THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬ BÀI GIẢNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH Người soạn: Ths PHẠM THỊ KIM THẢO Đà Nẵng, 2016 NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài mở đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài 2: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng chủng vi sinh vật Bài 3: Hiện tượng lên men vi sinh vật Bài 4: Vi sinh vật phân giải tinh bột cellulose Bài 5: Xác định số tiêu chất lượng bia Bài 6: Bảo quản giống vi sinh vật Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh viên xem kỹ tất thí nghiệm, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM Buổi 1(Bài 1) Kiểm tra Chuẩn bị môi trường bao gói dụng cụ (Bài 1) Buổi (Bài 2) Báo cáo kết tìm hiểu chủng VSV giao Thực thí nghiệm Buổi 3: Bài Báo cáo kết làm buổi 2, thực phần (chuẩn bị dịch lên men giống) Buổi 4: Đánh giá số tiêu bia thành phẩm Thực hiên 5( bảo quản giống vi sinh vật ) YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Quy tắc làm việc phóng thí nghiệm vi sinh vật - Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp vệ sinh phòng thí nghiệm - Mỗi người nhóm có nơi làm việc riêng, sử dụng dụng cự thiết bị dành riêng cho Thiếu phải hỏi cán hướng dẫn Tuyệt đối không lấy người khác - Trong phòng thí nghiệm không ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… mặc áo Blue làm việc - Không tự điều chỉnh sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm chưa hướng dẫn - Sau thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm xếp gọn gàng nơi làm việc - Trước khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng cồn Nguyên tắc làm việc với giống vi sinh vật Trong điều kiện phóng thí nghiệm, vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng đặc lỏng đựng ống nghiệm, bình thủy tinh đĩa Petri Dụng cụ thủy tinh môi trường dinh dưỡng khử trùng trước cấy, phải tiến hành theo quy tắc định để đảm bảo giữ cho giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn vi sinh vật môi trường xung quanh Trước cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm ( bình thủy tinh đĩa Petri): - Tên môi trường - Tên giống vi sinh vật - Ngày cấy Tất thao tác trực bên cạnh lửa đèn cồn tốt hết thực phòng cấy vô trùng Sau cấy, phải đặt ống nghiệm ( dụng cụ khác có nuôi cấy vi sinh vật) vào tủ ổn nhiệt (còn gọi tủ ấm) Đối với dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật dùng xong, cần phải khử trùng nồi áp xuất, đem rửa Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc dung xong lớp dung dịch khử trùng giữ yên ngày sau đổ môi trường cọ rửa Tiến hành ghi chép thí nghiệm: Trong sổ phải ghi chép đầy đủ điều có liên quan đến việc hoàn thành thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng theo trật tự định Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu ngày kết thúc 2/ Đối tượng nghiên cứu 3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm 4/ Nguyên tắc phương pháp phân tích sử dụng 5/Kết nhận Các số liệu phai ghi thành bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình vẽ, ghi chép tất số liệu thực nghiệm tính toán vào sổ Bài 1: MỘT SỐ CÔNG THỨC PHA MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ, CHỦNG VSV 1.1 Công thức môi trường Bảng Công thức pha môi trường thông dụng Tên môi trường Công thức Cao thịt: 5g Pepton: 10g NaCl : g Aga: 20g Nước cất: 1000ml, pH = 7-7,2 Saccharose Maltose: 50g - Pepton: 10g - KH2PO4: 3g - MgSO4: – g - Agar: 20g, Nước cất: 1000ml - Saccharose: 30g - NaNO3: 30g - K2HPO4: 1g - MgSO4: 0,5g - FeSO4: 0,01g - Agar: 20g - Nước cất: 1000ml pH = 6, khử trùng 1atm/30 phút Tinh bột tan: 20g - K2HPO4: 0,5g - MgSO4.7H2O: 0,5g - KNO3: 1,0g - NaCl: 0,5g - FeSO4: 0,01g - Agar: 20g - Nước cất: 1000ml pH = 7,2 – 7,4 khử trùng 0,5 atm/30 phút Thạch thịt pepton (Vi khuẩn) Hansen (nấm men) môi trường Czapek) (nấm mốc) Gauze (Xạ khuẩn) - Môi trường PDA để nuôi cấy nấm men nấm mốc Bảng 1.2 Thành phần môi trường PDA Thành phần Số lượng Đơn vị Chất chiết khoai tây 200 Ml Agar 20 G Dextrose 20 G Nước cất Lít Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ lít nước cất 30 phút Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, chất chiết khoai tây Trộn với thành phần khác đun sôi để hoà tan Hấp tiệt trùng 15 phút 1210C Cho thể tích 20 – 25ml vào đĩa petri vô khuẩn 15x100mm pH cuối 5,6±0,2 Không làm tan chảy môi trường nhiều lần - Môi trường hoạt hóa tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii  Môi trường rắn: - Glucose: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l - Pepton: 3g/l - Ethanol: 30g/l - Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l - Axit axetic: 2m/l - Nước cất bổ sung: 1000ml Etanol 99.7% axit axetic bổ sung vào môi trường sau tiệt trùng làm nguội - Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh axit axetic tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii - Glucose: 10g/l - Cao nấm men: 2g/l - Pepton: 2g/l - Ethanol: 20g/l - Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l - Thuốc thử brommocresol: 0.2g/l ( pha cồn 200C) - Nước cất bổ sung: 1000ml Etanol 99.7% thuốc thử cho vào môi trường sau tiệt trùng làm nguội 40-450C - Môi trường thạch - thịt - pepton để phân lập nuôi vi khuẩn - Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l - NaCl - Agar : 20g/l : 5g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml - Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme amylaza (MT5) - Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l - NaCl : 5g/l - Tinh bột tan : 5g/l - Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml - Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme cellulaza (MT6) - Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l - NaCl : 5g/l - CMC : 10g/l - Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml - Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme proteaza (MT7) 1.2 - Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l - NaCl : 5g/l - Gelatin : 10g/l - Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml Thuốc thử + Đối với amylase cellulase: sử dụng lugol Thành phần cách pha dung dịch Lugol: Hòa tan 2g KI 5ml nước cất, thêm 1g I2 vào, sau bổ sung nước cất đến đủ 300ml lắc cho tan thành dung dịch thuốc thử Lugol đồng + Đối với Protease sử dụng: Amido – Black 1%, Tricloroacetic acid (sẽ kết tủa protein chưa bị thủy phân) Công thức pha thuốc nhuộm Amido – Black 1%: Hòa 1g Amido – Black 100ml dung dịch CH3COOH 7% 1.3 Chủng vi sinh vật 1.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.3.2 Nấm mốc Aspergillus niger 1.3.3 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium 1.3.4 Nấm men bia Saccharomyces carlsbergensis 1.3.5 Xạ khuẩn X5 Yêu cầu: Sinh viên tự tìm hiểu đặc điểm chủng vi sinh vật nêu trên( đặc điểm sinh trưởng, có khả sinh enzym gì, ứng dụng) BÀI ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT Sự tăng trưởng giống vi sinh vật biễu diễn gia tăng mật độ tế bào ( số tế bào/ml môi trường, N/ml) hay gia tăng sinh khối giống theo thời gian nuôi cấy  Đánh giá sinh trưởng thông qua số tế bào Đếm vsv buồng đếm chuyên dùng: - Buồng đếm Thoma, Malassez - Kỹ thuật Breed (đếm vi khuẩn): sử dụng 0.01mL mẫu cố định 1cm2 phiến kính, nhuộm màu vsv đếm - Đếm khuẩn lạc hộp petri  Đánh giá sinh trưởng thông qua lượng sinh khối - Xác định hàm lượng chất khô phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi - Xác định độ đục canh trường  Đánh giá sinh trưởng thông qua hàm lượng chất nội bào - Phương pháp định lượng ATP  Đánh giá sinh trưởng thông qua hoạt tính sinh khối - Mức độ sử dụng chất - Mức độ hình thành sản phẩm 2.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn nấm men (thời gian hệ giờ) 2.1.1 Nguyên tắc Mật độ tế bào xác định phương pháp trực tiếp (sử dụng buồng đếm hồng cầu) gián tiếp phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đo mật độ quang OD610 Phương pháp đo OD610 để gián dõi gia tăng mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy, phương pháp dựa tương quang tuyến tính OD610 log (N/ml) 2.1.2 Tiến hành:  Xây dựng đường chuẩn tường quan OD610 mật độ tế bào + Huyền phù hóa sinh khối giống (thu từ môi trường rắn ống thạch nghiên hộp petri) nước cất Thực pha loãng cho thu huyền phù có giá trị OD610 gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 + Dùng phòng đếm hồng cầu đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào tương ứng với huyền phù có OD610 khác 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5  Khảo sát tăng trưởng giống theo thời gian + Giống vi khuẩn nấm men phân lập làm thuần, hoạt hóa cách cấy sinh khối từ giống thạch nghiên vào ống nghiệm chứa ml môi trường cao thịt pepton môi trường hansen Lắc nhiệt độ thíc hợp 28-35ºC 100-130 vòng/phút ngày + Chuyển lượng giống hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng cho OD610 đạt xấp xỉ 0,05 + Nuôi cấy lắc 28-35ºC Sự tăng trưởng giống theo dõi 24 h cách thu lấy mẫu sau khoảng thời gian nuôi định: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 + Pha loãng mẫu cần thiết cho OD610 sau pha loãng nằm khoảng 0,10,5 + Nhân trị số OD610 đo với độ pha loãng để suy giá trị OD610 huyền phù tế bào Trường hợp theo dõi tăng trưởng giống qua đêm, thực sau: + Cấy giống hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng tương tự vào chiều ngày hôm trước Sau 12 hoăc 14 ( sáng hôm sau), bắt đầu thu mẫu để đo OD610 + Ống giống hoạt hóa bảo quản 4ºC để ức chế tiếp tục tăng trưởng giống Ngày hôm sau, thực cấy giống vào ống nghiệm khác chứa 20 ml môi trường lỏng tương tự + Song song với việc theo dõi tăng trưởng giống sau 12 nuôi cấy, tiến hành theo dõi tăng trưởng giống từ – 12 sau nuôi cấy 2.1.3 Tính toán kết 2.1.3.1 Tương quan log (N/ml) theo OD610 - Lập bảng kết xác định mật độ tế bào huyền phù có OD610 khác - Vẽ đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610 - Nhận xét khoảng tương quan tuyến tính giữu log(N/ml)và OD610 2.1.3.2 Vẽ đường cong tăng trưởng giống - Lập bảng kết theo dõi tăng trưởng giống (dựa theo OD610 dựa theo log(N/ml) theo thời gian nuôi cấy - Vẽ đường cong tăng trưởng giống môi trường lỏng khảo sát đồ thị biểu diễn hàm số OD610 log(N/ml) theo thời gian nuôi cấy - Xác định đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian pha log, thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào pha ổn định 2.2 Xây dựng đường cong tăng trưởng nấm (thời gian hệ 4-12 giờ) 2.2.1 Đánh giá thông qua lượng sinh khối  Nguyên tắc: Để khảo sát biến dưỡng vi sinh vật, thường phải nuôi cấy chúng môi trường lỏng thu sinh khối Đối với vi sinh vật đa bào dạng sợi nấm mốc, xạ khuẩn dùng phương pháp lọc để tách sinh khối khỏi dịch nuôi sấy khô 105ºC trọng lượng không đổi  Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường PDA lỏng (thay nguồn đường CMC) - Nuôi cấy nấm: + Thay đổi thành phần dinh dưỡng (đường, đạm ) pH môi trường thời gian nuôi cấy + Chuẩn bị bình tam giác 250 (môi bình 30ml môi trường PDA lỏng) +Sau khử trùng, nghiên lọ để mặt môi trường nằm ngang Cấy miếng thạch có sợi nấm sát mép nước, sau để đứng lại từ từ + Nuôi cấy tĩnh giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 g, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 54 + Sinh khối sợi vớt đặt lên giấy lọc (được cân để trừ) Sấy nhiệt độ 105ºC trọng lượng không đổi  Tính toán kết Vẽ đường cong tăng trưởng giống - Lập bảng kết theo dõi tăng trưởng giống dựa vào sinh khối nấm theo thời gian nuôi cấy - Vẽ đường cong tăng trưởng giống môi trường lỏng khảo sát đồ thị biểu diễn hàm sinh khối theo thời gian nuôi cấy - Xác định đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian pha log, thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào pha ổn định BÀI 3: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PROTEIN, TINH BỘT VÀ CELLULOSE Vi sinh vật vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi có khả sinh enzyme ngoại bào nhờ chúng thủy giải chất tự nhiệ protein, tinh bột, cellulose, hemicellulose để thành thành phần đơn giản cho trình hấp thu dinh dưỡng chúng 3.1 Nguyên tắc Cấy chấm điểm vi sinh vật lên môi trường thạch có chứa chất tương ứng (đối với enzyme cellulose, sử dụng chất Carboxymethyl cellulose (CMC); enzyme amylase, sử dụng chất tinh bột tan) Sau thời gian nuôi cấy điều kiện nhiệt độ thích hợp, khuẩn lạc vi sinh vật hình thành, enzyme tổng hợp tiết môi trường thủy phân chất tạo thành vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc Dựa vào hiệu số đường kính vòng thủy phân đường kính khuẩn lạc, ta đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme (cellulose, amylase) loài vi sinh vật quan tâm - Để quan sát rõ vòng thủy phân, sử dụng thuốc nhuộm protein (Amido – Black) Dựa vào việc có xuất vòng thủy phân ta xác định hoạt tính sinh enzym protease - Để quan sát rõ vòng thủy phân khả thủy phân tinh bột cellulose sử dụng thuốc thử lugol Ngoài ra, sử dụng dịch chiết enzyme thô vi sinh vật tiết môi trường lỏng, sử dụng phương pháp đục lỗ thạch xác định hoạt tính enzyme thông qua hiệu số đường kính vòng thủy phân đường kính lỗ thạch 3.4 Thực hành 3.4.1 Chuẩn bị: - Môi trường: Chuẩn bị môi trường chọn lọc thích hợp chủng vi sinh vật, thay nguồn carbon protein (gelatin cazein), tinh bột, cellulose  Nuôi cấy Tiến hành cấy chấm điểm khuẩn lạc vào đĩa Petri có bổ sung môi trường tương ứng trên, đĩa cấy vị trí (tạo thành tam giác đều) Nuôi đĩa cấy 300C, qua đêm 3.4.2 Quan sát ghi nhận kết Để tính toán đường kính thủy phân, ta đổ thuốc thử lên mặt thạch, tráng Môi trường có màu xanh đậm (hoặc tím tinh bột kết hợp với iod), nâu tím (cellulose kết hợp với iod) vòng thủy phân xung quanh vị trí cấy khuẩn lạc không màu d D Khi ghi nhận kết quả, cần đo đường kính khuẩn lạc d (mm), đo đường kính thủy phân D (mm) Tính hiệu số D-d (mm) BÀI HIỆN TƯỢNG LÊN MEN CỦA VI SINH VẬT Vi sinh vật sử dụng nhiều chất hữu khác để thu lượng, trình phân giải hợp chất hữu oxy gọi trình lên men Tùy sản phẩm cuối trình lên men để gọi tên chúng như: lên men etylic, lactic, acetic I LÝ THUYẾT CHUNG 4.1 Lên men etylic Trong trình này, đường bị biến đổi thành rượu Etylic CO2, đồng thời sản sinh lượng C6H12O6 + H3PO4 → CH3CH2OH + H2O + CO2 + FDP Nhiều vi sinh vật có khả lên men rượu, mạnh nấm men (Saccharosemyces) Ngoài ra, số nấm mốc Mucor vi khuẩn (Sarcrina ventriculi) có khả lên men, nồng độ etanol không cao Quá trình lên men thực với chất khác đường như: phế thải gỗ, ngũ cốc, khoai củ, hoa quả, rỉ đường 4.2 Lên men lactic Trong trình đường bị biến đổi thành acid lactic Có kiểu lên men lactic: đồng hình dị hình - Lên men lactic đồng hình: sản phẩm acid lactic (90%), lượng nhở acid bay hơi, rượu etylic sản phẩm khác - Lên men lactic dị hình: acid lactic, lượng đáng kể acid acetic, rượu etylic, CO2 4.3 Lên men acetic Là trình oxy hóa rượu etylic CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O + Năng lượng Vi khuẩn lên men acid acetic thuộc nhóm: Acetobacter Acetomonas Nhiều loài phát triển lâu môi trường dễ sinh hình thái đặc biệt như: tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh - A aceti: hình que, xếp thành chuổi, có khả phát triển nồng độ rượu cao (11%) Nhiệt độ thích hợp 34 ºC - A pasteurianum: Hình que, xếp thành chuổi dài, tạo váng khô nhăn nheo, bắt màu xanh với iod - A.orleance: hình que, nhỏ, dị hình không di động, tạo váng dày chất, có khả phát triển nồng độ rượu cao (10 -12%) tích lũy 9.5% acid acetic - A xylinum: hình quem không di động, tạo váng dày chất, có chứa nhiều hemmicellulose, đồng thời tích lũy 4,5 % acid acetic Đây loại vi khuẩn sống cộng sinh với nấm men thường gọi thủy hoài sâm, dùng Nga, Trung Quốc - A schutzenbachii: hình que dài, già tạo thành váng, không bền Có khả tích lũy 11,5% acid acetic, để sản xuất giấm theo phương pháp cột II THỰC HÀNH 4.4 Lên men bia Dùng nấm men để chuyển hóa chất có dịch lên men thành rượu CO2 số sản phẩm khác Trong trình lên men ảnh hưởng nhiệt độ thấp, áp suất cao số yếu tố khác xảy nhiều biến đổi dịch lên men để ta thu bia 4.4.1 Nguyên liệu - Dịch lên men gồm: malt đại mạch, gạo, hoa cao hoa houblon - Men giống - Dụng cụ đo nồng độ chất khô, Nhiệt kế, Bình tam giác loại, can nhựa, tủ lạnh, nồi, bếp điện, rá nhựa, nhiệt kế, vải 4.4.2 Tiến hành a) Chuẩn bị dịch lên men - Lấy 500g malt 200g gạo đem nghiền nhỏ Yêu cầu nghiền, giữ cho vỏ malt nguyên tốt, độ mịn vừa phải, gạo nghiền mịn malt - Lấy xác 150 g bột gạo 15 g bột malt cho vào nồi có đựng sẵn 800ml nước 30-32ºC (cho malt vào trước, cho gạo vào sau) Dùng đũa thủy tinh vức khuấy vừa nâng nhiệt hỗn hợp lên đến 72-75ºC (tốc độ nâng nhiệt 1ºC phút) giữ nhiệt độ khoảng 20- 25 phút Tiếp theo nâng nhiệt độ khôi dịch lên đến sôi cho sôi khoảng 30 phút - Song song với việc nấu gạo tiến hành chuẩn bị nồi malt ( bắt đầu nâng nhiệt để đun sôi nồi gạo lúc bắt đầu nâng nhiệt nấu nồi malt) Để chuẩn bị nồi malt cần 335 g bột malt cho vào nồi thứ (lớn nồi trên) có chứa sắn 1300ml nước 30-32ºC Dùng đủa thủy tinh vừa khuấy vừa nâng nhiệt hỗn hợp lên đến 50 -52ºC (tốc độ nâng nhiệt 1ºC/phút) giữ nhiệt độ khoảng 20 phút Tính toán cho lúc nồi gạo vừa đun sôi - Sau vủa khuấy nồi malt vừa đổ từ từ nồi gạo sang nồi malt phải ý khống chế nhiệt độ hỗn hợp đạt 60 -65ºC Giữ hỗn hợp nhiệt độ khoảng 30 phút Tiếp thoe nâng nhiệt lên 72ºC giữu đường hóa hoàn toàn ( dùng dung dịch iod để thử màu dung dịch thủy phân) - Sau đường hóa xong nâng nhiệt hỗn hợp lên 78ºC đem lọc qua vải Trong trình lọc, dùng nước nóng 78ºC để rửa bã Rửa nồng độ chất khô nước rửa vào khoảng 1% ngừng Nước lọc ban đầu nước rửa bã nhập chung (hỗn hợp gọi nước mout) phải trong, có nồng độ chất khô nhỏ nồng độ dịch lên men ban đầu 0,5 -1 % - Tiếp theo tiến hành đun sôi dịch đường với hoa houblon Lượng hoa sử dụng 1,5 g/l dịch đường Nếu sử dụng cao hoa 1g cao thay 5g hoa Để houblon hóa tất dịch đường cho vào nồi nâng nhiệt đun sôi Khi bắt đầu nâng nhiệt độ cho ¾ lượng hoa ¼ lại cho vào trược kết thúc trình đun sôi 30 phút Thời gian đun sôi keo dài 1,5-2 - Sau houblon hóa xong lọc nhanh để tách bã hoa làm nguội để thu dịch lên men Chú ý kiểm tra nồng độ dịch lên men bảo đảm theo yêu cầu b) Chuẩn bị giống men bia Sacharosemyces carlsbergensis Tuần tự thực sau: Ống giống gốc →ống nghiệm 10 ml →bình tam giác 50 ml → bình tam giác 250 ml Để nuôi cấy men giống dùng môi trường nước malt (100 %) có độ kho 10% Môi trường sau chuẩn bị xong phải trung kỹ làm nguội nhanh Ống nghiệm bình nhân giống phải rửa sấy khô Lấy 10 ml môi trường cho vào ống nghiệm Dùng que cấy khủa trùng làm nguội lấy vòng men giống cho vào ống nghiệm Đặt ống nghiệm cấy giống vào tủ ấm 25ºC nuôi 24 Sau chuyển toàn dịch giống cấp vào bình tam giác có sẵn 40 ml môi trường (trước chuyển cần lắc ống nghiệm để tránh nấm men bị lắng xuống đáy ống) Bình tam giác tiếp tục nuôi 25ºC 18 Chuyển toàn giống sang bình tam giác 500 ml có chúa 200 ml môi trường Tiếp tục nuôi bình giống 25ºC đến bề mặt xuất lớp bọt trắng mỏng chuyển vào can lên men c) Lên men - Dùng can nhựa lít để lên men Trước lên men can cần rửa sát trùng kỹ Dịch đường sau tách bã hoa houblon xong thẳng vào can (cho 750 ml dịch đường) làm nguội đến nhiệt độ lên men Sau cho hết men giống bình tam giác vào can giữ can nhiệt độ lên men thích hợp để tiến hành lên men - Trong trình lên men cần lấy mẫu để theo dõi giảm chất khô ngày Khi nồng độ chất khô lại giảm 0,2% ngày đêm lớp bọt bề mặt can xẹp xuống coi trình lên men kết thúc Khi thu sản phẩm gọi bia non - Lấy bia non đổ đầy chai đóng chặt nắp đặt vào tủ lạnh nhiệt độ 1-2ºC để tiến hành lên men phụ Quá trình lên men phụ kéo dài 20 ngày bia chai 4.4.3 Tính toán kết - Tính hiệu xuất nấu bia (dịch lên men) Để đánh giá trình thủy phân tác dụng enzyme phải xác định % chất khô chuyển vào dịch lên men, so với lượng nguyên liệu ban đầu hay nói cách khác phải xác định hiệu xuất chiết E: - E - % chất khô chuyển vào dịch lên men V - Thể tích dịch đường sau lọc ɳ - Nồng độ dịch đường % d - Khối lượng riêng dịch đường kg/l G - Khối lượng nguyên liệu dùng để nấu bia kg 0,96 hệ số hiệu chỉnh cho việc giảm thể tích dịch đường làm nguội Tính độ lên men: tiêu quan trọng để đánh giá trình lên men, tính công thức sau: V- Độ lên men % E – Nồng độ chất khô có dịch lên men ban đầu e – Nồng độ chất khô có bia non bia thành phẩm Bài 5: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG BIA Nhằm đánh giá chất lượng bia sản xuất, từ so sánh với loại bia khác 5.1 Xác định hàm lượng CO2 bia - Nguyên tắc: Cho CO2 có bia tác dụng với thể tích NaOH đủ tạo muối Na2CO3 Sau loại trừ lượng xút dư, dùng axit sulfuric có nồng độ xác định để chuẩn lượng Na2CO3 Từ tính lượng CO2 có bia - Dụng cụ hóa chất: Bình tam giác 250 ml, bình tam giác nút mài 200ml, 250ml, buret dung tích 25ml, pipet, ông đong 50 ml, 250ml, Dung dịch NaOH 2N, Dung dịch H2SO4 0,1N, Phenolphtalein 1% cồn 60°, dung dịch metyl da cam cồn 60° - Tiên hành: Để đảm bảo tính xác tiến hành phân tích phải chuẩn bị dụng cụ mẫu làm thí nghiệm + Chuẩn bị mẫu: Giữ chai bia tủ lạnh ngày đêm bể đá Chuẩn bị bình tam giác có nút mài dung tích 250ml Rót vào bình 10 ml NaOH 2N Mở chai bia mẫu nhẹ nhàng, rót nhanh đến mức 100-150ml Đậy nút bình lắc – 10 phút Để yên phút Rót toàn vào ống đông đọc xác kết (B) + Tiến hành thử: Dùng pipet hút xác 10 ml bia vừa chuẩn bị cho vào bình tam giác 250ml, thêm 50ml nước cất 1-3 giọt phenolphtalein , dung dịch có màu hồng Dùng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn độ lượng xút dư dung dịch màu hồng không tính lượng axit tiêu tốn lúc Thêm 1- đến giọt metyl da cam, dung dịch chuyển sang màu vàng Tiếp tục chuẩn độ H2SO4 0,1N dung dịch chuyển thành màu da cam, ghi thể tích H2SO4 tiêu tốn (V1) Song song với mẫu thí nghiệm phải tiến hành mẫu trắng cách lấy 10 ml bia loại bỏ hết CO2 cho vào bình nón thêm 1ml NaOH 2N 50 ml nước cất tiến hành phân tích tương tự mẫu thật - Tính toán kết quả: Hàm lượng CO2 có bia (g/l) tính theo công thức sau: X: hàm lượng CO2, g/l 0,0044: Số gam CO2 tương ứng với 1ml dung dịch H2SO4 0,1N B: Thể tích bia kiểm hóa, ml V1, V2: thể tích dung dịch H2SO4 0,1N tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử mẫu trắng, ml 1000: hệ số chuyển đổi lít 10 thể tích mẫu bia lấy kiểm tra, ml 10: thể tích dung dịch NaOH 2N dùng để kiểm hóa mẫu bia, ml 5.2 Xác định độ chua bia - Nguyên tắc: Dùng xút để chuẩn độ lượng axit có bia với chất thị phenolphtalein Độ chua bia tính số ml NaOH 0,1N dùng để trung hòa 10 ml bia loại CO2 - Nguyên liệu: Bia loại bỏ CO2, Dung dịch NaOH 0,1N, Chỉ thị phenolphtalein 1%, Nước cất vô trùng, bình nón 100ml, buret, pipet - Tiến hành: Dùng pipet lấy 10ml bia cho vào bình nón 100ml, thêm 40ml nước cất, giọt phenolphtalein chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N chuẩn bị sẵn buret, xuất màu hồng nhạt Thể tích NaOH tiêu tốn chuẩn độ độ chua bia 5.3 Xác định hàm lượng rượu bia ( sử dụng cồn kế) - Nguyên tắc: Việc thực đo độ cồn nước dễ dàng Người sử dụng cần lấy cồn kế thả rượu hay cồn vào độ chìm/nổi cồn kế mà đọc số vạch Tuy nhiên, số độ cồn xác nhiệt độ thích hợp (18-20 °C), nhiệt độ đó, độ cồn cồn kế không xác tuyệt đối gọi độ cồn biểu kiến - Dụng cụ hóa chất: Cồn kế, ống sinh hàn thẳng, bình định mức 100 ml, cốc 100ml, ống đong 100ml, đèn cồn - Tiến hành: + Dùng pipet hút 100-150ml bia loại CO2 cho vào bình đun, lắp ống sinh hàn thẳng, chưng cạn bình Dung dịch chưng hứng vào bình định mức dung tích 100ml, định mức đến 100ml Cho bình tam giác cốc 100ml, thả cồn kết vào, đọc kết Bài 6: BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT Giống phân lập qua khảo sát, cần phải giữ thời gian định, để tiếp tục nghiên cứu sản xuất Tùy theo mục đích sử dụng mà cách bảo quản khác nhau: Giữ ngắn hạn giữ dài hạn 8.1 Nguyên tắc Làm chậm trình hô hấp trao đổi chất vi sinh vật, đồng thời ngăn cản sinh sản chúng Phương pháp giữ giống gồm bước: Bước 1: Chọn chủng điều kiện giai đoạn tối ưu cho bảo quản Bước 2: Chọn phương pháp thích hợp cho bảo quản 8.2 Chọn chủng - Đối với vi khuẩn nấm men: nuôi cấy môi trường đặc để có khuẩn lạc riêng rẽ Chọn khuẩn lạc hình dạng không tạp nhiễm - Đối với xạ khuẩn nấm sợi: tơ mọc mạnh, phân nhán đều, màu sắc sáng bình thường không tạp nhiễm - Ngoài ra, chọn gia đoạn thích hợp chu trình sống để bảo quản, như: tế bào dinh dưỡng hay bào tử tiềm sinh 8.3 Các phương pháp giữ giống Các phương pháp thường sử dụng: - Giữ giống môi trường thạch môi trường thạch có lớp dầu khoáng - Giữ giống đất cát loại hạt - Giữ giống phương pháp đông khô - Giữ giống phương pháp lạnh đông 8.3.1 Giữ giống môi trường thạch Cấy chuyền định kỳ môi trường thạch biện pháp giữ giống Tuy nhiên, cách giữ thời gian ngắn (vài tuần đến 1- tháng) Ngoài ra, việc cấy chuyền nhiều lần môi trường thạch làm thoái hóa giống Để kéo dài thời gian, đặt ống thạch giống nhiệt độ thấp (12-15ºC) phủ lên môi trường thạch lớp dầu khoáng, paraffin lỏng hay glycerol Với cách môi trường chậm khô vi sinh vật chậm trình biến dưỡng hô hấp 8.3.2 Giữ giống cát hạt - Giữ giống cát: Thường áp dụng cho nhóm nấm tạo bào tử tiềm sinh Cát xử lý cách ngâm acid sulfuric đậm đặc khoảng Rửa liên tục nước pH đạt trung tính Sau rây để chọn có đường kính trung bình từ -1,5 mm Nếu giữu ống nghiệm, cho vào đáy ống lớp thấm dày 5-7mm Cho cát vào đến ống, phủ lên bề mặt lớp dày mm Nhỏ giọt môi trường dinh dưỡng bề mặt lớp cho thấm dần xuống cát vừa đến lớp ngừng lại Hấp khử trùng 121ºC/60 phút Để nguội cấy giống Giống mọc lan qua cát hình thành bào tử Phủ mặt nút ống nghiệm paraffin đặc bảo quản nhiệt độ thường Thời gian giữu giống kéo dài vài năm - Giữ giống hạt: thường dùng nuôi cấy giữ nấm sợi Hạt sử dụng hạt lúa mì lúa gạo, nấu cho nứt nanh Chia vào ống nghiệm, đáy để lớp nút bông, mặt phủ lớp nút khác (tương tự cát) Thêm môi trường dinh dưỡng khử trùng 121ºC/90 phút Cấy giống chờ tơ nấm lan đầy phủ miệng ống nghiệm (phía nút bông) paraffin đặc Giữu nhiệt độ mát hay phòng Thời gian bảo quản năm 8.3.3 Giữ giống phương pháp lạnh sâu  Nguyên tắc: Dựa sở phát triển vi sinh vật bị ức chế nhiệt độ lạnh sâu  Cách tiến hành: Nuôi vi sinh vật môi trường tăng sinh cuối giai đoạn logarit thu tế bào Để bảo vệ vi sinh vật không bị chết nhiệt độ lạnh sâu tinh thể nước gây phải trộn vi sinh vật vào chất bảo vệ sau đây: Bảng 2.1 Dung dịch nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng Chất bảo vệ Nồng độ Glucose 10% Lactose 10% Glycerol 15% Sữa gầy 10% Saccarose + gelatin 10% + 1,5% Không chất bảo vệ - Trộn vi sinh vật với chất bảo vệ chuẩn bị sẵn Hút dịch tế bào cho vào ống nghiệm, đậy nút lại Sau đưa vào bảo quản nhiệt độ -200C Sau thời gian bảo quản định kì hoạt hoá trở lại để kiểm tra tỉ lệ sống sót hoạt tính giống sau bảo quản 8.3.4 Giữ giống phương pháp đông khô Bằng thiết bị sấy đông khô, người ta làm đông nhanh tế bào -20ºC đến -40 ºC, sau cho bốc nước điều kiện chân không NHư lấy nước tế bào, không làm thay đổi hình dạng chúng Lúc tế bào ngừng sinh sản trao đổi chất Kết chúng chịu môi trường tốt Phương pháp giữu giống tương đối lâu, vài chục năm  Nguyên tắc: Làm lạnh sâu môi trường nhũ hoá vi sinh vật, sau làm thăng hoa phần nước có môi trường nhũ hoá điều kiện chân không  Cách tiến hành: Nuôi vi sinh vật môi trường thích hợp cuối giai đoạn logarit, thu tế bào trộn chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân 0,2ml huyền phù vi sinh vật vào ống đông khô chuyên dùng loại Ø 10mm Ø 35mm Các ống đông khô chứa vi sinh vật sau lạnh đông nhiệt độ -20ºC vài Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô thiết bị đông khô, thời gian làm khô tuỳ thuộc vào thiết bị số lượng giống cần làm khô, trung bình – 14 Sau ống đông khô hàn kín Bảo quản mẫu đông khô tủ lạnh 8.4 Thực hành 8.4.1 Nguyên liệu - Giống vi sinh vật nghiên cứu - Môi trường dinh dưỡng tương ứng (môi trường lỏng đặc) - Dung dịch glycerol (vô trùng) 8.4.2 Đối với nấm men - Bảo quản ống thạch nghiệm: Nuôi cấy giống nấm men môi trường Hansen ngày nhiệt độ thường Bảo quản tủ 2-15ºC - Bảo quản glycerol: ống giống nấm men ngày tuổi hòa với 1ml nước muối sinh lý để tạo huyền phù tế bào (hoặc nuôi cấy lắc tế bào nấm men môi trường lỏng, sau ngày) Lấy 0,5 ml dịch tế bào nấm men cho vào ống eppendorf, thêm 0,5ml glycerol 40% (đã vô trùng) Bảo quản tủ -20ºC 8.4.3 Đối với nấm mốc - Bảo quản thạch: Nuôi cấy giống môi trường PGA ngày nhiệt độ phòng Bảo quản trung tủ 2-15 ºC - Bảo quản glycerol: ống giống nấm mốc ngày tuổi hòa với 1ml nước muối sinh lý để tạo huyền phù tế bào Lấy 0,5 ml dịch bào tử cho vào ống eppendorf, thêm 0,5ml glycerol 40% (đã vô trùng) Bảo quản tủ -20ºC 8.5 Báo cáo kết Nộp ống thạch giống glycerol TÀI LIỆU THAM KHẢO Thực tập VI SINH CƠ SỞ, NXB Đại học quốc gia TP HCM Phan Thị Bích Ngọc (1997 ), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến lên men bia hàm lượng diacetyl bia non, Luận án Thạc sỹ Khoa học kỹ thuật Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất giáo dục Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh_Tập III_Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm Công nghệ sinh học, tập 2, NXB, Đại học Quốc gia TP.HCM ... 6: Bảo quản giống vi sinh vật Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh vi n xem kỹ tất thí nghiệm, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM Buổi 1(Bài... QUY TẮC LÀM VI C TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Quy tắc làm vi c phóng thí nghiệm vi sinh vật - Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp vệ sinh phòng thí nghiệm - Mỗi người nhóm có nơi làm vi c riêng,... đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài 2: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng chủng vi sinh vật Bài 3: Hiện tượng lên men vi sinh vật Bài 4: Vi sinh vật phân giải tinh