THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài 1: Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn Bài 2: Một số phương pháp định tính và định lượng DNA thô Bài 3: Thiết lập phản ứng PCR Bài 4: Tách chiết plasmid Kế hoạch

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

־־־־־־־־־******־־־־־־־־־־־

GIÁO TRÌNH

THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINH

HỌC PHÂN TỬ

Người soạn: Ths.PHẠM THỊ KIM THẢO

Đà Nẵng, 2016

NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài 1: Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn

Bài 2: Một số phương pháp định tính và định lượng DNA thô

Bài 3: Thiết lập phản ứng PCR

Bài 4: Tách chiết plasmid

Kế hoạch thí nghiệm (5 buổi)

YÊU CẦU THÍ NGHIỆM

Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm

KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM

Buổi 1

Kiểm tra Làm quen với các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sinh học phân tử, Chuẩn bị hóa

chất, môi trường, nuôi cấy vi khuẩn

Buổi 2 (Bài 1)

Kiểm tra Tiến hành tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn

Buổi 3: (Bài 1 phần còn lại và Bài 2)

Nhận xét buổi làm thứ 2, và thực hành bài số 2

Buổi 4:

Làm bài 3 (thiết lập phản ứng PCR) và bài 4

YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM SHPT

1 Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm

- Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm

- Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bị dành riêng cho mình Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn Tuyệt đối không lấy của người khác

- Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc áo Blue khi làm việc

- Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn

- Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọn gàng nơi làm việc

- Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn

Tiến hành ghi chép thí nghiệm:

Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định

Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc

2/ Đối tượng nghiên cứu

3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm

4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng

5/Kết quả nhận được

Các số liệu phải ghi thành từng bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình

vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ

CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỪ

1 Micropipettes đơn kênh (Pipetman)

Đặc điểm cấu tạo :

Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) và các tip tương ứng

- Đặc điểm phân loại:

Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành 6 loại:

Bảng 1.1: Các loại pipetman và thể tích tương ứng

Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích

Chú ý:

- Cắm đúng loại tip của từng pipet (tương ứng với thể tích cần hút)

- Không dốc ngược pipetman khi đang hút hóa chất

- Không được chỉnh quá giới hạn thể tích qui định trên thân pipet

- Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet về trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhất hoặc nhỏ nhất )

STT Loại pipet Giới hạn sử dụng (l) Độ chia nhỏ nhất(l)

BÀI 1: TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN

Nguyên tắc chung: Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu

nhận một lượng acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Yêu cầu của kĩ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận được phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Các acid nucleic cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase, Rnase)

Qui trình tách chiết acid nucleic (DNA, RNA) thường gồm 3 bước chính sau:

1 Phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)

Có thể phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)bằng phương pháp hóa học, vật lí hoặc cơ học Đối với phương pháp hóa học, thường sử dụng các chất tẩy như SDS (Sodium dodecyl sulfat), Triton X 100 với nồng độ thích hợp Đối với phương pháp vật lí, người ta thường sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào Đối với các mẫu mô thực vật, động vật, trước tiên cần sử dụng phương pháp cơ học như xay, nghiền trong nitơ lỏng để thu nhận các tế bào đơn

2 Loại bỏ protein

Để thu nhận acid nucleic (DNA, RNA) cần phải loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là protein Ở đây thường dùng hỗn hợp gồm phenol, chloroform và

isoamylalcohol theo tỉ lệ thể tích 25:24:1 Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa tan nucleic acid Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại

bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa DNA Isoamylalcohol giúp ổn định giữa hai pha nước và pha chloroform

Trong các phương tách chiết DNA thì phương pháp sử dụng phenol: chloroform là phương pháp cơ bản Ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 °C) nhưng khi lẫn với khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phân

tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị nước nên

có khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết quả làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị nước (của gốc amino acid) ra ngoài Các nhóm kị nước này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước, dựa vào tính chất này có thể phân tách DNA và protein nhờ vào kĩ thuật li tâm

3 Tủa nucleic acid

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo

vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo các nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông thường là:

- Tủa trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng

độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol:1 thể tích mẫu), nhiệt độ thấp thuận lợi cho việc tủa

- Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện

diện của muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu = 0,8-1

Thực hành tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩn

A VẬT LIỆU

Dịch tế bào vi khuẩn bacillus subtilic

B DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl

- Pipet thủy tinh

- Eppendorf loại 1,5 ml

- Máy li tâm lạnh

- Máy vortex (lắc rung)

C HÓA CHẤT

- Dung dịch TE 10X

+ Tris pH 8.0 100mM + EDTA 50mM

- Dung dịch NaCl 0,5 M

- Dung dịch Phenol:Chloroform (1:1)

- Dung dịch Chloroform

- Dung dịch Ethanol tuyệt đối

- Dung dịch Ethanol 70%

D CÁCH TIẾN HÀNH

- Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút

Thu cặn tủa

- Hòa cặn tủa trong 500 µl dung dịch TE 1X, bổ sung thêm 50 µl NaCl 0,5 M và 50 µl SDS

10 % Huyền phù nhẹ nhàng Ủ hỗn hợp ở 650C trong 10 phút Chuyển hỗn hợp sang ủ trên đá trong 5 phút

- Thêm một thể tích dung dịch phenol:chloroform vào hỗn hợp trên Lắc mạnh bằng vortex

trong 30 giây

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nước

có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác

- Thêm một thể tích dung dịch chloroform, Lắc mạnh bằng vortex trong 30 giây

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nước

có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác

- Thêm 50 µl dung dịch NaCl 0,5M Bổ sung 2-2,5 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh (hoặc 0,8-1 thể tích isopropanol) Ủ ở -200C trong 1-2 giờ

- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C Thu cặn tủa

- Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, ở

40C Thu cặn tủa Để khô

- Hòa tủa trong dung dịch TE 1X, bảo quản dịch DNA ở -200C

Yêu cầu: SV nắm được nguyên tắc và ý nghĩa của các bước trong qui trình tách chiết DNA

Câu hỏi: Nêu mục đích của các bước trong qui trình tách chiết DNA được sử dụng trong bài thực

hành

BÀI 2: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ

ĐỊNH LƯỢNG THÔ DNA

Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang, điện di, sắc kí…Trong bài thực hành này, chúng ta tiến hành định lượng bằng quang phổ kế và điện di để kiểm tra độ tinh sạch cũng như xác định hàm lượng DNA đã thu nhận được trong bài 1

2.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế

Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid (DNA, RNA) có trong mẫu Nguyên tắc của phương pháp này như sau: đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260 nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230 nm-240 nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260

nm Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm

Nồng độ acid nucleic trong mẫu được xác định dựa vào tương quan như sau:

Một đơn vị OD 260nm tương ứng với một nồng độ là:

- 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi

- 40 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đơn hoặc RNA

- 20 µg/ml cho một dung dịch oligonucleotide

Khi tính toán nồng độ dung dịch acid nucleic cần chú ý độ pha loãng của dung dịch Cách tính này chỉ đúng với các dung dịch acid nucleic sạch

Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn phenol và protein Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm Được tính bằng công thức sau:

Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch acid nucleic được xem là tinh sạch (không tạp nhiễm protein)

❖ Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)

Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm của DNA tăng lên khi DNA biến tính tức

là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau DNA không bền đối với nhiệt Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính

Thực hành xác định nồng độ dung dịch DNA

A Vật liệu

Dung dịch DNA thu được ở bài 1

B Dụng cụ - thiết bị

- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl

- Cuvet thủy tinh

- Eppendorf loại 1,5 ml

- Máy đo quang phổ UV-VIS

C Hóa chất

- Dung dịch TE 1X (để pha loãng mẫu)

D Cách tiến hành

Xác định độ tinh sạch và nồng độ dung dịch DNA

- Hút 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 80 µl dung dịch TE 1X

- Tiến hành đo giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD 260) và 280 nm

- Ghi nhận kết quả, tính nồng độ ban đầu của dung dịch DNA

Quan sát hiện tượng siêu sắc

- Lấy toàn bộ dung dịch DNA ở trên cho vào một eppendorf sạch Đun ở 1000C trong 10 phút rồi nhanh chóng làm lạnh trên đá trong 5 phút

- Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch DNA vừa biến tính ở bước sóng 260 nm (OD

260 *)

- So sánh giá trị OD 260 ban đầu và OD 260 của dung dịch DNA sau biến tính

2.2 Phương pháp điện di

Phương pháp này được sử dụng trong phân tích định tính và trong việc thu nhận mẫu acid nucleic

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động một điện trường, chúng

sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính linh động của các phân tử acid nucleic phụ thuộc vào hai yếu tố chính: khối lượng phân tử và nồng độ các chất thành gel Ngoài ra, cấu hình của phân tử cũng ảnh hưởng đến khả năng di động

Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu acid nucleic là gel polyacrylamide và gel agarose Việc lựa chọn gel cũng như nồng độ của chất cấu thành gel phụ thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn acid nucleic cần phân tách

Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tiến hành điện di trên gel agarose Đây là loại gel thông dụng nhất, thao tác đơn giản, có thể phân tách được những đoạn có kích thước trong khoảng 0,1-20kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang

Quá trình điện di thường sử dụng một số dung dịch điện li như Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 Các dung dịch này không những thiết lập một giá trị pH thích hợp để bảo vệ cấu trúc acid nucleic trong quá trình điện di, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho quá trình dẫn điện

(conductivity)

Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được quan sát dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một chất có tên là Ethidium bromide (EtBr) Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của các acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang (màu đỏ cam) Trong bài thực hành này, EtBr sẽ được cho vào gel trước khi đổ

Ngoài ra, để ước lượng kích thước của các trình tự acid nucleic trong gel agarose, người ta

sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “, Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết trước (gọi là thang DNA)

Thực hành điện di mẫu DNA thu được

A Vật liệu

Dung dịch DNA thu được ở bài 1

Thang DNA

B Hóa chất – dụng cụ - thiết bị

Agarose 1%

Dung dịch điện di TBE 1X

Dung dịch tải mẫu

Dung dịch Ethidiume bromide 10mg/ml

Bộ điện di nằm ngang

Bộ đổ gel

C Cách tiến hành

❖ Chuẩn bị gel agarose 1%

Trong bài thực hành này, chúng ta tiến hành điện di trên gel agarose 1 % và sử dụng dung dịch điện di TBE

Cân 1g agarose, bổ sung 100 ml dung dịch TBE Đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn Để nguội và bổ sung 2 µl dung dịch EtBr 10 mg/ml Tiến hành lắp lược và đổ gel vào khuôn như hình

vẽ

Chú ý: Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến Vì thế, luôn đeo găng tay khi thao tác

- Lấy 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 5 µl dung dịch tải mẫu 5X Trộn đều

- Tiến hành nạp mẫu vào giếng như hình vẽ

- Điện di trong 30 phút, ở hiệu điện thế 90-120 V

- Quan sát kết quả dưới ánh sáng tử ngoại

Yêu cầu: Sinh viên tính toán nồng độ dung dịch DNA tách chiết được ở bài 1, đồng thời ghi nhận

lại kết quả điện di Nhận xét

Trường hợp mẫu DNA không tinh sạch thì cách xử lí như thế nào?

BÀI 3: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ

enzyme polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài mồi (primer)

nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị luân

nhiệt (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1)

3.1 Nguyên tắc của PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp

bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành các mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa vào các đặc tính của các DNA polymerase Taq

polymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus

aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại

deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai mồi (mồi xuôi và mồi ngược), trên cơ

sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần Mồi xuôi (forward primer, ký hiệu là F) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạch DNA 3’→5’ Mồi ngược (reverse primer, ký hiệu là R) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạch DNA 5’→3’ Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

- Biến tính (denaturation)

Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands) Quá trình biến tính được thực hiện ở nhiệt độ ở 94-95oC trong vòng 30 giây

-1 phút

- Bắt cặp mồi (annealing)

Trong giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng ở 40-65oC, tùy thuộc vào

Tm của mồi sử dụng

- Kéo dài (extension)

Giai đoạn này, nhiệt độ được tăng lên đến 70-72oC Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có mồi theo chiều 5’→3’ Thời gian kéo dài tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản

Hình 3.1 Máy PCR của Hãng Bio-Rad.