II. CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI
2. Enzyme gây biến đổi đầu cuối DNA
2.1. T4 polynucleotide kinase
Là sản phẩm của gen pseT của thực khuẩn thể T4, đầu tiên được chiết tách từ tế bào vi khuẩn E.coli nhiễm thực khuẩn thể T4. Gần đây, gen pseT
được nhân dòng trong tế bào vi khuẩn E.coli. Enzyme được sản xuất từ những dòng vi khuẩn biến nạp có biểu hiện mạnh của gen này. Enzyme xúc tác quá trình chuyển gốc phosphate (γ) của ATP cho đầu 5’ chứa nhóm OH của DNA hay RNA.
Phản ứng này rất có hiệu quả, vì thế đây là phương pháp phổ biến để đánh dấu đầu 5’ của một đoạn DNA hoặc để gắn gốc phosphate vào một đoạn oligonucleotide.
T4 polynucleotide kinase xúc tác cho việc trao đổi gốc phosphate ở 2 đầu 5’ của một đoạn DNA.
Cuối cùng polynucleotide kinase là một enzyme xúc tác việc gắn gốc phosphate vào đầu 3’ (3’ phosphatase) của DNA.
- Ứng dụng
Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA trong kỹ thụât xác định trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert. Hoặc dùng làm mẫu dò trong kỹ thuật lai DNA.
Phosphoryl hóa các trình tự DNA không có nhóm phosphate ở đầu 5’ để chuẩn bị cho phản ứng kết nối (ligation) trong phương pháp tạo dòng.
2.2. Alkaline phosphatase
Là enzyme xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA hoặc các ribo- hay deoxyribonucleoside triphosphate tự do, để tạo thành các đầu 5’ tương ứng có nhóm OH tự do. Loại enzyme thường được sử dụng hiện nay được li trích từ vi khuẩn E.coli kí hiệu là (BAP) hoặc từ ruột bê(CIP).
- Ứng dụng:
+ Loại bỏ nhóm phosphate ở đầu 5’ của DNA và RNA, trước khi tiến hành đánh dấu phóng xạ sử dụng [γ-32P]ATP và T4 polynucleotide kinase. DNA được đánh dấu đầu 5’ có 32P sẽ được sử dụng để xác định trình tự nucleotide theo phương pháp Maxam-Gilbert hoặc xác định trình tự RNA
bằng phương pháp phân rã bởi enzyme RNase đặc thù, hoặc sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ sử dụng đoạn DNA đặc thù hoặc RNA.
+ Loại nhóm phosphate ở đầu 5’ của DNA vector, nhằm tránh quá trình tự kết nối của vector xẩy ra. Trong kỹ thuật tạo dòng, khi vector được mở ra bằng một RE rồi được loại ngay nhóm 5’ phosphate thì sẽ không thể tự nối lại được. Chỉ khi có DNA khác có mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được nhân dòng vào thì phản ứng gắn nối giữa DNA đó với vector mới xảy ra.