CÁC ENZYME ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ

Enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn restriction endonuclease hay gọi tắt là enzyme giới hạn restrictase là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên cá

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 3

PHẦN II: NỘI DUNG 4

I CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN 4

1 Enzyme cắt giới hạn 4

2 Vai trò của các enzyme cắt giới hạn 4

3 Tính chất của enzyme giới hạn 5

3.1 Trình tự nhận biết của RE 5

3.2 Các kiểu cắt của RE 7

4 Danh pháp 10

5 Phân loại enzyme giới hạn 11

5.1 Enzyme loại I 12

5.2 Enzyme loại III 13

5.3 Enzyme loại II 14

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE 16

6.1 Độ tinh sạch của DNA 16

6.2 Mức độ methyl hóa của DNA 16

6.3 Đặc tính methyl hóa của RE 18

7 Ứng dụng của RE 18

II CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI 19

1 Enzyme polymerase 19

1.1 DNA polymerase 19

1.2 RNA polymerase 26

2 Enzyme gây biến đổi đầu cuối DNA 29

2.1 T4 polynucleotide kinase 29

2.2 Alkaline phosphatase 30

3 Nuclease 31

3.1 DNase I (Deoxyribonuclease I) 31

3.2 Exo III (Exonuclease III ): 32

3.3 RNase A ( Enzyme Ribonuclease A): 32

3.4 RNase H: 33

3.5 RNase T1 (Enzyme ribonuclease T1) 33

3.6 Enzyme nuclease S1 34

III CÁC ENZYME NỐI (LIGASE) 35

1 DNA ligase 35

1.1 T4 DNA ligase 36

1.2 E.coli DNA ligase 36

2 .37

3939393939393939393939393939393939T4 RNA ligase 37

PHẦN III: KẾT LUẬN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Sinh học phân tử không chỉ là một lĩnh vực mới mà còn trở nên cần thiết trong bất cứ chuyên ngành nào của sinh vật học Quá trình nghiên cứu Sinh học phân tử đã diễn ra trong một thời gian dài và người ta đã ứng dụng được những thành tựu của chúng vào các lĩnh vực khác nhau để mang lại những lợi ích nhất định trong đời sống cũng như trong sản xuất

Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen

do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định Enzyme là công

cụ cơ bản trong kỹ thuật tạo dòng phân tử Sinh học phân tử đã phát hiện và hiểu rõ cơ chế tác động của hàng loạt enzyme, nhờ đó đã sử dụng chúng như những công cụ hữu hiệu trong việc cắt nối và ghép các gen

Trong tạo dòng phân tử có sự tham gia của các enzyme: enzyme nuclease, DNA-polymerase, ligase và restriction endonuclease Để hiểu thêm

về các enzyme tạo dòng nên tôi đã chọn đề tài "CÁC ENZYME ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ "

PHẦN II: NỘI DUNG

I CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN

1 Enzyme cắt giới hạn

Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù

Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đó bị phagơ phá huỷ Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzyme có khả năng cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzyme này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại enzyme có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập

để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ Những enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn

2 Vai trò của các enzyme cắt giới hạn

Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi

khuẩn E coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa

vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn Chỉ trong một số ít trường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản trong tế bào chủ Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiếm soát của tế bào chủ Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu khi các thể thực khuẩn

(phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn

Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt giới hạn Chúng đều có đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ 259 bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết (recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence) Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy ra đối với adenine và biến đổi nó thành N-6 methyladenine Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc thù

chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ Như vậy, các enzyme giới hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ

3 Tính chất của enzyme giới hạn

3.1 Trình tự nhận biết của RE

Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: 260 loại

I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết và loại

II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết Ở đây chúng ta chỉ xét các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng (giống như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các gene trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận

Trong tự nhiên các enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào

vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các

nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các enzyme hạn chế.

Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc biệt, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, do nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote

Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt

thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide Ví dụ enzyme EcoRI tách chiết từ

E coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt

trình tự TGGCCA Có hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 chủng vi sinh vật

Đoạn nhận biết thường dài từ 4-6 cặp nu, thường có cấu trúc cân đối bộ đôi (có nghĩa là trình tự nu hướng 5’-3’ của sợi đơn này giống với trình tự nu hướng 5’-3’ của sợi bổ sung kia, một số ít có khả năng cắt lệch trên 2 sợi đơn Hai enzyme Not I và SfiI nhận biết một đoạn dài 8 cặp nu, đoạn này ít tìm thấy trong DNA genome nên thường được dùng để cắt DNA nhằm tạo thành các đoạn lớn DNA

Bảng 1 Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế

STT Tên enzyme Vị trí nhận biết Đầu được tạo ra

3’…CAA↑TTG…5’

5’…GTT AAC…3’ 3’…CAA TTG…5’

3’…CC↑GG…5’ 3’…CC GG…5’

3’…CCAT↑GG…5’

5’…G GATCC…3’ 3’…CCAT GG…5’

3’…TCTAG↑A…5’

5’…A GATCT…3’ 3’…TCTAG A…5’

3’…GGG↑CCC…5’

5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’

10 XmaI 5’…C↓CCGGG…3’

3’…GGGCC↑C…5’

5’…C CCGGG…3’ 3’…GGGCC C…3’

Một số enzyme có thể cắt tốt ở trình tự này nhưng lại cắt ít hữu hiệu ở trình tự khác Thí dụ enzyme EcoRI cắt ở nơi có trình tự AATT không tốt bằng ở những nơi có trình tự GAATTC

3.2 Các kiểu cắt của RE

Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại

Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo

ra hai đầu lệch nhau một vài base Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng

có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo

ra những phân tử lai Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền

Vị trí cắt tại liên kết phosphodiester nối giữa các đường deoxyribose của các nucleotide tạo thành các đoạn có 2 đầu xác định 5’P, 3’OH và có trình

tự tương ứng với mỗi enzyme RE

Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau (Hình 1)

Hình 1 Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế.

(a) tạo ra đầu so le, và (b) tạo ra đầu bằng

Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: BalI) cắt ở trục đối xứng để tạo ra

các đoạn DNA mang đầu bằng (blunt)

Cũng có trường hợp 2 hoặc nhiều enzyme nhận biết trình tự giống nhau, nhưng khi cắt sinh ra các đoạn DNA không nhất thiết lúc nào trình tự tận cùng cũng giống nhau

Nhiều enzyme có trình tự nhận biết khác nhau nhưng khi cắt lại có thể tạo ra những đầu tương hợp Các đoạn này kết gắn với nhau bằng enzyme ligase sẽ tạo ra phân tử DNA lai

Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu 5’ dính (protruding) Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các đoạn DNA có đầu 3’ lồi.Ví dụ:

* Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự

Eco RI cắt

5' -G-A-A-T-T-C - 3' 5' -G 5' -A-A-T-T-C -3'3' -C-T-T-A-A-G -5' 3' -G-T-T-A-A -5' G -5'

Bảng 2: Các enzyme endonuclease hạn chế và những đoạn cắt của chúng Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn

Thermus aquaticus YTI

Vì một enzyme hạn chế chỉ nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số

vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các

cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương

hợp nhau về cấu trúc Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

4 Danh pháp

Nguồn gốc enzyme là từ vi khuẩn vì vậy tên enzyme sẽ dựa trên tên của chủng vi khuẩn chứa nó Theo quy tắc, các enzyme có tên gọi gồm có 3 chữ thuộc tên chủng vi khuẩn gốc; Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên giống của vi khuẩn từ đó enzyme được trích li và 2 chữ tiếp theo là thuộc tên loài 3 chữ này có thể thêm vài ký hiệu chỉ định để phân biệt 2 chủng cùng loài Có

số la mã tiếp theo để phân biệt các enzyme giới hạn khác nhau mà có nguồn gốc cùng một chủng vi khuẩn

Ví dụ

1 EcoRI:

5' GAATTC 3'3' CTTAAG 5'

- E: Giống Escherichia

- Co: Loài Coli

- R: Chủng RY13

- I: Enzyme được tách lần đầu tiên

Một số ví dụ tương tự: PstI là enzyme giới hạn được tách từ Providencia stuartii; Fnu DI, Fnu Dn và Fnu DHI, là 3 enzyme xuất phát từ Fusobacterium nucleatum chủng D; Bst DI021 thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus chủng D102; Một số loại khác như E.coRV, BamHI,

HaeIII, Smal, …

5 Phân loại enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn nằm trong một hệ thống bao gồm cả enzyme sửa đổi,

nó không thể nào tồn tại một mình được Những chủng vi khuẩn, nếu hệ thống giới hạn sửa đổi có một enzyme sửa đổi không hoạt động được vì lý do nào đấy, thì chủng đó không thể nào sống nổi Lý do chỉ vì DNA không được sửa đổi sẽ bị enzyme giới hạn tương ứng phá huỷ

Từ khi hệ thống enzyme giới hạn-sửa đổi B và K của Escherichia coli

được xác định tới nay đã có hơn 2500 hệ thống khác được phát hiện.Trong đó

có gần 200 trình tự đặc hiệu hoàn toàn khác nhau được enzyme nhận ra

Tất cả enzyme này được phân loại khác nhau tuỳ theo thành phần phân

tử, điều kiện cần thiết để hoạt động, kiểu trình tự nucleotit nhận ra và vị trí cắt Lúc ban đầu, enzyme được phân chia ra loại I và loại II dựa chủ yếu trên tính chất phức tạp của enzyme Enzyme loại I là đa khả năng, mang cả hai chức năng giới hạn và sửa đổi trong khi enzyme lọai II chỉ mang một trong hai khả năng giới hạn hoặc sửa đổi Sau này, các enzyme phức tạp được chia ra thêm loại III Đặc điểm của 3 loại enzyme này được tóm tắt trên Bảng 3

Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III tuy nhiên các enzyme giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ di truyền thuộc kiểu II, có cơ chế tác động đơn giản nhất Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên còn được gọi là enzyme endonuclease Vì enzyme loại I và III chiếm tỷ lệ ít và không được sử dụng nhiều, các nét chính enzyme này sẽ được giới thiệu trước tiên Enzyme loại II sẽ được trình bày sau cùng một cách chi tiết hơn

Bảng 3: Những đặc điểm của enzyme giới hạn của ba loại hệ thống

giới hạn-sửa đổi (theo bảng của Lewin, p 508)

ĐẶC ĐIỂM ENZYME LOẠI

protein có 3 đơn vị phân

tử

có 2 đơn vị phân tử

một đơn vị chức năng hoặc giới hạn hoặc sửa đổi

Trình tự gồm 4-6

bp, và đa số trình tự không đối xứng

Vị trí cắt Không đặc hiệu

Cách xa vị trí nhận 1000 bp

Cắt phía 3' cách vị trí nhận 24 -26 bp

Ngay trong hoặc sát

vị s là để nhận ra vị trí đích trên DNA Sau khi một vị trí đích trên DNA được đơn vị S nhận ra, có thể xảy ra một trong hai phản ứng là giới hạn hoặc sửa đổi Đơn vị M và S có khả năng tạo một kết hợp tỷ lệ 1:1 để tiến hành phản ứng sửa đổi một cách độc lập

Vị trí nhận ra của enzyme loại I có 2 trình tự đặc hiệu gồm 3 bp và 4 bp cách xa nhau vài nucleotit Ví dụ, vị trí của Eco B và Eco K là TGA(N8)TGCT/ AGCA(N8)TCA Hai trình tự đặc hiệu của vị trí nhận ra không đối xứng nhưng vẫn đều được methyl hoá trên 2 chuỗi đối diện

Việc DNA bị cắt đi hoặc sửa đổi là do trạng thái của vị trí đích Nếu vị trí đích được sửa đổi toàn bộ thì enzyme bám vào vị trí đó nhưng sẽ không tác động gì cả và sẽ lại rời vị trí đích ra Nếu vị trí chỉ được sửa đổi một nửa ở một trong hai chuỗi DNA, thì đơn vị enzyme mang chức năng sửa đổi sẽ can thiệp để cho hai chuỗi DNA của vị trí nhận đều được methyl hoá Và nếu vị trí đích hoàn toàn không được sửa đổi, thì sự tiếp xúc của enzyme với vị trí đích

sẽ dẫn đến phản ứng cắt do enzyme giới hạn Enzyme giới hạn loại I cắt DNA

ở các vị trí không đặc hiệu cách xa vị trí nhận hơn 1000 bp Vị trí cắt không xảy ra hoàn toàn ngẫu nhiên vì người ta đã quan sát có vùng DNA bị cắt trước tiên

Một đặc điểm đáng để ý là sau mỗi lần enzyme đã bám vào DNA để thực hiện phản ứng cắt, thì nó sẽ không bao giờ tách khỏi DNA nữa có nghĩa rằng nó không thể tiếp tục tham gia vào một phản ứng khác được

Về mặt di truyền, mỗi đơn vị của enzyme được mã do một gen: hrsS mã cho đơn vị nhận ra trình tự đặc hiệu, hrsR mã cho dơn vị dùng để tiến hành phản ứng giới hạn và hrsM mã cho đơn vị tiến hành phản ứng sửa đổi Khi hrsR bị đột biến, vi khuẩn mang phenotyp r-m+ tức là tế bào còn có chức năng

sửa đổi nhưng mất chức năng giới hạn DNA Khi hrsS bị đột biến, phenotyp

trở nên r-m+ và vi khuẩn mất cả hai chức năng giới hạn và sửa đổi Và khi

hrsR bị đột biến thì sự kiện này không bao giờ dẫn đến phenotyp r-m+ vì phenotyp này dẫn đến sự chết của tế bào do hậu quả enzyme giới hạn phá huỷ

DNA genom không được sửa đổi Tuy nhiên, các trường hợp gen hrsR bị đột

biến vẫn xẩy ra trong thực tế nhưng phenotyp sẽ là r-m- Những gen của các

đơn vị của enzyme loại I đều có cùng một hướng trên DNA Lúc nào hrsM cũng đứng trước hrsS trên cùng một operon tách khỏi gen hrsR và vị trí của gen hrsR là trước hoặc sau nhóm hai gen kia.

5.2 Enzyme loại III

Enzyme loại III lại tương đối hiếm chỉ gồm có 4 thành viên là Eco P1, EcoP 15, Hinf III và Sty LTI Giống như enzyme loại I, enzyme loại III có đa

chức năng nhưng gồm hai loại đơn vị thôi: đơn vị R dùng để tiến hành phản ứng giới hạn còn đơn vị MS có vai trò vừa sửa đổi vừa nhận ra Khi enzyme

đã bám vào một vị trí đích, thì hai phản ứng giới hạn và sửa đổi sẽ cạnh tranh

để xảy ra Vị trí cắt cách xa vị trí nhận là 24-26 bp Vị trí đích của P1 và P15

là đoạn kép AGACC/GGTCT Vói trình tự không đối xứng này chỉ một trong hai chuỗi DNA kép mới có thể A-methyl hoá Như thế vị trí đích lúc nào cũng

ở hình thức sửa đổi một nửa Đây là một đặc điểm lạ của enzyme loại III vì khi DNA được sao chép thì sẽ sinh ra hai loại phân tử DNA con: DNA chứa một chuỗi DNA methyl hoá của phân tử mẹ và DNA hoàn toàn không methyl hoá Quan sát này dẫn đến câu hỏi tại sao DNA kép con không methyl hoá tránh được hiện tượng giới hạn Sự thực, endonuclease loại III hoạt động đòi hỏi phải 2 vị trị đích có mặt cùng lúc trên DNA và trình tự của chúng bắt buộc phải có xu hướng ngược chiều nhau Trong khi methylase chỉ cần nhận một vị trí đích thôi để tiến hành phản ứng, thì endonuclease bắt buộc phải nhận hai vị trí đích ngược chiều nhau Chỉ khi nào hai vị trí ngược chiều nhau này đều không được methyl hoá thì phản ứng giới hạn có thể xảy ra Người ta đã hiểu được vấn đề này sau khi nhận xét kết quả giới hạn của enzyme Eco P15 trên DNA phagơ T3 và DNA phagơ T7 DNA phagơ T3, rõ ràng bị giới hạn được trong khi DNA phagơ 17 không bao bị giới hạn mặc dù T7 và T3 đều cùng một gia đình cả và DNA T7 có đến 36 vị trí đích Thế nhưng cả 36 vị trí này đều cùng một chiều thành ra enzyme không hoạt động được vì thiếu một vị trí ngược chiều

Có hai gen cấu trúc tạo thành nền di truyền cho các enzyme loại III: gen 33333res có tính chất cố định cao, còn gen mod có cả vùng cố đinh lẫn vùng thay đổi Sản phẩm hai gen này giống sản phẩm của hsdS và hsdM của enzyme loại I

5.3 Enzyme loại II

Các enzyme loại II được gặp nhiều nhất và có tính chất đơn giản hơn Chức năng giới hạn và sửa đổi được riêng biệt ra Mỗi enzyme của hệ thống

giới hạn-sửa đổi chỉ mang một trong hai chức năng thôi Enzyme giới hạn loại

II đòi hỏi một chất hỗ trợ duy nhất để hoạt động, đó là Mg 2+ Chúng cắt DNA ngay trong hoặc gần vị trí đích nhận ra Nhờ đặc điểm này, enzyme giới hạn loại II đã trở thành các công cụ rất cần thiết trong ngành sinh học phân tử Mặt khác, trình tự của vị trí đặc hiệu chúng nhận ra và cắt đi có vẻ không bị hạn chế ở một số loại trình tự thôi Đến nay, người ta đã phát hiện hơn 2500 enzyme loại II có khả năng nhận ra tổng số trình tự đặc hiệu khác nhau là 200 Hiện nay, đa số enzyme mới tìm thấy là các isoschizomer của những enzyme giới hạn đã được biết tức là chúng nhận ra những trình tự đặc hiệu của enzyme

đó Độ dài các trình tự đặc hiệu được enzyme loại II nhận biết là từ 4 đến 8 nucleotit Đa số trình tự là đối xứng, có nghĩa 2 trình tự bổ sung nhau đều giống nhau Điều này làm cho việc cắt trở nên đơn giản Enzyme giới hạn loại

II được hình thành với 2 đơn vị phân tử giống nhau vì vậy sự liên kết này cho phép tiến hành cắt cùng lúc cả hai chuỗi DNA

Gen cấu trúc của hơn 50 enzyme loại II đã được xác định trình tự nucleotit Protein enzyme giới hạn loaị II có thể chứa từ 157 đến 576 aa, trung bình là 300 aa Một điều lạ được nhận xét là khi đối chiếu các trình tự nucleotit của những gen enzyme giới hạn phân tích, thì không phát hiện một đoạn trình tự giống nhau nào cả, trừ một số trường họp ngoại lệ rất hiếm Kể

cả với isoschizomer mà nhận ra cùng một trình tự đặc hiệu cũng không quan sát được các vùng DNA giống nhau trên những gen giới hạn tương tự Như thế, nhóm enzyme giới hạn này, tuy có chức năng giống nhau, nhưng là vô cùng đa dạng Nhận xét đó làm cho người ta kết luận rằng enzyme loại II không phải xuất phát từ một phân tử tổ tiên và sự tiến hoá của chúng không phải là do đột biến ở những vùng gen liên quan với chức năng nhận biết của enzyme

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE

6.1 Độ tinh sạch của DNA

Hiệu quả phản ứng cắt giới hạn DNA phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch của DNA Các tạp chất tìm thấy khi chiết xuất DNA như protein, phenol, chloroform, ethanol, EDTA, SDS và nồng độ muối cao khác, có thể sẽ ức chế hoạt tính của enzyme Để khắc phục hiệu quả cắt thấp do tạp chất gây ra thì nên tăng hàm lượng enzyme lên từ 10 đến 20 unit cho 1µg DNA Có thể tăng dung tích phản ứng để làm loãng nồng độ các tạp chất ức chế hoặc kéo dài thời gian ủ Phương pháp tách chiết nhanh (miniprep) thường lẫn nhiều tạp chất và cả DNase Vì DNase yêu cầu Mg2+ hoạt động nên nếu DNA sau khi chiết tách được bảo quản trong dung dịch chứa EDTA sẽ ổn định hơn, nhưng lại dễ bị phân rã nhanh chóng trong môi trường dung dịch phân cắt enzyme Tốt nhất là nên tinh chế lại DNA nếu thấy còn lẫn quá nhiều tạp chất Muốn phân cắt DNA tốt thì nên thêm chất polycation spermidine (nồng độ làm việc

từ 1,0 - 2,5mM) Tuy nhiên vì spermidine làm kết tủa DNA ở 40C cho nên chỉ thêm chất này vào sau khi đã thêm các thành phần phản ứng khác đã được ủ ở nhiệt độ thích hợp trong vài phút Cuối cùng các phương pháp tách chiết DNA đều phải tinh chế lại bằng phenol, chloroform và kết tủa bằng ethanol trước khi đem phân giải enzyme

6.2 Mức độ methyl hóa của DNA

Một số enzyme cắt giới hạn bị ức chế hoạt tính cắt do đoạn nhận biết có những nucleotide bị methyl hóa

Chủng vi khuẩn E.coli nào chứa một trong 2 trình tự bazơ sau bị methyl

hóa, được gọi là vi khuẩn dam nếu có vị trí Adenin trong trình tự GATC bị methyl hóa và gọi là dam nếu có chứa cytosine ở giữa trình tự CC(A/T)GG bị methyl hoá

Vì thế DNA của những plasmid được chiết xuất từ 2 chủng E.coli này

thường có thể bị cắt một phần hoặc không bị cắt bởi những enzyme cắt giới hạn có đoạn nhận biết giống với một trong 2 trình tự trên Để tránh điều này

xảy ra, trong kỹ thuật nhân dòng gen, người ta khuyên nên chỉ chiết tách và

dùng DNA của plasmid từ những chủng vi khuẩn E.coli không có chỗ nào bị

Hiện tượng methyl hóa ngăn cản hoạt tính enzyme cắt giới hạn nhiều khi lại có lợi vì nếu những trình tự nhận biết men methylase nằm gần với trình

tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn nào đó thì có thể sẽ ức chế hoạt động cắt tại vị trí này, vì thế sẽ làm đảo lộn tính đặc thù trình tự cắt hiển nhiên của enzyme

Trong trường hợp muốn sử dụng đoạn kết gắn linker nhằm biến đổi trình tự các đầu của 1 đoạn DNA, khi đó lại cần phải bảo vệ bằng được những

vị trí cắt của enzyme hạn chế ở bên trong, bằng cách tiến hành methyl hóa trước khi tiến hành dùng enzyme cắt thành các đoạn sau đó kết gắn với linker

Bảng 4 Điều kiện phản ứng của một số RE

Loài VSV sinh ra Tên RE Nồng độ T o hoạt

động

T o bất hoạt

Providencia stuarti PstI H 37 70

Chú thích: nồng độ muối: NaCl hoặc KCl, L≤50mM, M: từ 50-100mM,

Tính phổ biến của dung dịch đệm rất có lợi khi cần phân cắt DNA với nhiều enzyme, điều này sẽ đỡ gây lãng phí hơn cho nhà nghiên cứu

Trong quá trình sử dụng enzyme phân giải phải luôn cẩn thận bỏ vào đá

và luôn bảo quản ở nhiệt độ -20 và tuyệt đối không được làm lẫn tạp đặc biệt với DNA plasmid, với các enzyme khác hay DNase I

Có một số enzyme khá đắt một số khác thì rẻ hơn, tuy nhiên enzyme đắt thường lại có chất lượng thấp

6.3 Đặc tính methyl hóa của RE

Là khả năng của enzyme xúc tác quá trình gắn các gốc CH3 vào vị trí các bazơ adenine hoặc cytosine trong nội tại trình tự nhận biết đặc thù Như enzyme EcoRI có khả năng methyl hóa các bazơ adenine trong nội tại vùng nhận biết của enzyme này Nhờ vậy đã ngăn cản không cho chính enzyme đó cắt tại vị trí đó

7 Ứng dụng của RE

Quá trình cắt như vậy được sử dụng cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau:

- Dùng để thiết lập bản đồ cắt giới hạn của DNA plasmid hoặc dòng thực khuẩn thể Bản đồ cắt giới hạn là vị trí cắt của mỗi RE trên phân tử DNA, nhóm liên kết hay cả bộ genome.

- Phân cắt tạo ra các đoạn nhỏ từ DNA genome trước khi phân tách bằng điện di và tiến hành lai DNA, dùng trong phương pháp RFLP

- Tạo ra các đoạn để nhân dòng trong vector thích hợp

- Tạo ra các đoạn DNA mẫu dò để đánh dấu, sử dụng trong phương pháp lai DNA

II CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI

Có một enzyme DNA polymerase đặc biệt có chức năng phiên mã ngược có tên là reverse transcriptase, là loại enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào RNA (RNA-depentdent RNA polymerase) enzyme này sử dụng mạch khuôn là RNA (thường là mRNA) để tổng hợp lên DNA Enzyme này

có nguồn gốc từ retrovirus, dùng RNA của virus làm khuôn để tổng hợp lên DNA copy virus

Một loại DNA polymerase nữa không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà chỉ thêm một đoạn các nu đồng nhất như poly A vào đầu tận cùng của phân tử DNA thứ nhất, đó là enzyme terminal transferase Enzyme này sau đó lại sử dụng để đính poly T vào phân tử DNA thứ 2 Sau đó 2 phân tử DNA được kết gắn với nhau qua 2 đầu bổ sung sẽ đính kết lại (ligation) rồi được nhân dòng

lên, quá trình này sử dụng trong tạo vector tái tổ hợp từ 2 đoạn DNA khác nhau.

Template-independent DNA polymerase là một dạng enzyme terminal transferase, thêm từng nu vào đầu 3’ của một đoạn mồi đơn DNA, kéo dài thành một sợi đơn DNA dài

1.1.2 Đặc tính của DNA polymerase

DNA polymerase muốn hoạt động được thì cần phải có một đoạn mồi (primer) Mồi có thể là đoạn mạch đơn DNA hay RNA ngắn, bắt cặp bổ sung với phần đoạn đầu của mạch khuôn để từ đó các polymerase mới kéo dài thêm từng nu một gắn vào đầu 3’OH

Tất cả các DNA polymerase đều thêm deoxynucleotit vào nhóm OH tận cùng đầu 3’ của phân tử DNA mạch đơn ngắn, hoạt tính trùng phân xẩy ra luôn theo hướng 5’-3’ của DNA polymerase Mỗi một nu được gắn vào mạch mới đối xứng với nu của mạch đối diện (mạch khuôn), theo nguyên tác dA ghép cặp với dT, dC ghép cặp với dG Phản ứng yêu cầu 4dNTP và ion Mg2+

Rất nhiều enzyme DNA polymerase có thêm đặc tính phân rã 3’-5’ Đặc điểm của hoạt tính này là cắt bỏ từng nucleotide và giải phóng ra 1 nucleotide có đầu 5’ mang một gốc phosphate (NMP) Trong điều kiện không

có dNTPs, hoạt tính này sẽ xúc tác phân rã từng nấc phân tử DNA, từ đầu 3’

có nhóm OH tự do, ở cả sợi đơn và sợi kép DNA Khi có mặt dư thừa dNTPs, hoạt tính exonuclease đối với sợi đôi DNA bị ức chế bởi hoạt tính trùng phân của polymerase Trong quá trình tổng hợp, hoạt tính exonuclease

có vai trò sửa chữa sai sót bằng cách cắt bỏ những nu ghép nhầm vào mạch trong quá trình trùng phân

Một số enzyme DNA polymerase như E.coli DNA polymerase I còn có

thêm hoạt tính 5’-3’ exonuclease Hoạt tính này phân rã sợi DNA kép từ đầu 5’, nó cắt bỏ từ một đến vài nucleotide và có thể giải phóng ra một đoạn dài tới 10 nu Đặc tính này gíup enzyme bắt đầu tổng hợp lại các khía trong chuỗi phân tử DNA kép Hoạt tính phân rã DNA 5’-3’ exonuclease xảy ra cho phép