 giờ): kích thước điển hình, khơng bào lớn, số khơng bào đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao + Ở nấm men già (đã nuôi cấy từ 72 trở lên): màng dày nhẵn, tế bào chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào khơng sinh sản nữa, khơng có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn Nguyên tắc quan sát nấm men sống chết: Tế bào chất chết dễ bắt màu Thuốc nhuộm qua màng tế bào chết dễ dàng qua màng tế bào sống Vì ta dùng xanh methylene để nhuộm phân biệt sống chết Quan sát lượng nấm men nảy chồi: Đây việc làm quan trọng đánh giá chất lượng canh trường nấm men vào thùng lên men Trong canh trường nấm men cho vào thùng lên men, lượng tế bào nảy chồi phải chiếm từ 10-15% Nếu canh trường giai đoạn sinh sản mạnh, số tế bào nảy chồi đạt đến 7080% 2.2 Phương pháp đếm số tế bào vi sinh vật buồng đếm: • Phạm vi áp dụng: đếm số loài nấm men vi khuẩn • Mục đích: theo dõi sinh trưởng vi sinh vật trình lên men thực mơi trường lỏng • Cấu tạo buồng đếm: + Buồng đếm phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật + Trên bề mặt buồng đếm, có đục rãnh song song với chiều rộng chia bề mặt thành khoang A, B, C Chiều cao hai khoang A, C Khoang B thấp hai khoang bên A C đoạn h Giá trị h gọi chiều cao buồng đếm + Khoang B chia tiếp thành khoang nhỏ B B2 nhờ rãnh đục song song với chiều dài bề mặt buồng đếm + Trên khoang nhỏ, người ta kẻ lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình vuông hình chữ nhật Một ô lớn chia tiếp thành ô nhỏ + Buồng điếm có kèm theo kính để đậy Lá kính có bề mặt hình vng phẳng CÁCH TIẾN HÀNH 3.1.Quan sát nấm men sống chết -Cho vài giọt canh trường nấm men Saccharomyces cerevisae giọt thuốc nhuộm xanh methylene (đã pha loãng 10 lần) lên phiến kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy kính lại để yên 2-3 phút đem quan sát: tế bào chết bắt màu xanh tế bào sống khơng màu -Muốn tính tỷ lệ tế bào sống chết, ta đếm số tế bào chết tổng số tế bào chung (sống chết) kính trường suy phần trăm tế bào sống chết Nếu nấm men giai đoạn sinh trưởng, lượng tế bào chết không 2-4% 3.2.Quan sát lượng nấm men nảy chồi -Cho giọt canh trường nấm men giọt NaOH H2SO4 10% lên phiến kính trộn đều, đậy kính lại, đặt lên kính hiển vi quan sát Đếm số tế bào chung số tế bào nảy chồi suy phần trăm -Tế bào xem nảy chồi, tức tế bào có tế bào bé ½ tế bào mẹ, tế bào lớn ½ tế bào mẹ phải tính hai tế bào 3.3.Quan sát tỷ lệ sống chết -Chuẩn bị xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu -Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2 -Làm tiêu -Nhuộm màu trước ép lamen mỏng lên lam kính -Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men -Đem tiêu quan sát kính hiển vi điểm khác 3.4.Đánh giá nhiễm vi sinh vật canh trường: Trong thực thí nghiệm 2, quan sát xem canh trường có bị nhiễm VSV lạ hay khơng 3.5.Đếm tế bào nấm men 1ml canh trường (dùng buồng đếm Thomas): -Tiệt trùng buồng đếm cách ngâm cồn 70o -Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2 -Đậy kính lên buồng đếm nhỏ mẫu vào khe hẹp phía buồng đếm, dùng giấy thấm, sau tiến hành quan sát kính hiển vi, đếm tổng số tế bào 10 ô vuông lớn buồng đếm KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Quan sát nấm men nảy chồi Hình 2.1 Quan sát nấm men nảy chồi Bảng 1: Tổng số nấm men tế bào chồi Điểm Nảy chồi Tổng ⟹ Tỉ lệ nảy chồi : 90 12 83 + 12 + 11 + 15 + 10 = 12,76% 90 + 83 + 85 + 93 + 88 Quan sát nấm men sống chết 11 85 15 93 10 88 Hình 2.2 Quan sát tế bào nấm men sống chết Bảng 2: Tổng số nấm men số tế bào chết Điểm Tổng Số tế bào chết 16 2 27 21 37 20 TB 24,2 2,2 2, = 9,1% 24, ⟹ Tỉ lệ tế bào chết ⟹ Tỉ lệ tế bào sống 90,9% Đếm tế bào nấm men có ml canh trường buồng đếm Vùng đếm số 2: Công thức: Tổng số tế bào nấm men có 1ml mẫu ban đầu: A × 103 × F N = h×S Với A: số tế bào trung bình đếm h: chiều cao buồng đếm (mm) S: diện tích đếm (mm2) 1000: Hệ số chuyển đổi từ mm3 sang cm3 F: Hệ số pha loãng mẫu trước đếm Ví dụ buồng đếm Thoma có h = 0,1mm; S = (1/250)mm2 nên số tế bào có 1ml mẫu ban đầu là: 10 + Đối với ống ½ (làm thạch đứng): đặt ống nghiệm vào giá để yên môi trường nguội đông đặc Bảo quản kiểm tra môi trường + Môi trường chưa dùng cần bảo quản chỗ mát, hạn chế tác dụng ánh sáng, nhiệt độ từ - 5°C không để môi trường bị khô + Trước sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37ºC, 48 - 72h Sau lấy quan sát, loại bỏ ống có vi sinh vật phát triển sử dụng ống nghiệm, đĩa pêtri có mơi trường đạt u cầu KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Dụng cụ + Tất dụng cụ cần cho thí nghiệm tiệt trùng + Các ống nghiệm chứa môi trường đạt chuẩn, không nhiễm khuẩn + Tất dụng cụ khử trùng môi trường không bị nhiễm khuẩn + Dụng cụ bao gói đảm bảo khơ + Đầu nút bơng tròn, độ chặt vừa phải + Lấy nút hay đóng vào dễ dàng + Phần giấy bao gói chặt kín Mơi trường: + Mơi trường định hình tốt, mặt thạch nhẵn, khơng bị dính mơi trường lên miệng ống nghiệm nút + Chuẩn bị môi trường dùng cho việc gieo cấy, phân lập, định lượng quan sát vi sinh vật Hình 18 Thạch môi trường nghiêng thạch môi trường đứng ỨNG DỤNG Tiệt trùng bảo quản dụng cụ thí nghiệm mơi trường ni cấy, sử dụng cho thí nghiệm với vi sinh vật Tạo môi trường nuôi cấy cho vi sinh vật, tạo điều kiện thích hợp cho q trình nhân giống, lên men, nghiên cứu đặc tính vi sinh vật, để phân lập vi sinh vật Tạo môi trường cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho phát triển vi sinh vật 37 BÀI 7: GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM • Nắm bước trình phân lập vi sinh vật thao tác cấy chuyền ni cấy vi sinh vật • Rèn luyện kỹ phân lập nuôi cấy vi sinh vật • Hiểu nắm vững ý nghĩa việc phân lập, nuôi cấy bảo quản vi sinh vật SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT Mục đích gieo cấy là: để nuôi cấy vi sinh vật, cần phải thường xuyên cấy vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác đảm bảo cấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật sử dụng với vi sinh vật không mong muốn từ môi trường xung quanh 2.1 Nuôi cấy vi sinh vật • • • • • • • • • Q trình ni cấy vi sinh vật gồm khâu: ni cấy Hai khâu gắn bó với trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Ni: q trình đẩm bảo trì điều kiện thuận lợi cho hoạt động phát triển vi sinh vật Cấy: thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng Mục đích: Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu Tiến hành nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng Bảo tồn giống khiết Nghiên cứu đặc tính sinh học hệ thống sinh học chúng Nguyên tắc: Mọi thao tác nuôi cấy phải thực điều kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn Môi trường dụng cụ nuôi cấy phải khử trùng Duy trì điều kiện thuận lợi để vi sinh vật phát triển Các kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật 2.2 Phân lập vi sinh vật Trong thiên nhiên hay vật phẩm nghiên cứu, VSV thường tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều lồi khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa sử dụng vào thực tiễn lồi cần phải đưa chúng dạng khiết Phân lập VSV trình tách riêng loài VSV từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết VSV dạng khiết giống VSV tạo từ tế bào ban đầu Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng VSV Nguyên tắc: 38 • Tách rời tế bào vi sinh vật • Nuối cấy tế bào môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ • • • Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước: Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu Phân lập vi sinh vật khiết Kiểm tra độ tinh khiết vi sinh vật Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật: Phương pháp đồ đĩa Phương pháp dàn Phương pháp cấy ria 2.3 Các phương pháp giữ giống vi sinh vật Nguyên tắc: Các chủng vi sinh vật khiết sau phân lập cần phải bảo quản điều kiện tối ưu cho sau thời gian bảo quản chúng trạng thái hoạt động giữ hoạt tính khơng bị thay đổi Đảm bảo tốt điều kiện q trình bảo quản để khơng làm thay đổi phẩm chất ban đầu giống Làm chậm q trình trao đổi chất hơ hấp vi sinh vật đồng thời ngăn cản trình sinh sản chúng Các phương pháp: - Các phương pháp cấy chuyền: + Cấy chuyền định kỳ: Phương pháp áp dụng để bảo quản tất loại vi sinh vật Với nấm men, vi khuẩn cấy chuyền sau 1-2 tháng, với nấm mốc cấy chuyền sau 3-6 tháng Thời gian lần cấy kéo dài sau cấy vi sinh vật bảo quản nhiệt độ thấp (3-5ºC) Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ làm Nhược điểm: tốn môi trường, công sức, thời gian, thời gian bảo quản không lâu Phẩm chất ban đầu giống bị thay đổi nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trình cấy chuyền + Bảo quản dầu: paraffin phủ lớp thạch nghiêng giúp ngăn cản bay nước môi trường nuôi cấy vi sinh vật làm chậm tốc độ phát triển vi sinh vật nhờ hạn chế O2 - + Bảo quản nước: Cắt khối agar 6mm từ rìa khuẩn lạc Đặt khối agar vào ống nghiệm có chứa nước cất vơ khuẩn, đậy chặt nắp ống nghiệm bảo quản 25ºC Phương pháp đông khô: 39 Phương pháp làm cho tế bào nước trạng thái tự Đồng thời làm giảm, chí ngừng hẳn q trình phân chia vi sinh vật Nhờ chúng chịu nhiều tác động ngoại cảnh - Phương pháp dùng nhiều sản xuất, thời gian bảo quản lên tới vài chục năm Phương pháp sấy khô - Sấy khô làm giảm trao đổi chất vi sinh vật Tế bào hay bào tử vi sinh vật sấy khơ cách thổi khơng khí, chất hút ẩm silica gel hay đất hay phương pháp đông Thường bào tử có hàm lượng nước thấp so với tế bào dinh dưỡng chịu điều kiện khô tốt Phương pháp bảo quản nhiệt độ lạnh đông Hạ thấp nhiệt độ môi trường nuôi cấy vi sinh vật làm giảm trình trao đổi chất dừng hẳn tồn nước tế bào vi sinh vật bị đóng băng Dưới -70ºC, khơng có trao đổi chất vi sinh vật Tuy nhiên thay đổi cấu trúc tinh thể đá xảy nhiệt độ -135ºC Bởi vậy, bảo quản vi sinh vật nhiệt độ nito lỏng (-196ºC) phương pháp bảo quản an toàn sử dụng + Chuẩn bị hỗn hợp vi sinh vật 10% glycerol vơ khuẩn **Dung dịch glycerol có độ nhớt cao, tránh tượng co cụm tế bào với nhau, nhiệt độ đông đặc thấp, nhiệt độ thấp, tế bào vi sinh vật tách rời ⟹ bảo quản lâu + Cho 0.5 ml hỗn hợp vào ống nghiệm nhựa vô khuẩn + Làm lạnh ống nghiệm xuống -50 ºC với vận tốc làm lạnh thích hợp cho loài vi sinh vật + Khi nhiệt độ hỗn hợp hạ thấp xuống -50ºC, đặt ống nghiệm vào nito lỏng, Ngồi nito lỏng, vi sinh vật bảo quản nhiệt độ cao -20 ºC, -40ºC, -70ºC, nhiên nhiệt độ cao thời gian bảo quản ngắn vi sinh vật dễ hoạt tính CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nuôi cấy vi sinh vật Đối với ống nghiệm thạch nghiêng + Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật, Ngày cấy vào thành ống nghiệm, nút chút +Tay trái cầm ống nghiệm: ống giống, ống môi trường + Tay phải cầm que cấy khử trùng đèn cồn nóng đỏ dây cấy + Dùng ngón út ngón áp út kẹp nút bơng vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống + Hơ nóng để khử trùng khơng khí miệng ống nghiệm 40 ** Chú ý: không làm cháy nút không làm rơi nút xuống bàn cấy hay để nút bơng chạm vào vật xung quanh Luôn giữ miệng ống nghiệm mở vị trí nằm nghiêng gần lửa đèn cồn + Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc ống giống + Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm đưa ống vào môi trường để thực thao tác cấy truyền + Di que cấy có chứa canh trường vi sinh vật lên bề mặt thạch agar ống mơi trường theo hình chữ chi vạch song song Hình 19 Một số kiểu ni cấy thạch nghiêng • • • • + Rút que cấy ra, hơ đỏ lửa đèn cồn để vơ khuẩn sau đặt que cấy lên giá đỡ ống nghiệm + Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút ** Chú ý: Nút ống nghiệm đậy ống nghiệm Đối với hộp petri Để đĩa petri lên bàn Dùng que cấy (que cấy tròn) lấy canh trường VSV theo thứ tự yêu cầu phương pháp chung: hơ que cấy, làm nguội lấy vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật Tay trái mở nắp đĩa petri vừa đủ que cấy vào Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo kiểu sau: + Theo hình chữ chi tồn mặt thạch + Theo đường cong song song + Theo hình chữ chi góc **Chú ý: Mỗi lần vạch xong đường cần hơ đỏ que cấy, làm nguội, vạch đường 41 Hình 20 Phương pháp cấy ria • Lật ngược hộp petri, bao bín màng bọc thực phẩm, để vào tủ ấm 35ºC 48h 3.2 Phân lập vi sinh vật • Pha lỗng mẫu: cơng đoạn quan trọng trình phân tích vi sinh vật Việc pha lỗng nồng độ thích hợp giúp ích nhiều q trình định lượng phân tích vi sinh vật *Phương pháp: Đối với mẫu lỏng, dùng pipet man hút ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch nước cất tiệt trùng, lắc trộn, ta có nồng độ pha lỗng 10-1 + Tiếp tục từ ống 10-1 hút tiếp ml cho vào ống nghiệm chứa ml nước cất tiệt trùng khác, lắc trộn, ta nồng độ pha loãng 10-2 + Tiếp theo từ ống 10-2 hút tiếp ml cho vào ống nghiệm chứa ml nước cất tiệt trùng khác, lắc trộn, ta nồng độ pha lỗng 10-3 + Tiếp tục đến nồng độ pha lỗng 10-5 • Đổ mơi trường chuẩn bị sau đồng hóa thành lỏng vào hộp petri, đậy nắp để nguội đông đặc • Dùng pipet man hút 0.2 ml mẫu (2 mẫu 10-3, mẫu 10-4 , mẫu 10-5) pha loãng vào hộp petri chứa thạch đông đặc Dùng que chan dàn *Chú ý: Phải thực môi trường xung quanh hộp petri có đèn cồn cháy để tránh nhiễm khuẩn • Bao kín hộp petri màng bọc thực phẩm, úp ngược để tủ ấm nhiệt độ thích hợp vòng 48 – 72 giờ, sau lấy quan sát KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 4.1 Nuôi cấy vi sinh vật a) Trong ống nghiệm thạch nghiêng Ống nghiệm cấy ria (rắn – lỏng) 42 Ống nghiệm không bị nhiễm, vi khuẩn phát triển tạo nên vệt mặt thạch nghiêng, có màu trắng đục.Tuy nhiên, vệt mặt thạch chưa đẹp, tiến hành cấy run, vạch lên đường khơng • • • b) Khi cấy truyền vi sinh vật ống thạch nghiêng, phải ria cấy ngược từ đáy ống nghiệm lên phía vì: Nếu ria từ xuống khó thao tác làm rách thạch Ria từ lên, que cấy theo chiều từ lên khỏi ống nghiệm mà không cần di chuyển qua đường cấy, tránh tình trạng vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy Khi môi trường chuẩn bị xong có giọt nước đáy ống nghiệm, thao tác thường dùng que cấy hòa vào giọt nước bắt đầu ria, vi sinh vật mọc đường cấy Trong hộp petri Hộp petri nuôi cấy vi sinh vật không bị nhiễm, vi khuẩn phát triển tạo nên vệt bề mặt thạch có màu trắng đục Tuy nhiên, thao tác thí nghiệm chưa chun nghiệp, tay run cấy nên vạch đường vi khuẩn không đồng Đĩa petri sau cấy vi sinh vật nên đặt úp mặt thạch vì: • Tránh đổ vỡ sử dụng đĩa sau • Khi đặt úp mặt thạch tránh tình trạng nhiễm vi sinh vật không mong muốn Thông thường, sau cấy vi sinh vật, đĩa petri bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng tủ ấm, điều sinh nước Nếu đặt ngửa mặt thạch, nước bốc lên gặp nắp đĩa petri rơi xuống trở lại môi trường, điều làm ảnh hưởng đến kết cấy, vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy bị nhiễm 43 Hình 21 Ni cấy vi sinh vật hộp petri 4.2 Phân lập vi sinh vật - mẫu chứa nồng độ pha lỗng 10-3: khuẩn lạc hình tròn mọc tương đối mặt thạch, có màu trắng đục - Mẫu chứa nồng độ pha loãng 10-4 bị mốc mẫu 10-5 bị nhiễm nên không xuất khuẩn lạc Khi đổ thạch vào hộp petri cho mẫu nồng độ pha lỗng vào phải khử trùng mơi trường xung quanh tay, đốt đèn cồn để xung quanh để tránh nhiễm vi sinh vật vào môi trường thạch Ghi nhãn môi trường nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn ỨNG DỤNG Phân lập để nghiên cứu tính chất ứng dụng vi sinh vật lĩnh vực đời sống 44 BÀI 8: QUAN SÁT KHẢ NĂNG DỊ HÓA CARBOHYDRATE MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM – Quan sát, nhận xét đánh giá khả dị hóa Carbonhydrate số lồi vi sinh vật mơi trường yếm khí hiếu khí – Xác định vi sinh vật dị hóa Carbonhydrate theo đường hô hấp hay lên men – Xác định khả thủy phân tinh bột thông qua việc đo vòng tròn thủy phân – Biết cách pha chế số môi trường dinh dưỡng để chuẩn bị cho q trình ni cấy SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT Carbohydrate Carbohydrate nguồn cung cấp carbon lượng chủ yếu cho phần lớn vi sinh vật Carbohydrate phân loại thành đường đơn, đường oligo đường đa phân tử Tinh bột cellulose loại đường đa phân tử Không phải vi sinh vật có khả sử dụng đường đa phân tử Chỉ vi sinh vật có khả tiết môi trường enzyme ngoại bào để thủy phân đường thành đường đơn có khả dị hóa chúng Khái niệm dị hóa Dị hóa trình phân giải hợp chất hữu tổng hợp q trình đồng hóa tạo thành hợp chất đơn giản giải phóng lượng Khơng có dị hóa khơng có lượng để cung cấp cho q trình đồng hóa hoạt động tế bào Lên men hô hấp Đường đơn vận chuyển vào tế bào vi sinh vật chuyển hóa theo đường để cung cấp lượng cho tế bào Đó lên men hơ hấp Sự lên men thường không cần tới oxy, sản phẩm cuối tạo thành thường loại acid hữu Hô hấp hiếu khí bắt buộc phải có tham gia oxy Hơ hấp cho sản ohẩm cuối khí carbonic nước Môi trường OF Để xác định vi sinh vật sử dụng q trình lên men hay hơ hấp để phân hủy đường, người ta thường sử dụng mơi trường OF Mơi trường OF có chứa hàm lượng đường cao hàm lượng peptone thấp Peptone tạo điều kiện cho vi sinh vật khơng có khả hô hấp lên men phát triển 45 Mơi trường OF có chứa bromthymol blue, chất thị màu, có màu vàng mơi trường acid màu xanh môi trường kiềm: + Nếu vi sinh vật có khả lên men, mơi trường OF có màu vàng ống nghiệm + Nếu vi sinh vật có khả hơ hấp khơng lên men, có ống nghiệm để điều kiện hiếu khí cho màu vàng + Nếu vi sinh vật khơng có khả lên men hơ hấp, hai ống có màu xanh - - CÁCH TIẾN HÀNH Nguyên liệu môi trường + Vi khuẩn: Bacillus substilis, Lactobacillus acidophillus + Nấm men: Sacharomyces cerevisiae + Nấm sợi: Aspergillus oryzae + Môi trường tinh bột (M8) + Môi trường OF (M9) + Dung dịch lugol (S3) Chuẩn bị môi trường Môi trường tinh bột M8 + Bột chiết thịt bò 3g + Tinh bột hòa tan 10g + Thạch 12g + Nước cất vừa đủ 1L + Tiệt trùng môi trường 1210C thời gian 15phút Môi trường OF + Glucose 10g + Peptone 2g + NaCl 5g + KH2PO4 0,3g + Dd bromthymol blue 1% 3ml (dung môi nước) + Thạch 3g + Nước cất vừa đủ 1L + pH cuối 7,1±0,2 + Tiệt trùng môi trường 1210C thời gian 15 phút Khả thủy phân tinh bột: Chuẩn bị hộp petri có chứa môi trường tinh bột Cấy điểm nhỏ bảo tử nấm mốc vào hộp Nuôi cấy nhiệt độ phòng ngày Ghi nhận phát triển khuẩn lạc, sau nhỏ dung dịch lugol lên bề mặt hộp petri, phần tinh bột bị thủy phân môi trưởng suốt Phần không bị thủy phân có màu xanh Mơi trường OF-glucose: Cấy vi khuẩn, nấm men, nấm mốc vào cặp ống nghiệm có chứa môi trường OFglucose 46 - Đổ dầu paraffin vào ống nghiệm cặp Nuôi cấy vi sinh vật 350C buổi thí nghiệm sau Quan sát ông nghiệm, ghi lại kết KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Hình 22 Kết khảo sát khả dị hóa carbohydrate mơi trường OF – glucose Nấm men Sacharomyces cerevisiae môi trường OF – glucose điều kiện hiếu khí yếm khí, hai ống nghiệm có màu vàng Nấm men Sacharomyces cerevisiae có khả lên men Nấm mốc Aspergillus oryzae môi trường OF – glucose điều kiện hiếu khí yếm khí có màu vàng, nhiên màu vàng chưa thể rõ nấm men Do nấm mốc cần thời gian lên men nấm men Vi khuẩn Bacillus substilis mơi trường OF – glucose điều kiện hiếu khí yếm khí có màu vàng, màu vàng rõ nấm mốc chưa nấm men Thời gian lên men trung bình Vi khuẩn Lactobacillus acidophillus môi trường OF – glucose điều kiện hiếu khí yếm khí có màu xanh Vi khuẩn khơng có khả lên men hơ hấp 47 Hình 23 Quan sát nấm mốc mơi trường tinh bột Hình 24 Quan sát khả thủy phân tinh bột nấm mốc (ssau thêm dung dịch Lugol) Đường kính lớn 8,3 cm; đường kính nhỏ 7,8 cm Theo kết quả, ta thấy, chênh lệch đường kính vòng tròn thấp 0,5 cm suy khả thủy phân tinh bột nấm mốc chậm ỨNG DỤNG Bacillus substilis có khả tiết enzyme cenllulase biến đổi cellulose thành đường Lactobacillus acidophillus giống dùng trình lên men quy trình sản xuất acid lactic 48 Nấm men: ứng dụng hơ hấp yếm khí vào q trình sản xuất thực phẩm làm cơm rượu, muối chua,… Aspergillus oryzae: ứng dụng thuỷ phân vào việc sản xuất nước tương, hệ enzyme thuỷ phân bã đậu nành tạo môi trường lên men axit citric tốt BÀI 9: QUAN SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM • Quan sát khác khả lên men lồi vi sinh vật mơi trường cụ thể biết sản phẩm tạo sau q trình lên men • Tạo mơi trường lên men • Khảo sát khả lên men loại đường – – – – – • • • SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT Khi vi sinh vật có khả lên men, khơng phải có khả lên men tất loại đường Sản phẩm q trình lên men acid hữu cơ, loại rượu hay số hợp chất khác khơng có tính acid Q trình lên men tạo khí, khơng tạo khí carbonic Môi trường dùng để xác định khả lên men loại đường khác vi sinh vật đánh giá khả tạo thành số sản phẩm q trình lên men acid khí carbonic gọi ống thử lên men + Môi trường ống thử lên men có thành phần bao gồm: peptone, phenol red, 0,1-1% đường, ống Durham + Acid tạo thành mơi trường làm phenol red có màu vàng + Nếu môi trường sau lên men acid, dung dịch có màu đỏ + Khí carbonic tạo bị giữ lại ống Durham Nếu thời gian lên men dài, vi sinh vật chuyển sang sử dụng peptone lượng đường hết làm tăng pH mơi trường, chuyển thành màu đỏ CÁCH TIẾN HÀNH Nguyên liệu Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Acetobacter xylinum Nấm men: Sacharomyces cerevisiae Môi trường lên men với glucose, lactose, saccharose (M10) Chuẩn bị môi trường lên men (M10): Đường 5g Peptone 10g Bột chiết nấm men Dd chất thị 5g 2ml 49 Nước cất vừa đủ • • • • 1L pH cuối 7,0±0,2 Tiệt trùng môi trường 1210C thời gian 15 phút Để pha dung dịch chất thị, hòa tan 8g bromthymol blue vào hỗn hợp 250ml ethanol 90% 250ml nước cất Môi trường lên men với glucose, lactose, saccharose Chuẩn bị ống nghiệm có chứa mơi trường lên men khác nhau, có đặt ống Durham Cấy vi sinh vật vào ống Theo dõi khả phát triển, khả tạo acid, khả tạo khí ống nghiệm Ghi nhận đánh giá kết KẾT QUẢ VÀ NHẪN XÉT Hình 25 Khảo sát lên men loại đường Môi trường lên men với glucose – Nấm men: màu vàng, dịch đục, có bọt khí – Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum: Màu vàng, khơng bọt khí, dịch đục, ống Durham xanh – Acetobacter xylinum: Màu vàng, có bọt khí, dịch đục Môi trường lên men với lactose 50 – – – – – – – – Nấm men: Màu vàng, khơng bọt khí Lactobacillus acidophilus: màu vàng, dịch đục, khơng bọt khí Lactobacillus plantarum: màu xanh, dịch đục, có bọt khí, có váng bề mặt Acetobacter xylinum: Màu vàng, có bọt khí, dịch đục Mơi trường lên men với saccharose Nấm men: Màu vàng, có bọt khí, dịch Lactobacillus acidophilus: màu vàng xanh, không bọt khí, dịch đục, ống Durham xanh Lactobacillus plantarum: màu vàng, khơng bọt khí, dịch đục Acetobacter xylinum: màu vàng xanh, có bọt khí, dịch Mẫu kiểm chứng, mơi trường lên men với glucose: màu vàng, có bọt khí, dịch đục, có váng bề mặt Tùy điều kiện mơi trường khác vi sinh vật lên men khác với màu sắc, bọt khí độ hay độ đục dịch khác Từ đó, thấy khả lên men loại đường khác ỨNG DỤNG Lựa chọn loại đường cho nhóm vi sinh vật, từ nâng cao hiệu suất q trình lên men Nấm men ứng dụng lên men cồn từ rỉ đường, lên men đường sản xuất bia, bánh mì,… Quá trình lên men người sử dụng cho sản xuất thực phẩm nước giải khát Ví dụ, lên men dùng để bảo quản trình lên men acid lactic (vi khuẩn Lactobacillus acidophilus) tìm thấy thực phẩm muối chua dưa muối, kimchi yaua, trình sản xuất thức uống có cồn rượu bia Ngồi ra,, Lactobacillus acidophilus sinh enzyme lactase giúp phân giải đường sữa Lactobacillus plantarum ứng dụng lên men nước cà chua sản xuất probiotic Lactobacillus plantarum có khả giúp tiêu hóa chất xơ có lúa mì, lúa mạch đen, men bia… Do chúng cải thiện tốt vấn đề tiêu hóa đầy hơi, chướng bụng Acetobacter xylinum ứng dụng lên men sản sản xuất thạch dừa Ngoài ra, vi khuẩn đối tượng nghiên cứu nhà khoa học đề tài ứng dụng Acetobacter xylinum vào chế tạo nên màng sinh học Bacterial Cellulose (BC) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Văn Việt Mẫn (Chủ biên), Lại Mai Hương, ‘Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm’, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, ‘Vi sinh vật học’, Nhà xuất Giáo dục 51 ... TẾ BÀO VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM • Quan sát đặc điểm hình thái vi sinh vật: nấm men, vi khuẩn, nấm mốc • Làm quen biết cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật... lượng vi sinh vật mẫu Hiện có nhiều phương pháp vừa để định lượng vi sinh vật canh trường lên men nhằm mục đích theo dõi sinh trưởng vi sinh vật q trình ni cấy Có phương pháp định lượng vi sinh. .. hiển vi Kích thước vi sinh vật thường đo micromet Thuật ngữ vi sinh vật không tương đương với đơn vị phân loại phân loại khoa học Nó bao gồm virus, vi khuẩn (bao gồm cổ khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh