Enzyme ligase là enzyme nối quan trọng trong tế bào. Các enzyme này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau. DNA ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase là 2 enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Có một số loại enzyme nối khác nhau, nhưng enzyme T4 DNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật tạo dòng
1. DNA ligase
Là enzyme xúc tác việc hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3’OH đầu này với đầu 5’-P của nu đầu kia của 2 chuỗi DNA kép. DNA ligase còn có chức năng sửa chữa những khía cắt một mạch trong sợi kép DNA và kết gắn những đoạn DNA cắt hạn chế, các đoạn này có 2 đầu tầy hoặc 2 đầu chéo.
Có 2 loại DNA ligase được dùng trong nghiên cứu axit nucleic đó là
E.coli ligase và T4 ligase. Hai enzyme này khác nhau về 2 đặc tính quan trọng
đó là nguồn năng lượng mà chúng sử dụng và khả năng kết nối đầu bằng. T4 ligase sử dụng năng lượng là ATP, trong khi đó E.coli ligase lại sử dụng NAD. Dưới điều kiện phản ứng bình thường chỉ có T4 DNA ligase mới có khả năng kết nối 2 đoạn DNA có 2 đầu bằng.
1.1. T4 DNA ligase
T4 DNA ligase là sản phẩm của gen 30 của thực khuẩn thể T4. Enzyme này đầu tiên được tách chiết từ tế bào E.coli nhiễm thực khuẩn thể T4. Gen 30 của thực khuẩn thể T4 hiện đã được nhân dòng, Enzyme này được sản xuất từ những chủng có hiệu suất sản sinh enzyme cao. Enzyme xúc tác để sửa chữa khía cắt trên một sợi đơn của phân tử DNA kép và kết gắn những đọan DNA cắt được cắt giới hạn có 2 đầu cả bằng lẫn cheo. T4 DNA ligase là một enzyme có thể kết gắn có hiệu quả các đọan DNA có 2 đầu tầy dưới điều kiện phản ứng bình thường. Enzyme sử dụng ATP như là một đồng nhân tố. Hoạt tính của T4 DNA ligase hình như được kích thích bởi T4 RNA ligase.
Phản ứng kết nối bởi T4 ligase đối với các đoạn DNA có đầu cheo thường tiến hành ở nhiệt độ từ 12 - 15oC, nhiệt độ cao làm các đầu khó anneal, nhiệt độ thấp hơn lại làm giảm hoạt tính kết nối của enzyme ligase.
Kết nối các đoạn DNA đầu bằng cần lượng enzyme cao hơn từ 10 - 100 lần lượng enzyme cần để kết gắn các đoạn đầu cheo và thường được tiến hành dưới điều kiện nhiệt độ trong phòng vì không cần thiết có quá trình anneal.
T4 DNA ligase đặc biệt không bền ở nhiệt độ > 30C và không bị ức chế bởi tRNA nhưng bị ức chế mạnh khi nồng độ muối NaCl cao >150 mM. PEG 8000 lại có tác dụng tăng quá trình kết nôi của enzyme.
1.2. E.coli DNA ligase
Là sản phẩm của gen lig. Hiện gen lig đã được nhân dòng và enzyme được sản xuất từ những chủng vi khuẩn có biểu hiện mạnh của gen này. Enzyme xúc tác cho quá trình sửa chữa những vết cắt trên một sợi đơn trong phân tử DNA kép và kết nối những đoạn DNA cắt giới hạn có các đầu cheo tương đồng. E.coli DNA ligase không kết nối được các đoạn DNA đầu tầy dưới điều kiện phản ứng bình thường. Khác với các enzyme ligase khác, E.coli DNA ligase sử dụng NAD như là một cộng nhân tố.
E. coli DNA ligase không cần những chất khử như DTT trong phản ứng, nhưng PEG 8000 lại làm enzyme có khả năng kết nối cả những đoạn DNA đầu bằng và làm tăng rất mạnh tốc độ kết nối các đọan DNA đầu chéo.
2.
T4 RNA ligase
Là sản phẩm của gen 63 của thực khuẩn thể T4, enzyme được tách chiết từ những tế bào vi khuẩn nhiễm thực khuẩn thể. Enzyme này xúc tác cho quá trình kết gắn giữa gốc phôtpho đầu 5’ của DNA hoặc RNA với đầu 3’OH của sợi đơn DNA hoặc RNA tạo liên kết phosphodiester.
- Ứng dụng :
+ Để đánh dấu phóng xạ đầu 3’ của một phân tử RNA. Phản ứng gồm phân tử RNA như là một chất nhận và một nucleotide có gốc phốtphát đánh dấu phóng xạ ([5’32P] nucleotitde 3’,5’ - bis(phosphate) (tức 5’32P-Cp) như là một chất cho, cộng thêm ATP là nguồn năng lượng. Khi phản ứng kết thúc chúng ta sẽ thu được phân tử RNA có chứa thêm một nu ở tận cùng đầu 3’, nu này có một gốc phosphate được đánh dấu phóng xạ. Phân tử này được dùng làm mẫu dò RNA.
+ Sử dụng trong quá trình khoán vị các deoxyoligonucleotide và ribooligonucleotide.
+ Kết nối các đoạn chứa vài nu trong vịêc tổng hợp oligonucleotide có chứa một đoạn oligo có chứa vài nu được đánh dấu phóng xạ.
PHẦN III: KẾT LUẬN
Tóm lại, restriction enzyme (RE), enzyme nối ligase và các enzyme làm biến đổi phân tử DNA là những enzyme có vai trò đặc biệt quan trọng trong ứng dụng của sinh học phân tử, cụ thể là trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA. RE là enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù. Enzyme ligase là enzyme nối quan trọng trong tế bào. Các enzyme biến đổi phân tử DNA. Người ta đã sử dụng các enzyme này xúc tác cho những phản ứng đặc thù trên phân tử DNA để tạo ra những sản phẩm mong muốn.
Hiện nay, công nghệ tái tổ hợp ADN đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống như nông nghiệp, y học, dược phẩm, công nghiệp... và đã mang lại những thành tựu đáng kể.
Công nghệ này mang nhiều hy vọng cho người nông dân như làm gia tăng sản lượng nông nghiệp, mùa màng bội thu bằng cách chuyển gen cho cây trồng và vật nuôi tạo ra giống mới cho năng suất cao, tạo lương thực phẩm có phẩm chất tốt, tạo giống mới chống chịu với khí hậu khắc nghiệt, khô hạn,
lạnh hay chua mặn và tạo ra giống kháng được nhiều và chống được nhiều bệnh tật do vi sinh vật có hại gây ra.
Hơn thế, ngày nay công nghệ tái tổ hợp ADN đang giúp cho vấn đề nghiên cứu nguồn gốc sự sống và đa dạng sinh học, giúp tìm hiểu cơ chế sống, trong đó có điều hòa hoạt động, biệt hóa, tăng sinh tế bào dẫn đến ung thư... ngày càng sáng rõ hơn.
Mong rằng trong tương lai có nhiều nghiên cứu ứng dụng về lình vực này để có thể mang lại nhiều lợi ích hơn nữa cho đời sống con người cũng như môi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội 2. PGS.TS. Phạm Thành Hổ. 2005. Nhập môn công nghệ sinh học. NXB
Giáo Dục.
3. Trình Đình Đạt. Công nghệ sinh học, tập 4, Công nghệ di truyền. NXB
giáo dục.
4. Đái Duy Ban. 2006. Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
5. Lê Đức Trình. 2001. Sinh học phân tử của tế bào. NXB Khoa học và kỹ
thuật.
6. Nguyễn Hoàng Lộc. 2007. Giáo trình sinh học phân tử. NXB ĐH Huế. 7. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung. 2009. Giáo trình
8. Ts. Khuất Hữu Thanh. 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen.
NXB Khoa học và Kỹ thuật.
9. Lê Duy Thành (chủ biên). 2009. Cơ sở sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục. 10. http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzyme _gi%E1%BB%9Bi_h%E1%BA%A1 n. 11. http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/nhtri/Chuong%207%20Enzyme%20%20 va%20ky%20thuat%20tao%20dong.pdf 12. http://www.sinhk33.com/2013/01/giao-trinh-ki-thuat-di-truyen.html 13. http://luanan.nlv.gov.vn/luanan? a=tc&d=TTkGWOSsMrSa1999.1.11&e=---vi-20--1--img-txIN--- 14. http: // www.zun.vn/tai-lieu/bai-giang-cong-nghe-di-truyen-lo-thanh -son- 4901/