báo cáo thí nghiệm vi sinh

Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn.  Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn.  Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. (2) Giá điều chỉnh vật kính. (3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. (4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. (6) Giá đặt mẫu vật (7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. (8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. (9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn.  Cách sử dụng kính hiển vi – Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu. – Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt. – Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống

MỤC LỤC

1

MỤC LỤC HÌNH

BÀI 1: QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT

BẰNG KÍNH HIỂN VI

1 MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

• Quan sát đặc điểm hình thái của vi sinh vật: nấm men, vi khuẩn, nấm mốc

• Làm quen và biết cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật

• Biết làm tiêu bản vi sinh vật để quan sát dưới kính hiển vi

2 SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

2.1 Giới thiệu về vi sinh vật

Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhân sơ hoặc nhân thực có kíchthước rất nhỏ, không quan sát được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi Kíchthước vi sinh vật thường được đo bằng micromet Thuật ngữ vi sinh vật không tươngđương với bất kỳ đơn vị phân loại nào trong phân loại khoa học Nó bao gồm cả virus, vikhuẩn (bao gồm cả cổ khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật

2.2 Giới thiệu về kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát

hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thủy tinh Kínhhiển vi quang học là dạng kính hiển vi đơn giản, lâu đời nhất và cũng là phổ biến nhất

Hình 1.1 Kính hiển vi quang học

– Cấu tạo của kính hiển vi quang học:

3

(1) Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng

của vật qua hệ quang học Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, vàđược lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng

(2) Giá điều chỉnh vật kính

(3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một

(hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóngđại lớn Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị sốphóng đại Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x hay100x Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giảicủa hệ thống

(4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quátrình tạo ảnh

(6) Giá đặt mẫu vật

(7) Hệ thống đèn, gương tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật

(8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song songchiếu qua mẫu vật

(9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phầnkhác nhau theo ý muốn

 Cách sử dụng kính hiển vi

– Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu

– Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm, dùng kẹp giữtiêu bản Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào gương,làm như vậy dễ bị hỏng mắt

– Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiềukim đồng hồ (vặn xuống) cho đến khi vật kính gần sát lá kính của tiêu bản

– Mắt nhìn vào thấu kính, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều ngược lại (vặn lên)cho đến khi nhìn thấy vật cần quan sát

3 CÁCH TIẾN HÀNH

+ Ngâm phiến kính và lam kính trong petri chứa cồn 70°

+ Lấy phiến kính ra, lau khô bằng giấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn

+ Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt nước vô khuẩn nhỏ lên phiến kính

+ Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau đó lấy một phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên quecấy

+ Trộn đều vi sinh vật trên que cấy vào giọt nước và dàn mỏng giọt nước trên phiếnkính

+ Lấy lam kính lau khô bằng giấy và hơ nhẹ lướt qua ngọn lửa đèn cồn, sau đó đậylên phiến kính để cố định vi sinh vật quan sát

+ Dùng giấy thấm xung quanh, đảm bảo xung quanh lam kính khô

+ Quan sát hình thái nấm men, vi khuẩn, nấm mốc dưới kính hiển vi

4 KẾT QUẢ NHẬN XÉT

Hình 1.1 Nấm men

5

Hình 1.2 Nấm sợi Penicillium

 Nhận xét:

- Quan sát được đặc điểm của nấm men qua kính hiển vi: hình cầu

- Đặc điểm của nấm mốc Penicillium: chuỗi đính bào tử, phân nhánh, có vách ngăn

- Thời gian điều chỉnh kính hiển vi để quan sát rõ nét còn lâu

5 ỨNG DỤNG

– Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật

– Nhận định sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần khảo sát: có hay không

– Quan sát, nhận biết được sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật

BÀI 2: QUAN SÁT NẤM MEN

1 MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

• Đánh giá canh trường nấm men, tỷ lệ nảy chồi và tỷ lệ sống chết

• Quan sát số lượng và chất lượng nấm men

2 SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

2.1 Khái quát về nấm men

Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong công nghiệp, hầu hết nấmmen là đơn bào, không chuyển động Hình dạng và kích thước của chúng thay đổi tùyđiều kiện môi trường Nói chung nấm men có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục,…

có kích thước tương đối lớn, chiều dài từ 6 – 10μm có khi 12 - 18μm, có chiều ngang từ 4

- 8 μm

Về cấu tạo tế bào, gồm thành tế bào và tế bào chất Trong tế bào chất có nhiều cơquan con khác nhau, không bào và các chất chứa đựng khác như: glycogen, granuloza,chất béo, volutin,…

Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi, phân chia hoặc tạo thành bào tử hữu tính.Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau:

+ Ở nấm men trẻ (qua 12 – 16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất,không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao

+ Ở nấm men trưởng thành (24 – 48 giờ): kích thước điển hình, không bào lớn, sốkhông bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao

+ Ở nấm men già (đã nuôi cấy từ 72 giờ trở lên): màng dày nhẵn, tế bào chất khôngđồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa,không có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn

 Nguyên tắc quan sát nấm men sống và chết:

• Tế bào chất chết dễ bắt màu

• Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng tế bào sống

 Vì vậy ta có thể dùng xanh methylene để nhuộm phân biệt sống và chết

 Quan sát lượng nấm men nảy chồi:

• Đây là một việc làm quan trọng khi đánh giá chất lượng canh trường nấm men để cho vàothùng lên men

• Trong canh trường nấm men cho vào thùng lên men, lượng tế bào đang nảy chồi ít nhấtphải chiếm từ 10-15%

• Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh sản mạnh, số tế bào nảy chồi có thể đạt đến 80%

70-2.2 Phương pháp đếm số tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm:

• Phạm vi áp dụng: đếm một số loài nấm men và vi khuẩn

• Mục đích: theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các quá trình lên men thực hiệntrên môi trường lỏng

• Cấu tạo buồng đếm:

7

+ Buồng đếm là một phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật.

+ Trên bề mặt buồng đếm, có đục 4 rãnh song song với chiều rộng và chia bề mặtthành 3 khoang chính A, B, và C Chiều cao của hai khoang A, C là như nhau Khoanggiữa B thấp hơn hai khoang bên A và C một đoạn h Giá trị h được gọi là chiều cao củabuồng đếm

+ Khoang B được chia tiếp thành 2 khoang nhỏ B1 và B2 nhờ một rãnh đục song songvới chiều dài của bề mặt buồng đếm

+ Trên mỗi khoang nhỏ, người ta kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình vuông hoặchình chữ nhật Một ô lớn được chia tiếp thành các ô nhỏ hơn

+ Buồng điếm có kèm theo lá kính để đậy Lá kính có bề mặt hình vuông và rất phẳng

3.2.Quan sát lượng nấm men nảy chồi

-Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kínhtrộn đều, đậy lá kính lại, đặt lên kính hiển vi quan sát Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy chồi rồi suy ra phần trăm

-Tế bào được xem là đang nảy chồi, tức là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng

½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ thì phải tính hai tế bào

3.3.Quan sát tỷ lệ sống chết

-Chuẩn bị xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu

-Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2

-Làm tiêu bản

-Nhuộm màu trước khi ép lamen mỏng lên lam kính

-Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men

-Đem tiêu bản đi quan sát dưới kính hiển vi tại 5 điểm khác nhau

3.4.Đánh giá nhiễm vi sinh vật của canh trường:

Trong khi thực hiện thí nghiệm 1 và 2, quan sát xem canh trường có bị nhiễm VSV lạ haykhông

3.5.Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường (dùng buồng đếm Thomas):

-Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 70o

-Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2

-Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên buồng đếm, dùng giấythấm, sau đó tiến hành quan sát bằng kính hiển vi, đếm tổng số tế bào trong 10 ô vuông lớn của buồng đếm

4 KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

 Quan sát nấm men nảy chồi

Hình 2.1 Quan sát nấm men nảy chồi

Bảng 1: Tổng số nấm men và tế bào này chồi

Hình 2.2 Quan sát tế bào nấm men sống và chếtBảng 2: Tổng số nấm men và số tế bào chết

A F N

h S

Với A: số tế bào trung bình trong một ô đếm

h: chiều cao buồng đếm (mm)

S: diện tích một ô đếm (mm2)

1000: Hệ số chuyển đổi từ mm3 sang cm3

F: Hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm

Ví dụ buồng đếm Thoma có h = 0,1mm; S = (1/250)mm2 nên số tế bào có trong 1ml mẫu ban đầu là:

= 1000 = 25.10 5

10,1250

0,1250

N

(tế bào/ml)– Nhận xét:

 Đánh giá canh trường (chất lượng nấm men):

+ Canh trường không bị nhiễm, bị mốc

 Quan sát nấm men nảy chồi:

+ Hình dạng nấm men là hình cầu

+ Tỷ lệ nấm men nảy chồi thấp

+ Tỷ lệ nảy chồi thấp (<15%), chưa đạt mức cho phép để lên men, tỷ lệ nảy chồi

70-80% là thích hợp nhất cho quá trình lên men

 Xác định số lượng nấm men trong 1ml canh trường bằng buồng đếm:

+ Một số tế bào có thể chồng lên nhau, kết quả đếm không chính xác do có thể đếm bịtrùng hay bỏ sót

+ Ưu điểm: nhanh chóng, đơn giản.

+ Nhược điểm:

 Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

 Chỉ thích hợp với tế bào có kích thược lớn (nấm men, nấm mốc)

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được cho vào quá trình lên men, khi đó nấm

men sẽ chuyển hóa đường có trong bột mì thành rượu và CO2 Chính CO2 là tác nhân làmbánh mì nở, tạo độ xốp

11

Hình 2.3.Men bánh mì

Ngoài ra nấm men này cũng được sử dụng rộng rãi trong việc làm những sảnphẩm từ bột mì khác như bánh bao, pizza,…Vegemite và Marmite, những chiết xuất nấmmen, đã được sử dụng rộng rãi làm gia vị để chế biến thức ăn trong đời sống

 Ứng dụng trong sản xuất đồ uống có cồn:

-Saccharomyces cerevisiae kết hợp với vi khuẩn butyric tạo ra hương thơm mạnh

và đặc trưng trong sản xuất rượu Rum

-Lên men rượu vang: saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invectara có khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy, trong quá trình lên men, ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với những nòi của men này chỉ đạt khoảng 8- 10 % thể tích

Ngoài ra, nấm men và vi khuẩn acetic được sử dụng trong quá trình chuẩn bị Kombucha, một loại trà ngọt lên men

Hình 2.4.Men rượu

BÀI 3: QUAN SÁT VI KHUẨN

1 MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

- Mô tả và phân biệt được đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý của vi khuẩn, nhận biết được từng loại vi khuẩn

- Rèn luyện kỹ năng sử dụng kính hiển vi

- Thông thạo thao tác làm tiêu bản giọt treo, giọt ép, phương pháp nhuộm gram

2 SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn

Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân phức tạp, thuộcnhóm Prokaryotes Nhân tế bào chỉ gồm một chuỗi ADN không có thành phần protein không cómàng nhân

Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy, hìnhsợi Kích thước thay đổi tuỳ theo các loại hình và trong một loại hình kích thước cũng khácnhau So với virus, kích thước của vi khuẩn lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dưới kínhhiển vi quang học Dựa vào loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:

Cầu khuẩn là loại vi khuẩn có hình cầu Nhưng có nhiều loại không hẳn hình cầu thí

dụ như hình ngọn nến như phế cầu khuẩn - Diplococcus pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu

cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae)

Kích thước của vi khuẩn thường thay đổi trong khoảng 0,5 (1μ = 10-3 mm) Tuỳ theotừng loài mà chúng có những dạng khác nhau

Đặc tính chung của cầu khuẩn:

- Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau

- Có nhiều loài có khả năng gây bệnh cho người và gia súc

- Không có cơ quan di động

- Không tạo thành bào tử

 Giống Streptococcus

Từ tiếng Hy Lạp (Streptos - chuỗi) chúng phân cách theo một mặt phẳng xác định

và dính với nhau thành từng chuỗi một dài

 Giống Staphilococcus

Từ tiếng Hy Lạp Staphile - chùm nho Thường chúng liên kết với nhau thànhnhững đám trông như chùm nho Chúng phân cách theo một mặt phẳng bất kỳ và sau đódính lại với nhau thành từng đám như hình chùm nho Bên cạnh các loài hoại sinh còn cómột số loài gây bệnh ở người và động vật

Trực khuẩn là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que Kích thước của chúng

thường từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 μ Thường gặp các loài trực khuẩn sau đây:

Bacillus (viết tắt là Bac) trực khuẩn gram dương, sinh bào tử Chiều ngang của bào tửkhông vượt quá chiều ngang của tế bào Vì thế khi tạo thành bào tử tế bào không thay đổihình dạng chúng thường thuộc loài hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc

Vi khuẩn lactic: Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu,

và dạng que, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩnlactic thuộc dạng yếu Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Đểsinh trưởng bình thường, ngoài nguồn carbon, chúng cần nitơ một phần dưới dạng cácacid amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

Lactobacillus là vi khuẩn gram dương, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng tạo acid lactic,

có thể lên men đồng hình hoặc dị hình, catalase âm tính và có khả năng lên men glucose

2.2 Chuẩn bị tiêu bản và cố định vi khuẩn trên phiến kính:

- Quá trình cố định vi khuẩn bằng nhiệt hoặc bằng dung môi sẽ giúp ngăn chặn sự

tự thủy phân của vi khuẩn, làm thay đổi hình dạng của tế bào Mặt khác cũng giúp

tế bào vi khuẩn bám chặt vào phiến kính không bị rửa trôi

- Làm tiêu bản giọt ép: là phương pháp đơn giản nhất quan sát trực tiếp sự chuyểnđộng của vi khuẩn

- Làm tiêu bản giọt treo: để quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi trong thời gian lâuhơn

15

2.3 Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp nhuộm này sử dụng hai màu khác nhau, dùng để phân biệt tế bào vikhuẩn Gram âm G- và vi khuẩn Gram dương G+ Vi khuẩn G+ có thành tế bào dày, baogồm nhiều lớp peptidoglycan Vi khuẩn G- có lớp peptidoglycan mỏng và lớp lipopoly-saccharide

Trong phương pháp nhuộm Gram, tím tinh thể được sử dụng như màu thứ nhất.Tím tinh thể cũng là màu bazo, làm cho tất cả các tế bào vi khuẩn trên tiêu bản bắt màu.Iod là chất cẩn màu, có khả năng tạo phức chất với tím tinh thể Phức chất này không tantrong tế bào vi khuẩn , do đó làm cho tế bào bắt màu rõ hơn Ethanol được dùng trongbước tiếp theo để tẩy màu khỏi tế bào G-, trong khi tế bào G+ vẫn giữ màu Sau đó tế bào

G- được nhuộm lại bằng màu thứ 2 thường là safranin Khi quan sát dưới kính hiển vi, tếbào G+ có màu tím của tím tinh thể, còn tế bào G- sẽ có màu đỏ của safranin

Một số lỗi hay gặp khi nhuộm Gram:

+ Hơ nóng khi cố định vi khuẩn lên phiến kính có thể làm vỡ tế bào, từ đó màucủa tế bào G+ có thể bị rửa trôi làm cho tế bào G+ trở thành G-

+ Lớp tế bào trên phiến kính quá dày làm cho quá trình nhuộm màu không tốt hayquá trình tẩy màu bằng ethanol không tốt, từ đó tế bào G- có thể xuất hiện như tế bào G+

+ Bước tẩy màu bằng ethanol là quan trọng: nếu thời gian tẩy màu quá ngắn sẽlàm cho vi khuẩn G- được thể hiện như vi khuẩn G+ Nếu thời gian quá dài thì ngược lại,

tế bào G+ sẽ có màu của tế bào G-

+ Tế bào già thường không bắt màu chính xác Cần phải nhuộm màu tế bào chưatới 24 giờ nuôi cấy

3 Cách tiến hành

 Nguyên vật liệu và thuốc nhuộm:

- Cầu khuẩn: Streptococus thermophillus, Staphylococus aureus

- Trực khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, E.Coli

- Lactic: Lactic casein, Lactic acidophillus

- Hơ nóng đỏ que cấy, làm nguội dùng để lấy môi trường chứa vi khuẩn

- Đối với môi trường lỏng chứa vi khuẩn đã pha loãng

+ Dùng que cấy lấy và dàn đều môi trường lỏng chứa vi khuẩn đó lên phiếnkính (Tiến hành lấy mẫu gần đèn cồn)

- Đối với môi trường rắn chứa vi khuẩn chưa pha loãng

+ Nhỏ một giọt nước vô khuẩn lên phiến kính

+ Dùng que cấy lấy và dàn đều mẫu cùng với nước vô khuẩn trên phiến kính

- Lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho không tạo thành bọt khí giữa lamkính và phiến kính.

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi

 Làm tiêu bản giọt treo

- Ngâm phiến kính lõm và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên ngọn lửađèn cồn

- Hơ nóng đỏ que cấy, làm nguội dùng để lấy môi trường chứa vi khuẩn

- Bôi vaselin lên bốn góc của lam kính

- Lắc dung dịch có vi khuẩn và lấy hai đầu que cấy đầy dịch lên lam kính

- Đặt phiến kính lên lam kính

- Lật ngược phiến kính nhanh sao cho giọt dung dịch không chảy ra ngoài

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi từ độ phóng đại nhỏ nhất

3.2 Nhuộm Gram và quan sát

 Đối với E.Coli và Bacillus subtilis

- Chuẩn bị tiêu bản cố định vi khuẩn

+ Ngâm phiến kính và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên ngọn lửa đèncồn

+ Dùng que cấy sau khi đã hơ nóng đỏ và làm nguội để lấy mẫu dần mỏng trênphiến kính

+ Để khô, cố định bằng nhiệt (hơ sơ trên ngọn lửa đèn cồn)

- Nhỏ vài giọt tím tinh thể lên tiêu bản và để trong vòng 1 phút

- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây

- Nhỏ vài giọt dung dịch lugol lên tiêu bản và để trong vòng 10 giây

- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây

- Nhỏ ethanol lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây

- Nghiêng tiêu bản và rửa trôi lại bằng nước

- Nhỏ safranin lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây

- Rửa lại bằng nước, để khô , lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho không tạobọt khí giữa lam kính và phiến kính

- Quan sát dưới kính hiển vi

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), đơn lẻ hoặc

thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động

Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương Trực khuẩn đầu vuông, hình que, có thành tếbào dày đứng riêng lẻ hoặc chụm lại thành từng chùm

E coli là trực khuẩn Gram (-),vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ, có hình que, thường

đứng riêng rẽ, có thể từng đôi hoặc chuỗi ngắn, có khả năng di động

Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram dương, hình que, đứng riêng lẻ hay tập

trung thành sợi ngắn

17

Lactobacillus casein là vi khuẩn Gram dương, trực khuẩn nhỏ, hình que có kích thước

rất ngắn Chúng có thể tạo thành chuỗi, không chuyển động

 Một số hình ảnh tham khảo và quan sát được:

Hình 3 Staphiloccocus aureus

Hình 4 Streptococus thermoffillus

Hình 5 Bacillus cereus

Hình 6 E.Coli

19

Hình 7 E.Coli nhuộm màu

Hình 8 Bacillus subtilis

Bacillus cereus, phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay

trữ lạnh lâu thường gây ngộ độc thực phẩm Staphyloccocus aureus cư trú trên người và độngvật, có trong sữa bò bị bệnh, thịt heo tươi, vết thương mưng mủ…

21

Ngày nay với những thành tựu của khoa học hiện đại, người ta đã tìm ra những biệnpháp hạn chế tác hại do vi khuẩn gây ra, ví dụ như việc chế vacxin phòng bệnh, sử dụngchất kháng sinh,…

Bên cạnh đó, có một số vi khuẩn có lợi và có ứng dụng nhiều các lĩnh vực thhuwcjphẩm, y học, công nghệ,

5.1 Streptococus thermophillus

– Ứng dụng trong lên men sữa, sản xuất sữa chua, sản xuất phô mai

5.2 Bacillus subtilis

– Ứng dụng hữu ích trong môi trường

– Sản xuất enzyme sử dụng làm chất phụ gia trong chất tẩy rửa giặt ủi

– Có hoạt động tự nhiên diệt nấm, được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinhhọc

– Như một tác nhân để hỗ trợ điều trị các bệnh đường tiêu hóa và tiết niệu sử dụngrộng rãi ở Tây Âu và Trung Đông như một loại thuốc thay thế kháng sinh

– Có thể chuyển đổi một số vật liệu nổ thành các hợp chất nito vô hại, carbondioxide và nước

– Xử lý chất thải hạt nhân phóng xạ an toàn (ví dụ như thỏi IV và plutonium IV)

– Được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chất thải mạchnha

– Sử dụng để sản xuất amylase

– Sử dụng để sản xuất axit hyaluronic trong khu vực công ty chăm sóc y tế

– Có thể cung cấp một số lợi ích cho người trồng nghệ tây, đẩy mạnh tăng trưởng vàtăng năng suất sinh khối

– Ứng dụng trong chăn nuôi, trong nuôi trồng thủy sản

5.3 E.Coli

– Một số chủng của vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa đường trong thực vật thành

dẫn xuất axít béo, chất thường được dùng để sản xuất nhiên liệu

– E coli cùng các vi khuẩn khác trong hệ vi khuẩn chí đường ruột góp phần vào

nhiều chức năng quan trọng trong sự sống của con người

+ Ngăn chặn sự tấn công của các vi khuẩn xâm nhập vào hệ tiêu hóa

+ Kích thích hệ miễn dịch của cơ thể

+ Sản xuất các chất có lợi cho cơ thể, ví dụ vitamin K, biotin, folate

+ Giúp chuyển hóa các chất đường

– Sản xuất insulin

– Tuy vậy, một khi vì lý do gì đó chúng bị lạc vào chỗ khác ngoài hệ tiêu hóa thì

chúng có thể gây bệnh Ví dụ E coli gây bệnh nhiễm trùng tiểu, bệnh viêm màng

não…Một số E.Coli gây bệnh đường ruột như tiêu chảy ra máu

5.4 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casein

– Thường được bổ sung vào các chế phẩm lên men từ sữa trong công nghiệp sảnxuất các loại enzymeamylase (một enzyme phân giải carbohydrate), từ công dụngnày chúng thường được gọi là lợi khuẩn (vi khuẩn có lợi)

– Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose Không lên men đượcmannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xyloseo

– Giúp cho việc sinh ra hay hấp thu vitamin B (folic acid,niacin), giúp giảmcholesterol trong máu và giải được một số độc tố

– Sinh ra một số chất kháng sinh mạnh trong ruột bao gồm acidophilin, acidolin,lactocidin và bacteriocin giúp ngăn chặn khả năng sinh trưởng của một số loài vi

sinh vật gây bệnh như Campylobacter listeria và Staphylococci

– Sinh enzyme lactase giúp phân giải đường sữa Làm giảm sự phát triển của các ubướu, có khả năng trung hòa hiệu quả và ngăn chặn các chất gây ung thư Làmgiảm cholesterol trong máu

– Là một loại lợi khuẩn được ứng dụng vào chế phẩm sinh học Dùng để sản xuấtmen và chất diệt khuẩn lactocidin, ức chế sinh trưởng số lượng vi khuẩn gây bệnhđường ruột cho vật nuôi Tăng cường kháng sinh tự nhiên và hệ miễn dịch đườngruột

23

BÀI 4: QUAN SÁT NẤM MỐC

1 MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

• Ôn lại và nắm vững đặc điểm hình thái của các loại nấm mốc

• Quan sát hình thái khuẩn ty, bào tử của nấm mốc

• Phân biệt được các loại nấm mốc trong bài thí nghiệm

2 SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

Nấm sợi thường được nhận diện bằng cách hình thái đặc trưng quan sát được dướikính hiển vi Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể:

 Khuẩn ty cơ chất

– Bào tử tiếp hợp hay không tiếp hợp

– Bào tử kín hay trần, to hay nhỏ, dày hay mỏng, đầu phình to hay không

– Có rễ chùm hay không có rễ chùm

 Khuẩn ty ký sinh

– Khuẩn ty phân nhánh hay không phân nhánh, nhiều hay ít

– Có vách ngăn hay không có vách ngăn

Hai giống nấm Aspergillus và Penicillium thuộc lớp nấm bất hoàn Deuteromycetes,

không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn Bào tử vô tính là bào tử trần

Mucor và Rhizopus thuộc lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes Hệ sợi không có vách

ngăn và có thể có rễ giả Bào tử vô tính là bào tử kín Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp

Rhizopus có cuống mang bào tử không phân nhánh Mucor có cuống bào tử phân nhánh.

3 CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

 Nguyên liệu: Nấm sợi: Mucor sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.

 Cách tiến hành

– Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên hộp petri

– Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi

4 KẾT QUẢ, NHẬN XÉT

 Mucor sp.

– Bào tử kín, đơn bào

– Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn

Hình 11 Nấm mốc Mucor quan sát dưới kính hiển vi

 Rhizopus sp.

– Bào tử kín, đơn bào

– Khuẩn ty không phân nhánh, không có vách ngăn

– Có rễ giả

25