berculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa ápberculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa ápberculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa áp
BÀI DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH I Dụng cụ thiết bị Các dụng cụ thủy tinh - Ống nghiệm: dùng để chứa mơi trường ni cấy VSV, có nút bơng gịn khơng thấm nước hay nhựa - Hộp lồng (đĩa Petri): đường kính thường sử dụng 10 cm - Ống hút (pipettes) - Becher (cốc) - Erlenmeyer (bình tam giác) Các dụng cụ khác - Dây cấy thẳng: dùng cấy sâu ly trích VSV mơi trường đặc - Dây cấy vòng: dùng cấy ria VSV môi trường thạch phân lập VSV môi trường lỏng mơi trường đặc - Dây cấy móc: dùng cấy nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn - Tủ ấm: ấp VSV theo dõi sinh trưởng VSV theo nhiệt độ - Lò Pasteur - Lò hấp (autoclave) - Nồi chưng cách thủy II Các phương pháp khử trùng phịng vơ trùng Định nghĩa: vật phẩm coi vơ trùng khơng cịn mang mầm VSV Diệt trùng phương pháp vật lý hóa học Diệt trùng phương pháp vật lý: - Nhiệt, lọc, xạ, âm ba siêu âm a Nhiệt: Tế bào sinh dưỡng VSV bị giết chết dễ dàng bào tử chúng không bị tiêu diệt nhiệt độ Tính chất mơi trường, số lượng VSV, pH môi trường ảnh hưởng đến kháng nhiệt VSV Phải xác định: - Điểm chết nhiệt: nhiệt độ thấp để giết chết VSV 10 phút - Thời gian ngắn để giết chết VSV nhiệt độ thấp Có thể diệt trùng nhiệt khơ, nhiệt ẩm Nhiệt khơ (lị Pasteur tủ sấy): - Làm khô vi trùng oxy hóa cấu tử chúng - Khử dùng dụng cụ kim loại hay thủy tinh - Khi dùng tủ sấy: Nhiệt độ lị sấy lên đến 180oC Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 180oC 30 phút 160oC Tắt lò, để nguội 80oC mở cửa tủ - Hơ lửa: dây cấy, kéo, kẹp, …, nhúng vào ancol đốt, làm nhiều lần Nhiệt ẩm: - Ưu điểm: làm nóng nhanh, nóng thấm sâu vào phẩm vật cho ẩm nhiều VSV bị giết chết protein đơng kết lại Bảng 1.Nhiệt độ thời gian diệt trùng nhiệt ẩm: Nhiệt độ diệt trùng Tế bào sinh dưỡng Bào tử Vi sinh vật Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Nấm men 50 -70 -10 70 – 80 -10 Nấm mốc 60 – 10 70 -10 VSV khơng có 60 -70 -10 bào tử VSV có bào tử 60 -70 -10 120 12 Siêu vi trùng 60 -70 -10 - Phép hấp Pasteur: Căn thời gian nhiệt độ diệt trùng Mycobacterium tuberculosis chết 62oC 30 phút Phép diệt trùng diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử vi trùng hoại sinh Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất sản phẩm - Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi diệt tế bào sinh dưỡng Thời gian phút - Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết hay chất dễ biến tính với nhiệt độ Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 -80oC, lần đun liên tiếp ngày - Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học khơng chịu nhiệt độ 100oC Có thể dùng autoclave ln mở khóa hơi, nhiệt độ không vượt 1000C Đun 30 phút đến - Hơi nước bão hòa áp suất cao (autoclave) b LỌC: Vật phẩm không chịu nhiệt độ 600C Cho vật phẩm qua màng lọc xốp mà lỗ có đường kính nhỏ đường kính VSV nhỏ Màng xốp: sứ, amiante, cellulose, … c BỨC XẠ Tia tử ngoại: tia UV, diệt trùng bề mặt Tia âm cực: diệt trùng dụng cụ bao gói, thực phẩm, thuốc, … d ÂM BA SÓNG SIÊU ÂM: Cường độ lớn thời gian vừa đủ làm vỡ màng tế bào nội chất VSV chảy Dùng kĩ thuật chủ yếu phá vỡ tế bào diệt trùng e PHỊNG VƠ TRÙNG (PHỊNG CẤY) Đảm bảo vơ trùng, đèn tử ngoại mở liên tục Đèn tắt trước cấy Phịng có dụng cụ chổi, giẻ lau riêng thường xuyên khử trùng Ngun tắc chung phịng vơ trùng cấy bầu khơng khí hạn chế diện VSV bào tử chúng - Kiểm sốt vơ trùng: để 370C 24 Diệt trùng phương pháp hóa học: Phân loại diệt trùng phương pháp hóa học dựa đặc điểm: - Tính chất vật cần sát trùng, thuốc sát trùng dụng cụ dùng cho da - Loại VSV cần khử Một chất diệt trùng mạnh chất diệt nấm yếu Một chất diệt siêu vi trùng khơng tác dụng với nấm - Cần ấn định rõ điều kiện tổng quát nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ Dung dịch Phenol – 5%: phun phòng để tẩy trùng, không tiếp xúc trực tiếp với da Bào tử siêu vi trùng đối kháng mạnh tế bào sinh dưỡng, tính sát trùng giảm nhiệt độ thấp diện savon Ancol etylic 70 – 80%: sát trùng da, tác động đông kết protein Iode: tác dụng lên hầu hết loại vi trùng, diệt nấm siêu vi trùng Chlor hợp chất chlor: tẩy uế nước, sàn nhà Dung dịch AgNO3 0,1%: tác dụng lên hầu hết vi trùng Dung dịch CuSO4: tác dụng lên mốc vi trùng, dùng sát trùng nước Phẩm màu: số phẩm màu ngăn chặn tăng trưởng vi khuẩn Gram âm Các chất khác: - H2O2: sát trùng tính chất acid hóa - KMnO4: sát trùng tính oxit hóa - Các chất khí sát trùng: dùng sát trùng dụng cụ plastic THỰC HÀNH: - SV quan sát thiết bị dụng cụ - Làm nút ống nghiệm, nút erlen gịn khơng thấm nước - Gói đĩa Petri - Học cách sử dụng autoclave, tủ sấy, tủ cấy, tủ ủ - Khử trùng dụng cụ, que cấy BÀI MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG I II Khái niệm chung - Môi trường dinh dưỡng đặc lỏng - Dùng để phân lập, nuôi cấy, bảo quản VSV - Yêu cầu: môi trường dinh dưỡng phải chứa đủ chất dinh dưỡng cần thiết hoạt động sống loại VSV đảm bảo đủ điều kiện lý, hóa thích hợp (pH thích hợp, oxy hóa khử thích) trao đổi chất tế bào VSV với môi trường, khơng chứa chất độc hại với VSV hồn tồn vơ trùng - Q trình trao đổi chất VSV gồm: trình xây dựng trình trao đổi lượng - Để thiết lập môi trường tổng hợp cần phải biết rõ nhu cầu VSV chất dinh dưỡng đặc điểm trao đổi chất chủ yếu chúng Nồng độ chất dinh dưỡng đưa vào phải thích hợp để trì mức độ cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào VSV - Gọi tên môi trường dinh dưỡng cách dựa vào tên người tìm (ví dụ mơi trường Hansen) theo nguồn chất dinh dưỡng (ví dụ PGA: potato – dextrin– agar) Nguyên tắc Tùy theo yêu cầu nghiên cứu học tập Ví dụ: nuôi VSV để quan sát đặc điểm đại thể phải chuẩn bị môi trường đặc Tùy theo nhu cầu dinh dưỡng VSV Xét số ví dụ: III - Nghiên cứu chuyển hóa nitrogen mơi trường ta cho chất có nitrogen vào - Nghiên cứu VSV phân giải cellulose ta cho giấy cellulose vào môi trường - Trong điều kiện nghiên cứu tác dụng kích thích số chất biotin, ta cho biotin vào môi trường - Muốn ức chế vi khuẩn môi trường ta cho vào môi trường chất kháng sinh Cho streptomycin vào môi trường Martin để phân lập nấm men, nấm mốc; streptomycin có tác dụng ức chế tăng trưởng vi khuẩn Phân loại Thành phần - Mơi trường tự nhiên: dùng mơi trường có sẵn tự nhiên sữa huyết thanh, khoai tây, cám, đường, … Ưu điểm: có sẵn Nhược điểm: khơng ổn định - Mơi trường tổng hợp: dùng hóa chất có thành phần hóa học xác định - Mơi trường bán tổng hợp: dùng sản phẩm tự nhiên, thêm số hóa chất Tính chất lý học: - Mơi trường lỏng - Môi trường đặc: chứa 1,5 – 2% agar 10 -20% gelatin - Môi trường bán lỏng (bán đặc): 0,35 – 0,7% agar Công dụng - Môi trường chọn lọc: đảm bảo phát triển ưu loại nhóm VSV xác định Ví dụ: mơi trường dùng để phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn cố định đạm, … - Môi trường kiểm định: cho phép phân biệt số đặc điểm số VSV cần xác định Thường bổ sung thêm số chất thị màu số chất giúp tạo phản ứng màu để quan sát thấy Ví dụ: mơi trường lên men đường, mơi trường thạch chì, môi trường khử khả sinh indol, … IV Cách làm mơi trường Cẩn thận, xác theo thứ tự sau: Pha chế - Môi trường lỏng: cân, đong xác thành phần mơi trường hịa tan vào nước - Mơi trường thạch: cân, đong xác thành phần mơi trường hịa tan vào nước agar, đun tan Lọc: cần phải để dễ quan sát Môi trường lỏng: lọc qua vải nhiều lớp, qua thấm, qua giấy lọc Môi trường đặc: lọc qua vải lớp điều kiện có phểu lọc nóng Điều chỉnh pH môi trường: thường dùng HCl 10% NaOH 10% NH3 25% số chất khác Sử dụng máy đo pH để kiểm tra xác dùng chất thị màu Phân phối mơi trường vào dụng cụ 1.Erlen, bình cầu: phân phối 1/3 ẵ th tớch bỡnh 2.ng thch nghiờng: ẳ chiều cao ống 3.Ống thạch đứng: 1/3 – 2/3 chiều cao ống Khử trùng môi trường Làm thạch nghiêng: sau khử trùng xong, đặt ống nghiệm giá gỗ que thủy tinh giá kim loại … cho thạch ống nghiêng tới 2/3 chiều cao ống, không chạm nút V VI Các loại môi trường - Môi trường phân lập nấm men, nấm mốc (Martin): Glucose 10g, Pepton 5g, KH2PO4 1g, MgSO4 0.5g, Rose Bengal 1/3000: 100mL, thạch 20g, nước máy vừa đủ 1000mL, streptomycine 0.03g (chú ý cho Streptomycine trước đổ vào đĩa Petri) - Môi trường nuôi cấy nấm men (Hansen): Dextrin 50g, pepton 10g, KH2PO4 3g, MgSO4 3-5g, Thạch 20g, nước cất vừa đủ 1000mL, pH - Môi trường nuôi cấy nấm mốc (Czapek): saccharose 30g, NaNO3 3g, KH2PO4 0.4g, FeSO4 0.01g, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH - Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient Agar – NA): Thực hành: SV điều chế môi trường cần dùng cho học BÀI PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Để nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa VSV cần phải sử dụng dạng VSV khiết.VSV khiết giống VSV tạo từ tế bào ban đầu.Quá trình phân lập gồm bước: Tạo khuẩn lạc riêng lẻ từ quần thể VSV tự nhiên (đất, nước, khơng khí, mẫu vật, bệnh phẩm, …) Phân lập VSV khiết Kiểm tra độ khiết Tạo tế bào riêng lẻ mơi trường phân lập Pha lỗng mẫu vật cần phân lập Cấy mẫu pha loãng mơi trường đặc trưng cho nhóm VSV xác định 1) Phân lập môi trường đặc hiệu 1.1) VSV hiếu khí hiếu khí tùy ý - Dùng phương pháp cấy ria mặt thạch đĩa Petri - Ủ VSV nhiệt độ thích hợp khoảng 24 Có thể nhận khuẩn lạc riêng lẻ 2.2) VSV kỵ khí - Dùng mơi trường đặc ống nghiệm chưng cách thủy để loại khơng khí môi trường, để nguội đến 45 0C - Nhỏ giọt dịch vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường, đậy nút lại, vortex đều, sau rót vào đĩa Petri vơ trùng, nhanh chóng dàn đĩa Petri để hạn chế tối đa khơng khí cịn bên đĩa - Sau đó, dùng paraffin trám lại, ủ nhiệt độ thích hợp.Sau vi khuẩn phát triển, dùng que cấy cắt môi trường, lấy khuẩn lạc riêng lẻ cho vào mơi trường lỏng thích hợp 2) Kiểm tra độ tinh khiết Bằng mắt, kính hiển vi, cách cấy vào môi trường thạch đĩa Petri Thực hành: Phân lập VSV tinh khiết từ ống hỗn hợp VSV BÀI CẤY VI KHUẨN I II III IV V Định nghĩa Cấy chuyển vi khuẩn từ mơi trường chúng sống mơi trường để chúng tiếp tục phát triển điều kiện thuận lợi Mục đích: Bảo tồn vi khuẩn ni khiết Ly trích vi khuẩn thiên nhiên Nghiên cứu tính chất sinh học Dụng cụ Để cấy - Dây cấy: dây cấy thẳng, dây cấy vòng, dây cấy dẹp có móc - Pipette: dùng để cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng Chứa môi trường - Đĩa Petri - Ống nghiệm - Bình cầu, bình tam giác Điều kiện thuận lợi Để tránh tạp nhiễm khuẩn khác cần thực nơi làm vơ trùng Trong phịng vơ trùng Hoặc chọn nơi: sạch, không bám bụi hay mầm vi khuẩn, kín gió, thực cấy nhanh, gần đèn cồn khoảng -10cm, cầm ống nghiệm nghiêng ngang thật nhiều, khơng trị chuyện làm việc, diệt trùng thật kỹ dụng cụ Phương pháp cấy Thực theo thứ tự: Sắp xếp dụng cụ - Lau bàn, rửa tay - Khử trùng lại ancol - Ngồi đối diện đèn cồn - Giá ống nghiệm đặt bên trái (thuận tay phải) - Tất dụng cụ lại đặt bên phải (thuận tay phải) Chuẩn bị ống môi trường để cấy - Ghi tên vi khuẩn cần cấy ghi ngày cấy Thực cấy - Khử trùng đầu ống nghiệm mở nút - Tay phải cầm dây cấy: đốt dây cấy cho đỏ - Tay trái cầm ống nghiệm có vi khuẩn, tay phải nắm nút bơng ngón út cạnh bàn tay, tay trái xoay nhẹ ống nghiệm - Cho đầu dây cấy khử trùng vào tiếp xúc thành ống, dùng ngón thăm dò nguội, chấm đầu dây vào nơi có vi khuẩn, rút dây cấy khử trùng miệng ống nghiệm đóng nút bơng lại - Lấy ống môi trường, mở nút theo cách khử trùng miệng ống nghiệm Thực cấy Khử trùng dây cấy trước đặt xuống bàn ĐỐI VỚI VI KHUẨN HIẾU KHÍ Cấy vào mơi trường lỏng a) Từ môi trường lỏng sang lỏng: dùng pipette que cấy vịng b) Từ mơi trường đặc sang lỏng: dùng que cấy vịng Cấy vào mơi trường rắn a) Thạch sâu: dùng dây cấy thẳng b) Thạch nghiêng: dây cấy vòng c) Cấy vào đĩa Petri: dây cấy vịng ĐỐI VỚI VI KHUẨN KỴ KHÍ Ngun tắc: loại bỏ oxy khỏi môi trường giữ trạng thái yếm khí mơi trường, thêm vào mơi trường cysteine Na thiolycollate có tính khử - Phương pháp loại bỏ oxy:Đun sôi 20 phút để loại bỏ oxy a) Cách cấy vào thạch trịn: - Đun sơi thật lâu cho oxy bay hết tức lúc khơng cịn thấy bọt - Để nguội đến 45 -500C - Dùng dây cấy lấy vi khuẩn cho vào đáy ống nghiệm - Rút dây cấy theo đường xoắn ốc - Làm nguội nhanh cách cho vào nước lạnh - Để tránh tiếp xúc với khơng khí, cho vào paraffin Vaseline mặt b) Nếu cấy vào đĩa Petri: phải ủ bình kỵ khí (đã loại bỏ oxy) - ĐỐI VỚI NẤM MEN Giống vi khuẩn hiếu khí ĐỐI VỚI NẤM MỐC Dùng dây cấy có móc để trích khuẩn ty từ ống giống cấy vào môi trường VI Kết Quan sát sau 24 ủ nhiệt độ thích hợp Mơi trường lỏng: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường Môi trường đặc: vi khuẩn tạo vân nối mặt thạch Đối với nấm: sau 72 thấy sợi mảnh phát triển từ vết cấy Đối với vi khuẩn kỵ khí: phát triển đáy ống nghiệm lớp thạch trịn VII Thực hành Chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc): lỏng, nghiêng, sâu BÀI QUAN SÁT HÌNH THÁI ĐẠI THỂ, VI THỂ Quan sát đại thể - Ni cấy nhóm VSV môi trường thạch đĩa Petri - Quan sát, mơ tả hình dạng khuẩn lạc, màu sắc tố, bào tử, môi trường, … - Mở nắp hộp Petri đặt kính lúp kính hiển vi (vật kính 10X) Quan sát rìa mép khuẩn lạc, cấu tạo sợi cuống sinh bào tử II Quan sát vi thể - Làm tiêu phiến kính quan sát kính hiển vi Quan sát trạng thái sống - Quan sát VSV trạng thái tự nhiên hinh dạng cấu tạo, chuyển động, tăng trưởng phát triển a Phương pháp làm giọt ép - Dùng que cấy vòng pipette lấy giọt dịch tế bào vi khuẩn nấm men cho vào phiến kính Đậy kính lên trên, tránh bọt khí Quan sát kính hiển vi (vật kính 10X 40X) - Đối với nấm mốc xạ khuẩn phát triển hệ sợi Khi làm tiêu bản, khuẩn ty phải thấm ướt, đồng thời tách sợi rời ra, sau đậy kính lên - Dịch thấm ướt xạ khuẩn nước, nấm mốc phải lactophenol b Phương pháp giọt treo - Quan sát di động vi khuẩn - Nhỏ vi khuẩn vào kính, úp ngược kính vào phiến kính lõm, xung quanh vết lõm có lớp paraffin dán kính vào phiến kính Quan sát kính hiển vi c Phương pháp nhuộm màu trạng thái sống - Vi khuẩn, nhuộm xanh methylene 0,001 % - Với nấm mốc, dùng phẩm xanh methilen Loeffler Quan sát trạng thái nhuộm màu (nhuộm đơn) - Để nhìn rõ hình dạng đo kích thước tế bào VSV - Các bước tiến hành: Làm vết bôi: dùng que cấy lấy vi khuẩn tạo vết bôi giọt nước vô trùng Đối với xạ khuẩn nấm mốc: làm tiêu cách ni phiến kính Để khơ Cố định mẫu Hơ nhẹ phía phiến kính qua lửa đèn cồn đến lần nhỏ giọt cồn lên phiến kính hơ đốt Mục đích: giết chết tế bào sống, gắn chặt tế bào lên phiến kính, làm cho tế bào dễ bắt màu Với xạ khuẩn: cố định tế bào với dung dịch cacnua, rửa lại cồn 70% Sau đó, rửa lại nước Nhuộm màu: nhỏ vài giọt thuốc nhuộm xanh metilen 0,1% hay fushin lên vết bôi từ -2 phút Rửa nước, làm khơ Quan sát vật kính dầu Nhuộm Gram: I 10 Nguyên tắc:Vi khuẩn Gram dương có khả giữ phức chất tím kết tinh iot xử lý cồn Vi khuẩn Gram âm khơng có khả - Cách thực hiện: Dàn mỏng vết bôi: lấy vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm tạo vết bôi giọt nước vô trùng phiến kính Cố định nhẹ lửa đèn cồn Nhuộm tiêu tím kết tinh 60s Nhuộm lại lugol 60s Rửa nước Tẩy cồn 30s Rửa nước Nhuộm bổ sung Fuchsin hồng Safranin Rửa nước Làm khơ – soi kính với vật kính dầu Nhuộm bào tử: - Nguyên tắc: số vi khuẩn có khả hình thành bào tử Bào tử vi khuẩn có khả chịu điều kiện ngoại cảnh khơng thuận lợi Bào tử có hình trịn hình bầu dục Bào tử nằm tế bào đầu tế bào Đường kính bào tử khơng lớn đường kính tế bào vi khuẩn thường thuộc Bacillus, đường kính lớn thuộc Clostridium.Bào tử kháng nhuộm màu thông thường ăn màu khơng màu rửa - Cách thực (phương pháp schaeffer fulton): Làm vết bôi cố định lửa đèn cồn Nhuộm lục malachite 5%, hơ nóng 10 phút Rửa nước Nhuộm safranin 0.5% fuchsin 60s Rửa nước, làm khơ Soi kính với vật kính Kết bào tử bắt màu xanh lục, tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt Nhuộm vỏ nhày: - Nguyên tắc: số vi khuẩn tạo màng nhầy bên màng tế bào, gọi vỏ nhầy giáp mạc Azotobacter có vỏ nhày dày - Phương pháp Klett: Làm vết bôi, để khô tự nhiên khơng khí Nhuộm xanh methylene klett, hơ nóng đến bốc phút Nếu thuốc nhuộm khô phải bổ sung Rửa nước Nhuộm fuchsin klett giây Rửa nước làm khơ Soi kính với vật kính dầu - 11 - - - Kết quả: vỏ nhày nhuộm màu hồng, tế bào vi khuẩn nhuộm màu xanh Phương pháp làm âm đen: Fuchsin pha loãng gấp lần Mực tàu: nghiền nát phần mực tàu với phần nước, khử trùng 1210C/ 10 phút Để lắng tuần, lấy phần sử dụng Cho vài giọt fuchsin giọt dịch nghiên cứu lên phiến kính trộn đều, để yên – phút, thêm vài giọt mực tàu, trộn trải mỏng Để vết bôi khô Soi màu Kết quả: phiến kính có âm đen, vi khuẩn có màu hồng cịn vỏ nhầy khơng màu Phương pháp dùng mực xanh đen xanh thường làm âm bản: Làm vết bôi Để khô tự nhiên Nhuộm mực -10 phút Rửa vết bơi cồn 960C Để khơ Soi kính Kết quả: tế bào màu xanh, vỏ nhày không màu Phương pháp anton: Làm vết bôi để khô tự nhiên Nhuộm cristal violet phút Tẩy màu dung dịch CuSO4 2% Để khơ – soi kính Kết quả: vỏ nhầy khơng màu Vi khuẩn màu tím Vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí (test enzyme catalase H2O2) III Thực hành Mơ tả hình dạng, cấu tạo vi khuẩn môi trường thạch Xác định khả di động VSV Vẽ hình thái tế bào: vi khuẩn, nấm men, … 12 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT I.LÝ THUYẾT CHUNG: Các phương pháp định lượng vsv: Xác định trực tiếp : Đếm vsv ô buồng cầu Thu sinh khối Xác định gián tiếp: Đếm số khuẩn lạc phát triển bề mặt thạch phương pháp cấy trải,cấy ria, đổ đóa Đo mật độ quang OD Các bước chuẩn bị trước tiến hành định lượng vsv: 1.Lấy mẫu: Cần phải đáp ứng yêu cầu sau đây: Lấy mẫu phải có tính chất đại diện Lượng mẫu lấy phải vừa phải,đủ để phân tích đặc tính lý,hóa,sinh học dụng cụ lấy mẫu,chứa mẫu phải vô khuẩn Lấy mẫu xong phải phân tích khơng để q 24h Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu ghi vào số nhũng đặc diểm mẫu noi thu nhận mâũ 2.Pha loãng mẫu: 13 Nếu mẩu nghiên cứu trạng thái lỏng: -Hút 1ml mẫu nghiên cứu vào ống nghiệm thứ có chứa 9ml nước cất vô khuẩn -trộn dung dịch cách hút lên thổi xuống 3-5 lần nhờ bóp cao su gắn đầu pipet.độ pha lõang mẫu lúc 10-1 -tiếp tục hút 1ml ống nghiệm thứ cho vào ống nghuệm thứ hai chứa 9ml nước cất vô khuẩn -trộn độ pha lõang mẫu lúc 10-2 -Cứ tiếp tục dể có mẫu độ pha lõang 10-3 10-4 10-5 10-6… Tùy theo nồng độ vsv ước đóan mẫu mà tiến hành pha lõang mẫu với tỉ lệ khác 14 Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc Chuẩn bị bình tam giác có dung tích 250ml,bình thứ chứa 90ml nước cấtvơ khuẩn,bình thứ vơ khuẩn khơng chứa Vơ khuẩn cối chày sứ cách cho vào it cồn đốt lên.Sau để nguội Cân 1g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ nghiền mịn mẫu Dùng tòan nước bình thứ để chuyển tịan mẫu bình thứ hai.Thêm nước cất để điều chỉnh thể tích mẫu 100ml.Lắc phút,dể lắng 30 giây tiếp tục pha lõang mẫu mẫu trạng thái lỏng tùy theo ước đóan số lượng vsv 1.Phương pháp xác định trực tiếp: 15 1.1.ĐẾM VSV TRÊN Ô BUỒNG CẦU: Hình 6.1: Buồng đếm hồng cầu Cấu tạo buồng đếm: Là phiến kính day hình chữ nhật,giữa phần lõm phẳng,có kẻ lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng 1mm2(hình6.1) Ô trung tâm có 25 ô vuông lớn,mỗi ô vuông lớn gồm 16 ô vuông nhỏ.vì ô vuông nhỏ có diện tích 1/(25x16)=1/400mm2 ô vuông lớn 1/25mm2 Có loại buồng đếm Thomas Malassez 16 Phương pháp áp dụng : Đối với vsv dạng đơn bào,đứng riêng lẻ có kích thước lớn ta sử dụng buồng đếm kính hiển vi để định lượng số tế bào mẫu Sử dụng để theo dõi sinh trưởng vsv trình lên men thực môi trường lỏng,không áp dụng để kiểm tra hàm lượng vsv mẫu thực phẩm Nhược điểm phương pháp : Chỉ dùng định lượng nấm men vi khuẩn cịn nấm sợi xạ khuẩn có kích thước nhỏ ta khơng thể dùng Các tiến haønh: Đậy lam sát lên buồng dếm đổ dịch mẫu lên khe hở cho mẫu loang dều sau quan sát KHV vật kính x10 để tìm ô lớn x 40 để tìm ô nhỏ,dếm số tế bào nhỏ buồng đếm Cách chọn ô lớn để đếm :5 ô lớn liên tiếp nằm đường chéo buồng đếm ô góc buồng đếm Cách đếm:đếm số lượng vsv ô lớn,nếu có tế baò nằm biên giới ô liên tiếp ta đọc cạnh liên tiếp ô ví dụ hình 6.2 a b ô lớn Hình 6.2:Cách đếm theo đường chéo (a)và chọn cạnh góc bên trái củ ô lớn(b) 17 Để việc định lượng xác cần pha lõang mẫu nồng độ thích hợp cho số tế bào vsv ô lớn buồng đếm nằm khỏang 25-250 tế bào Cách tính kết quả: Số tế bàocó 1ml mẫu ban đầu tính theo cơng thức: N=a.1000.F h.S a:số tế bào trung bình nhỏ h:chiều cao buồng đếm(mm) S:diện tích đếm(mm2) 1000:hệ số chuyển đổi từ mm3 sang ml(1000mm3=1 ml) F: hệ số pha lõang mẫu trước đếm 1.2.PHƯƠNG PHÁP BREED Đây phương pháp đếm tế bào vết bôi cố định nhuộm màu.Phương pháp thường dùng dể xác định nồng độ vi khuẩn q trình lên men sử dung mơi trường lỏng tế bào dạng riêng lẻ Hóa chất: cồn 96% Dung dich xanh metylen Thực hiện: Pha lõang mẫu chứa vsv nước vô khuẩn Lắc mẫuthật lấy xác 0.01ml lên phiến kính kẻ sẳn có s=1cm2 Thêm vào mẫu giọt dung dịch agar 0.03% ,dùng que cấy vô trùng trộn thật nhanh mẫu.Vết bôi làm khô khơng khí Nhỏ tuếp lên vết bơi vài giọt cồn 960 chờ trong20-30phút Cho vài giọt thuốc nhuộm lên vết bôi,sau rửa nước Sấy khô tiêu khơng khí Quan sát tiêu duới KHV Tiến hành dếm tổng số tế bào tính kết 1.3.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG CHẤT KHÔ (THU SINH KHỐI) 18 Nguyên tắc:lọc dịch nuôi cấy,rồi sấy đến khối lượng không đổi phần không qua lọc,đem định lượng Phạm vi ứng dụng: Tế bào vsv kích thước lớn tảo,nấm men Xác dịnh sinh khối với thể tích lớn 10->200l để bỏ qua sai số phương pháp Vì phương pháp thường sử dụng để theo dõi sữ sinh trưởng vsv trình lên men quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ sản xuất.Khơng dùng định lượng vsv thực phẩm Ưu điểm: xác định nhanh Nhược điểm:đo tế bào sống lẫn tế bào chết Cách riến hành: Hóa chất: dung dịch nước muối sinh lý nồng độ 0.9% Nước vô khuẩn Thiết bị: Hệ thống lọc chân không thiết bị ly tâm Tủ sấy Tiến hành: Thu nhận sinh khối từ phương pháp vi lọc ly tâm Rửa sinh khối nước muối sinh lý Sấy sinh khối đến khối lượng khơng đổi Kết tính tóan: tính số g chất khơ sinh khối có 1lít mẫu khảo sát Cách tính : Cơng thức: X=(m2-m1)1000 V X sinh khối (g/l) m1 khối lượng membrane ban đầu(g) 19 m2 khối lượng membrane có chứa vsv sau sấy đến khối lượng khơng đổi V thể tích mẫu sử dụng(ml) 1000 hệ số quy đổi 2.PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP ĐỊNH LƯỢNG VSV 2.1 ĐẾM SỐ LƯỢNG CÁC KHUẨN LẠC PHÁT TRIỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH: Phương pháp cấy gạt; Pha lõang mẫu Ghi vào đáy đĩa pêtri có mơi trường thạch thơng tin: Nồng độ pha lõang Ngày cấy Dùng pipét vô khụẩnlấy 0.1ml dịch huyền phù cho vào đĩa thạch,dàn tế bào bề mặt thạch đĩa pêtri,đem đĩa vào tủ ấm đặt úp ngược để tránh nhiễm tránh giọt nước ngưng tụ nắp đĩa rơi xuống bề mặt thạch Kết thúc thời gian ủ đếm số khuẩn lạc mọc bề mặt đĩa pêtri từ xác định số lượng tế bào vsv 1ml dd ban đầu đem cấy.Vì số lượng khuẩn lạc đếm dược tương đương với số tế bào sống đem nuôi cấy 20 Phương pháp đổ đĩa Nhúng ống nghiệm hay lọ chứa 10-25ml mơi trường ni cấy thích hợp cho vsv vào bese có chứa nước,gia nhiệt để làm tan chảy thạch Làm nguội thạch bể nước có ổn nhiệt Sử dung pipet có cài nút bơng để cấy 1ml mẫu vào đĩa pêtri đánh dấu trước đổ môi trường thạch làm nguội vào đĩa Để yên cho thạch đông lại đem ủ từ xác định số lượng tế bào vsv có mẫu cấy ban đầu Tính kết quả: đếm số khuẩn lạc vùng,nhớ đánh dấu khuẩn lạc đếm Đóa Petri 25-250 khuẩn lạc tối ưu với phương pháp đếm gián tiếp số khuẩn lạc đóa Petri Ưu điểm phương pháp:phân biệt tế bào sống tế bào chết Nhược điểm: Thời gian định lượng dài > Nếu tiến hành theo phương pháp đổ đóa đổ môi trường thạch dạng lỏng,nhiệt độ cao->dễ gây chết vsv,nếu nhiệt 21 dộ thấp môi trường đặc lại->không đổ đóa được,tốt 700C Nếu tiến hành theo phương pháp cấy gạt lại dẫn đến sai số mẫu dính que trang =>Mỗi phương pháp có sai số định sử dụng phương pháp đếm gián tiếp quán sử dụng phương pháp suôt trình tiến hành 2.2 PHƯƠNG PHÁP ĐO MẤT ĐỘ QUANG Nguyên tắc:Số lượng tế bào vsv mơi trường xác định cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang.Theo phương pháp này,số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có mẫu đem đo(trừ nhũng mẫu đậm đặc) hay điều kiện sinh trưởng định tỉ lệ với nồng độ tế bào.Nói cách khác mật độ tế bào tăng OD tăng Nhược điểm phương pháp: đo tế bào sống chết (trừ số vsv chết tự tiết chất tự phân huỷ) Tiến hành: 22 Chuẩn bị vật liệu , dụng cụ môi trường nuôi cấy Thiết lập đường cong chuẩn C=f(A) X=g(A) A độ hấp thu mẫu vật chứa vsv C nồng độ tế bào vsv mẫu(triệu tế bào/ml) X lượng chất khô tế bào mẫu Xác định nồng độ tế bào mẫu quan sát từ đồ thị đường cong chuẩn Người ta kết hợp phương pháp đếm trực tiếp với phương pháp đo OD để xây dựng đường chuẩn OD mật độ tế bào sống(chỉ áp dụng vơi pha log pha cân bằng): 23 24 ... muối sinh lý nồng độ 0.9% Nước vô khuẩn Thiết bị: Hệ thống lọc chân không thiết bị ly tâm Tủ sấy Tiến hành: Thu nhận sinh khối từ phương pháp vi lọc ly tâm Rửa sinh khối nước muối sinh lý. .. Mơ tả hình dạng, cấu tạo vi khuẩn môi trường thạch Xác định khả di động VSV Vẽ hình thái tế bào: vi khuẩn, nấm men, … 12 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT I.LÝ THUYẾT CHUNG: Các phương... Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient Agar – NA): Thực hành: SV điều chế môi trường cần dùng cho học BÀI PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Để nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa VSV cần phải