Một số Enzym sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử doc

[...]... sau một base pyrimidin (C và U) của RNA  Ứng dụng:  Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein  Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong phân tử lai DNA – RNA RNase H  có tác dụng loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA – RNA  thường được dùng để loại bỏ RNA sau các phản ứng chuyển mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của cDNA tạo nên một phân tử DNA mạch đôi      Một số enzym. .. lọng) trên phân tử RNA trong quá trình chuyển mã ngược tạo cDNA Exonuclease III  được tách chiết từ E coli  xúc tác phản ứng thủy phân tuần tự các nucleotid từ đầu 3’OH tự do của một DNA, theo chiều 3’ → 5’, tạo nên một vùng mạch đơn dài trên một phân tử DNA mạch đôi  Enzym còn có các hoạt tính 3’ phosphatase, RNase H   Ứng dụng: Tạo các cấu trúc mạch đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng... lượng lớn RNA từ một trình tự DNA được nối ngay sau một promoter thích hợp   Ứng dụng: Tổng hợp mẫu dò RNA đánh dấu phóng xạ hay hóa học  Xác định trình tự của một DNA được dòng hóa trong một vector có mang các promoter đặc trưng cho phage SP6, T3, T7  Nghiên cứu bản sao chép RNA của một DNA đã được dòng hóa  Nhờ các RNA polymerase, người ta có thể tổng hợp một số lượng lớn RNA từ một DNA được dòng... DNase nồng độ thấp có thể phân hủy các gen đang hay đã từng hoạt động, đặc biệt là các vị trí siêu nhạy cảm nằm trong các phần được chuyển mã mạnh nhất của nhiễm sắc thể Nuclease S1  được ly trích từ nấm Aspergillus oryzae, có khả năng phân cắt DNA mạch đơn, không có khả năng phân cắt phân tử lai DNA – RNA   Ứng dụng: Phân tích cấu trúc của các phân tử lai DNA – RNA  Loại bỏ một đoạn đơn ở đầu so... các deoxynucleotid vào đầu 3’- OH tự do của phân tử DNA  Gắn ngẫu nhiên nên thành phần nucleotid của chuỗi polynucleotid mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotid có trong phản ứng   Ứng dụng: Thêm đuôi polynucleotid (tailing) để tạo đầu so le cho phân tử DNA, dùng trong kỹ thuật tạo dòng (cloning)  Đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương pháp xác định trình tự acid nucleic... được sử dụng nhiều hơn khi cần tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao Taq DNA polymerase  trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus là một enzym chịu nhiệt nên thường được sử dụng trong phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)  PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu nhờ enzym DNA polymerase trên máy luân nhiệt (thermal cycler) Transcriptase ngược (Reverse transcriptase)  do các retrovirus sản sinh. .. phosphodieste Là enzym cắt DNA (DNase) và enzym cắt RNA (RNase) Các RE: cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn DNase I  Enzym được tách chiết từ tụy bò  Xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết nằm ngay sau một base pyrimidin (G, C)   Ứng dụng: Loại bỏ DNA tạp nhiễm trong các nghiên cứu DNA và nghiên cứu protein  Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong các kỹ thuật đánh dấu... polymerase  sử dụng nhiều nhất: SP6 RNA polymerase, T3 và T7 RNA polymerase  SP6 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium  T3 và T7 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm E coli  Xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử DNA mạch đôi theo chiều 5’ → 3’  Không cần mồi nhưng khuôn DNA phải có mang một promoter đặc trưng của phage  Dùng để tạo một lượng... cắt của các enzym RE loại II Cắt tạo đầu bằng (blunt ends) Sma I 5’…CCCGGG….3’ 3’…GGGCCC….5’  5’…CCC 3’…GGG GGG…3’ CCC…5’ không có khả năng tự kết hợp lại Để nối phải dùng enzym T4 DNA ligase Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends): Các đầu so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase, được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp  1.3.3 Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng... hợp DNA  Terminal transferase: không tổng hợp một đoạn DNA mới từ khuôn mà chỉ thêm các nucleotid vào đầu của một phân tử DNA có sẵn,  Các DNA polymerase khi hoạt động cần có mồi (primer) DNA polymerase I (DNA pol I)  Hoạt tính : - hoạt tính polymerase: tổng hợp -hoạt tính exonuclease: thủy phân các liên kết phosphodieste giữa các nucleotid từ đầu phân tử DNA, phóng thích từng nucleotid theo cả chiều . 1. ENZYM GIỚI HẠN (restriction enzyme, RE) 1.1. Tên gọi các enzym giới hạn 1.2. Các loại enzym giới hạn 1.3. Các RE loại II 2. MỘT SỐ ENZYM KHÁC THƯỜNG SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ . so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase, được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp 1.3.3. Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng thủy giải bởi RE  Chú ý đến điều kiện. biết  Mỗi enzym giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA có trình tự từ 4 – 6 cặp nucleotid.  Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết được gọi là isoschisomers.  Đối với một số