THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬ GIÁO TRÌNH THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Người soạn: Ths.PHẠM THỊ KIM THẢO Đà Nẵng, 2016 NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài 1: Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn Bài 2: Một số phương pháp định tính định lượng DNA thô Bài 3: Thiết lập phản ứng PCR Bài 4: Tách chiết plasmid Kế hoạch thí nghiệm (5 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM Buổi Kiểm tra Làm quen với thiết bị, dụng cụ sử dụng sinh học phân tử, Chuẩn bị hóa chất, môi trường, nuôi cấy vi khuẩn Buổi (Bài 1) Kiểm tra Tiến hành tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn Buổi 3: (Bài phần lại Bài 2) Nhận xét buổi làm thứ 2, thực hành số Buổi 4: Làm (thiết lập phản ứng PCR) YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM SHPT Quy tắc làm việc phóng thí nghiệm - Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp vệ sinh phòng thí nghiệm - Mỗi người nhóm có nơi làm việc riêng, sử dụng dụng cự thiết bị dành riêng cho Thiếu phải hỏi cán hướng dẫn Tuyệt đối không lấy người khác - Trong phòng thí nghiệm không ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… mặc áo Blue làm việc - Không tự điều chỉnh sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm chưa hướng dẫn - Sau thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm xếp gọn gàng nơi làm việc - Trước khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng cồn Tiến hành ghi chép thí nghiệm: Trong sổ phải ghi chép đầy đủ điều có liên quan đến việc hoàn thành thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng theo trật tự định Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu ngày kết thúc 2/ Đối tượng nghiên cứu 3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm 4/ Nguyên tắc phương pháp phân tích sử dụng 5/Kết nhận Các số liệu phải ghi thành bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình vẽ, ghi chép tất số liệu thực nghiệm tính toán vào sổ CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỪ Micropipettes đơn kênh (Pipetman) Đặc điểm cấu tạo : Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) tip tương ứng - Đặc điểm phân loại: Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành loại: Bảng 1.1: Các loại pipetman thể tích tương ứng STT Loại pipet P-2 P-10 P-20 P-100 P-200 P-1000 Giới hạn sử dụng (l) 0.1-2 0.5-10 2-20 10-100 50-200 100-1000 Độ chia nhỏ nhất(l) 0.002 0.02 0.2 0.2 0.2 2.0 Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích Chú ý: - Cắm loại tip pipet (tương ứng với thể tích cần hút) - Không dốc ngược pipetman hút hóa chất - Không chỉnh giới hạn thể tích qui định thân pipet - Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhỏ ) BÀI 1: TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN Nguyên tắc chung: Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử việc thu nhận lượng acid nucleic đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Yêu cầu kĩ thuật tách chiết acid nucleic thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học Các acid nucleic cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase, Rnase) Qui trình tách chiết acid nucleic (DNA, RNA) thường gồm bước sau: Phá bỏ màng tế bào (màng nhân) Có thể phá bỏ màng tế bào (màng nhân)bằng phương pháp hóa học, vật lí học Đối với phương pháp hóa học, thường sử dụng chất tẩy SDS (Sodium dodecyl sulfat), Triton X 100 với nồng độ thích hợp Đối với phương pháp vật lí, người ta thường sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào Đối với mẫu mô thực vật, động vật, trước tiên cần sử dụng phương pháp học xay, nghiền nitơ lỏng để thu nhận tế bào đơn Loại bỏ protein Để thu nhận acid nucleic (DNA, RNA) cần phải loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein Ở thường dùng hỗn hợp gồm phenol, chloroform isoamylalcohol theo tỉ lệ thể tích 25:24:1 Phenol có tác dụng làm biến tính protein không hòa tan nucleic acid Chloroform có tác dụng làm biến tính protein có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi phần dung dịch có chứa DNA Isoamylalcohol giúp ổn định hai pha nước pha chloroform Trong phương tách chiết DNA phương pháp sử dụng phenol: chloroform phương pháp Ở nhiệt độ thường phenol dạng tinh thể rắn (tan chảy 80 °C) lẫn với khoảng 20% nước (v/v) phenol dạng nhũ tương gồm phân tử phenol với phân tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp vào dịch tế bào, phân tử phenol có tính kị nước nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước protein bên cấu trúc phân tử này, kết làm protein trương phồng lên lộ xuất nhóm bên kị nước (của gốc amino acid) Các nhóm kị nước protein kết hợp với tạo thành kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác Trong DNA tiếp tục chất tan nước, dựa vào tính chất phân tách DNA protein nhờ vào kĩ thuật li tâm Tủa nucleic acid Mục đích việc tủa nhằm thu nhận acid nucleic dạng cô đặc, mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme, mặt khác để hòa tan chúng lại dung dịch theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông thường là: - Tủa ethanol: việc tủa thực môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol:1 thể tích mẫu), nhiệt độ thấp thuận lợi cho việc tủa - Tủa isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp không cần diện muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu = 0,8-1 Thực hành tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩn A VẬT LIỆU Dịch tế bào vi khuẩn bacillus subtilic B DỤNG CỤ - THIẾT BỊ - Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl - Pipet thủy tinh - Eppendorf loại 1,5 ml - Máy li tâm lạnh - Máy vortex (lắc rung) C HÓA CHẤT - Dung dịch TE 10X + Tris pH 8.0 100mM + EDTA 50mM - Dung dịch NaCl 0,5 M - Dung dịch Phenol:Chloroform (1:1) - Dung dịch Chloroform - Dung dịch Ethanol tuyệt đối - Dung dịch Ethanol 70% D CÁCH TIẾN HÀNH - Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf Ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Thu cặn tủa - Hòa cặn tủa 500 µl dung dịch TE 1X, bổ sung thêm 50 µl NaCl 0,5 M 50 µl SDS 10 % Huyền phù nhẹ nhàng Ủ hỗn hợp 650C 10 phút Chuyển hỗn hợp sang ủ đá phút - Thêm thể tích dung dịch phenol:chloroform vào hỗn hợp Lắc mạnh vortex 30 giây - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút, 40C Thu lấy phần dịch phía (là pha nước có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang eppenforf khác - Thêm thể tích dung dịch chloroform, Lắc mạnh vortex 30 giây - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút, 40C Thu lấy phần dịch phía (là pha nước có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang eppenforf khác - Thêm 50 µl dung dịch NaCl 0,5M Bổ sung 2-2,5 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh (hoặc 0,8-1 thể tích isopropanol) Ủ -200C 1-2 - Ly tâm 12000 vòng/phút, 30 phút, 40C Thu cặn tủa - Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa Ly tâm 12000 vòng/phút phút, C Thu cặn tủa Để khô - Hòa tủa dung dịch TE 1X, bảo quản dịch DNA -200C Yêu cầu: SV nắm nguyên tắc ý nghĩa bước qui trình tách chiết DNA Câu hỏi: Nêu mục đích bước qui trình tách chiết DNA sử dụng thực hành BÀI 2: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG THÔ DNA Sau thu nhận DNA dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính định lượng chúng số phương pháp đo mật độ quang, điện di, sắc kí…Trong thực hành này, tiến hành định lượng quang phổ kế điện di để kiểm tra độ tinh xác định hàm lượng DNA thu nhận 2.1 Phương pháp định lượng quang phổ kế Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid (DNA, RNA) có mẫu Nguyên tắc phương pháp sau: nucleic acid, tương tác proton electron vòng purine pyrimine mà có khả hấp thụ lớn bước sóng 260 nm vùng tử ngoại hấp thụ cực tiểu bước sóng từ 230 nm-240 nm không hấp thụ vùng có bước sóng lớn 310 nm Dựa vào tính chất mà người ta xác định hàm lượng nucleic acid phương pháp đo quang phổ hấp thụ bước sóng 260 nm Độ hấp thụ phụ thuộc vào nhân tố là: pH, nhiệt độ, cường độ ion Độ hấp thụ tăng lên môi trường acid kiềm Nồng độ acid nucleic mẫu xác định dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD 260nm tương ứng với nồng độ là: - 50 µg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi - 40 µg/ml cho dung dịch DNA sợi đơn RNA - 20 µg/ml cho dung dịch oligonucleotide Khi tính toán nồng độ dung dịch acid nucleic cần ý độ pha loãng dung dịch Cách tính với dung dịch acid nucleic Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn phenol protein Những tạp chất làm tăng độ hấp thụ bước sóng 280nm vùng tử ngoại Vì độ tinh dung dịch nucleic acid đánh giá tỉ lệ độ hấp thụ ánh sáng hai bước sóng 260nm 280nm Được tính công thức sau: Độ nucleic acid = OD260/OD280 Nếu tỉ lệ nằm khoảng 1,8 đến dung dịch acid nucleic xem tinh (không tạp nhiễm protein) ❖ Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect) Hiệu ứng siêu sắc độ hấp thụ bước sóng 260 nm DNA tăng lên DNA biến tính tức hai sợi đơn tách rời khỏi DNA không bền nhiệt Khi tăng nhiệt độ DNA lên nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) mạch đôi tách phá vỡ liên kết Hidro Nểu để nhiệt độ giảm từ từ hai sợi đơn lại bắt cặp với chúng khả bắt cặp lại làm lạnh đột ngột sau biến tính Thực hành xác định nồng độ dung dịch DNA A Vật liệu Dung dịch DNA thu B Dụng cụ - thiết bị - Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl - Cuvet thủy tinh - Eppendorf loại 1,5 ml - Máy đo quang phổ UV-VIS C Hóa chất - Dung dịch TE 1X (để pha loãng mẫu) D Cách tiến hành Xác định độ tinh nồng độ dung dịch DNA - Hút 20 µl dung dịch DNA, hòa 80 µl dung dịch TE 1X - Tiến hành đo giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm (OD 260) 280 nm - Ghi nhận kết quả, tính nồng độ ban đầu dung dịch DNA Quan sát tượng siêu sắc - Lấy toàn dung dịch DNA cho vào eppendorf Đun 100 0C 10 phút nhanh chóng làm lạnh đá phút - Tiến hành đo mật độ quang dung dịch DNA vừa biến tính bước sóng 260 nm (OD 260 *) - So sánh giá trị OD 260 ban đầu OD 260 dung dịch DNA sau biến tính 2.2 Phương pháp điện di Phương pháp sử dụng phân tích định tính việc thu nhận mẫu acid nucleic Nguyên tắc phương pháp dựa vào đặc tính cấu trúc acid nucleic Đó đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Tính linh động phân tử acid nucleic phụ thuộc vào hai yếu tố chính: khối lượng phân tử nồng độ chất thành gel Ngoài ra, cấu hình phân tử ảnh hưởng đến khả di động Hai loại gel sử dụng nghiên cứu acid nucleic gel polyacrylamide gel agarose Việc lựa chọn gel nồng độ chất cấu thành gel phụ thuộc vào kích thước trung bình đoạn acid nucleic cần phân tách Trong thực hành này, tiến hành điện di gel agarose Đây loại gel thông dụng nhất, thao tác đơn giản, phân tách đoạn có kích thước khoảng 0,1-20kb Gel đổ giá thể nằm ngang điện di thực theo phương nằm ngang Quá trình điện di thường sử dụng số dung dịch điện li Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) Tris-phosphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50 mM pH 7,57,8 Các dung dịch thiết lập giá trị pH thích hợp để bảo vệ cấu trúc acid nucleic trình điện di, mà cung cấp ion để hỗ trợ cho trình dẫn điện (conductivity) Các acid nucleic gel agarose quan sát tia tử ngoại (UV) nhờ chất có tên Ethidium bromide (EtBr) Chất có khả gắn xen vào base acid nucleic tác dụng tia tử ngoại phát huỳnh quang (màu đỏ cam) Trong thực hành này, EtBr cho vào gel trước đổ Ngoài ra, để ước lượng kích thước trình tự acid nucleic gel agarose, người ta sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “, Đó tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết trước (gọi thang DNA) Thực hành điện di mẫu DNA thu A Vật liệu Dung dịch DNA thu Thang DNA B Hóa chất – dụng cụ - thiết bị Agarose 1% Dung dịch điện di TBE 1X Dung dịch tải mẫu Dung dịch Ethidiume bromide 10mg/ml Bộ điện di nằm ngang Bộ đổ gel C Cách tiến hành ❖ Chuẩn bị gel agarose 1% Trong thực hành này, tiến hành điện di gel agarose % sử dụng dung dịch điện di TBE Cân 1g agarose, bổ sung 100 ml dung dịch TBE Đun agarose tan hoàn toàn Để nguội bổ sung µl dung dịch EtBr 10 mg/ml Tiến hành lắp lược đổ gel vào khuôn hình vẽ Chú ý: Ethidium bromide tác nhân gây đột biến Vì thế, đeo găng tay thao tác - Lấy 20 µl dung dịch DNA, hòa µl dung dịch tải mẫu 5X Trộn - Tiến hành nạp mẫu vào giếng hình vẽ - Điện di 30 phút, hiệu điện 90-120 V - Quan sát kết ánh sáng tử ngoại Yêu cầu: Sinh viên tính toán nồng độ dung dịch DNA tách chiết 1, đồng thời ghi nhận lại kết điện di Nhận xét Trường hợp mẫu DNA không tinh cách xử lí nào? BÀI 3: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase) Karl Mullis cộng phát minh năm 1985 kỹ thuật sử dụng phổ biến công nghệ sinh học đại PCR dựa sở phản ứng kéo dài mồi (primer) nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro nucleic acid đặc hiệu thiết bị luân nhiệt (thermocycler) gọi máy PCR (Hình 3.1) Hình 3.1 Máy PCR Hãng Bio-Rad 3.1 Nguyên tắc PCR Tất DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa vào đặc tính DNA polymerase Taq polymerase loại DNA polymerase chịu nhiệt (có vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) dùng để tổng hợp đoạn DNA môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP dTTP) hai mồi (mồi xuôi mồi ngược), sở khuôn mẫu đoạn DNA định biết chưa biết trình tự Các đoạn DNA hình thành lại sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói nhân lên gấp nhiều lần Mồi xuôi (forward primer, ký hiệu F) bắt cặp đặc hiệu mạch DNA 3’→5’ Mồi ngược (reverse primer, ký hiệu R) bắt cặp đặc hiệu mạch DNA 5’→3’ Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Biến tính (denaturation) Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu dạng xoắn kép tách thành hai sợi đơn (single strands) Quá trình biến tính thực nhiệt độ 94-95oC vòng 30 giây phút - Bắt cặp mồi (annealing) Trong giai đoạn này, nhiệt độ hạ thấp (thấp Tm mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ dao động khoảng 40-65oC, tùy thuộc vào Tm mồi sử dụng - Kéo dài (extension) Giai đoạn này, nhiệt độ tăng lên đến 70-72oC Đây khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA vị trí có mồi theo chiều 5’→3’ Thời gian kéo dài tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần nhân Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Hình 3.3 Các chu kỳ kỹ thuật khuếch đại PCR Một chu kì gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần, lần làm tăng gấp đôi số lượng lần trước Thực hành khuếch đại gen mã hóa enzyme cellulose vi khuẩn bacillussubtilic PCR A Vật liệu DNA mẫu tách chiết B Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bị Mồi xuôi mồi ngược: mồi nồng độ 10 pmol/μl Enzyme Taq polymerase (Fermentas) dung dịch đệm dNTP (gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Dung dịch MgCl2 Nước cất lần hấp khử trùng Các hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm) Eppendorf dùng cho phản ứng PCR Máy luân nhiệt PCR (Bio-Rad) Hệ thống điện di nằm ngang C Cách tiến hành Trong thực hành này, tiến hành nhân gen từ DNA gen bacillus subtilic thu nhận Gen có kích thước khoảng 750 bp Mỗi nhóm tiến hành thiết lập phản ứng PCR (thể tích V= 25 µl) sau: Nước cất lần 11,5 µl Dung dịch đệm 2,5 µl MgCl2 µl dNTP 2,5 µl Dịch DNA µl Mồi xuôi µl Mồi ngược µl Taq polymerase 0,5 µl +Chu kì nhiệt 950C - phút 950C - phút 550C - 30 giây 720C - phút 720C - phút 30 chu kì Điện di kiểm tra sản phẩm sau phản ứng PCR-Điện di gel Agarose (1 %) Tiến hành tương tự Yêu cầu: Mỗi nhóm dựa vào kết điện di, xác định kích thước sản phẩm PCR nhóm Vẽ lại kết điện di Nhận xét kết BÀI 4: TÁCH CHIẾT PLASMID Hiện tại, có phương pháp thường dùng để tách DNA plasmid khỏi vi khuẩn (thường E coli): - Phương pháp thuỷ phân kiềm - Phương pháp đun sôi - Phương pháp dùng Lithium Việc chọn phương pháp tuỳ thuộc vào điều kiện thí nghiệm mục đích nghiên cứu Trong thực nghiệm phương pháp cho hàm lượng chất lượng DNA tốt, đảm bảo cho thí nghiệm Cả phương pháp liên quan đến việc thu nhận DNA plasmid mạch vòng từ hỗn hợp lẫn tạp với DNA genome mạch thẳng Việc xử lý base hay chất tẩy với mục đích phá huỷ mối liên kết cặp base (của DNA) làm cho DNA genome mặch thẳng bị biến tính dễ dàng loại bỏ ly tâm Trong đó, DNA plasmid dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu điều kiện hồi tính 1- Phương pháp thuỷ phân kiềm (alkaline lysis) Vi khuẩn bị dung giải (lysis) xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) NaOH Trong đó, SDS làm biến tính protein – phá vỡ màng tế bào NaOH (nằm Sol II) làm biến tính DNA genome DNA plasmid Sau đó, hỗn hợp trung hoà potassium acetate (CH3COOK) (nằm Sol III) Khi dung dịch dung hoà DNA plasmid vòng hồi tính nhanh chóng hoà tan vào dung dịch Ngược lại, DNA genome protein khác bị kết tủa “vướng” vào phức hợp SDS-kali, sau loại bỏ ly tâm Chú ý: Phản ứng cắt enzyme không tốt DNA bị lẫn NaOH/SDS kali acetate, cần phải rửa tủa cẩn thận cồn 70% 2- Phương pháp đun sôi (boiling) Vi khuẩn có chứa DNA plasmid phá vỡ lysozyme, Triton-X100 (một chất tẩy phi ion – nonionic detergent) nhiệt độ DNA genome bám vào màng tế bào vi khuẩn loại bỏ ly tâm Trong đó, DNA plasmid giải phóng hoà tan vào dung dịch thu nhận cách tủa với alcohol Chú ý: Phương pháp nhanh chất lượng DNA thấp so với phương pháp thuỷ phân kiềm 3- Phương pháp dựa vào Lithium Khi xử lý với hỗn hợp Triton X-100/LiCl có màng (inner plasma membrane) tế bào vi khuẩn bị phân huỷ Do đó, phương pháp giữ hình dạng tế bào (vì màng không bị phá huỷ), tất nhiên DNA plasmid bị giữ lại tế bào Nhưng sau bổ sung phenol/chloroform vào làm biến tính kết tủa protein nội bào Đồng thời tế bào co lại nhanh chóng đẩy dung dịch nội bào (bao gồm DNA plasmid) ngoài, DNA genome protein bị giữ lại sinh khối tế bào loại bỏ ly tâm Bảo quản DNA plasmid - Bảo quản Plasmid tế bào: Plasmid bảo quản thời gian ngắn (khoảng tháng) tồn tế bào vi khuẩn cất 40C Nếu muốn bảo quản tế bào chứa plasmid lâu nên bổ sung 1V glycerol DMSO đông lạnh -70°C - Bảo quản DNA plasmid: DNA plasmid bảo quản đệm TE 4°C vài tuần Nếu -20°C vài năm Thực hành tách chiết palamid vi khuẩn Ecoli A Vật liệu - Tế bào Ecoli Bl21 B Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bị + TE-RNAnase : 10mM Tris-HCl pH = 1mM EDTA 100µg/ml RNAnase 100µl RNAnase (10mg/ml) vào 10ml TE (10:1)- 100µg/ml RNAnase + SolI (solution I) : 50mM tris – HCl (pH=8) 10mM EDTA Khử trùng???? + Sol II: NaOH 200mM SDS 1% + Sol III: KAC (potassium acetate CH3COOK ) 3M pH = 5,5 Các hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm) Eppendorf Hệ thống điện di nằm ngang C Cách tiến hành - Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf Ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Thu cặn tủa - Hòa cặn tủa 150 µl dung dịch SolI, Lắc mạnh vortex - Thêm 150 µl dung dịch SolII, lắc nhẹ - Thêm 150 µl dung dịch SolIII, đảo nhẹ - Thêm 450 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), đảo vài lần - Ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút, 40C Thu lấy 400 µl phần dịch phía (là pha nước có chứa DNA plasmid), nhẹ nhàng chuyển sang eppenforf khác - Thêm 40 µl (tỉ lệ 1:10) dung dịch NaOAC 3M ml Etanol 100%, lắc đảo vài lần (hoặc thêm 500µl isopropanol không NaOAC).Ủ -200C (hoặc -85 30 phút) - Ly tâm 12000 vòng/phút, 20 phút, 40C Thu cặn tủa - Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa Ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút, C Thu cặn tủa Để khô box (hoặc speedVac) - Thêm 40 µl TE-ARN-nase, ủ 37°C từ 1-2h, bảo quản -20°C TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo chính: [1] Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình “Công nghệ AND tái tổ hợp”, 2005 , NXB DDHQG TP Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Thị Lang, Sinh học phân tử- giới thiệu phương pháp ứng dụng, NXB Nông nghiệp 2005 Tham khảo thêm: [3] Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục 2008 [4] Hồ Huỳnh Thùy Dương cộng sự, Thực tập Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM [5] E-book, Current Protocol in Molecular Biology [6] Jonh Wiley & Sons, Current protocols in molecular Biology, 2003 ... hoạch thí nghiệm (5 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM Buổi Kiểm tra Làm quen với thiết bị, dụng cụ sử dụng sinh. .. đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Yêu cầu kĩ thuật tách chiết acid nucleic thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học Các acid nucleic cần tách... tương gồm phân tử phenol với phân tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp vào dịch tế bào, phân tử phenol có tính kị nước nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước protein bên cấu trúc phân tử này,