ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê về gánh nặng ung thư toàn cầu của tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế [74], ung thư đại - trực tràng (UTĐTT) là một trong năm loại ung thư thường gặp ở cả hai giới trên toàn cầu, với khoảng 1.361.000 trường hợp bệnh mắc mới, 694.000 trường hợp tử vong và đứng hàng thứ 5 trong số các nguyên nhân tử vong do ung thư. Tại Việt Nam năm 2012, UTĐTT đứng hàng thứ tư về số lượng mắc mới và tử vong do ung thư ở cả hai giới, với khoảng 4561 trường hợp mắc mới và khoảng 3112 trường hợp tử vong do UTĐTT [74]. Qua khảo sát đột biến bộ gen người trong UTĐTT, các biến đổi phân tử thông qua hai lộ trình hạ nguồn EGFR là RAS/RAF/MAPK và PI3K/PTEN/Akt đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư đại - trực tràng [89],[160]. Các nghiên ở nước ngoài đã cho thấy việc khảo sát đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN có ý nghĩa tiên đoán đáp ứng điều trị với các thuốc nhắm trúng đích phân tử EGFR [13],[42],[43]. Liệu pháp nhắm trúng đích phân tử EGFR bằng các kháng thể đơn dòng như cetuximab hay panitumumab khi được sử dụng phối hợp với các phác đồ hóa trị chuẩn như FOLFOX hay FOLFIRI trong điều trị UTĐTT di căn đã giúp cải thiện rõ rệt thời gian sống còn so với nhóm bệnh nhân chỉ hóa trị đơn thuần [13],[27],[163]. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào tiêu chuẩn UTĐTT di căn có biểu hiện EGFR dương tính trên hóa mô miễn dịch để chỉ định điều trị bằng cetuximab thì tỷ lệ đáp ứng chưa đến 25% [39],[131]. Mặt khác, khi UTĐTT di căn có biểu hiện EGFR âm tính trên hóa mô miễn dịch vẫn có đáp ứng với cetuximab [37],[66]. Như vậy, sự biểu hiện của EGFR trên tế bào u không có giá trị tiên đoán đáp ứng đối với liệu pháp nhắm trúng đích trong điều trị UTĐTT bằng kháng thể đơn dòng kháng EGFR. Sau đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh sự hoạt hóa quá mức ít nhất một lộ trình tín hiệu RAS/RAF/MAPK hoặc PI3K/PTEN/Akt do các đột biến tăng chức năng một trong số các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA hoặc các biến đổi phân tử gây mất biểu hiện protein PTEN sẽ gây kháng thuốc cetuximab và panitumumab trong UTĐTT di căn [13],[42],[43]. Do đó, KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN được xem là các dấu ấn phân tử có giá trị tiên đoán đáp ứng với liệu pháp nhắm trúng đích EGFR trong điều trị UTĐTT di căn. Ngoài ra, UTĐTT có đột biến PIK3CA là một yếu tố thuận lợi cho việc điều trị hỗ trợ bằng aspirin, giúp hạn chế tỷ lệ tái phát cho bệnh nhân [48],[95]. Bên cạnh giá trị tiên đoán đáp ứng điều trị, việc khảo sát các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN còn có ý nghĩa tiên lượng bệnh. Nghiên cứu của Bazzan[20], Roth [128], Tol [156], Zhu [189] cho thấy đột biến tăng chức năng các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và các nghiên cứu của Mao [105], Sawai [137] về sự mất biểu hiện PTEN là các yếu tố tiên lượng xấu trong ung thư đại trực tràng. Nhiều nghiên cứu nước ngoài về các biến đổi phân tử ở các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA [61],[189],[191] cũng như sự mất biểu hiện protein PTEN [101],[120],[137] cho thấy có sự thay đổi theo địa dư, chủng tộc. Ở Việt Nam, đặc điểm đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN của bệnh nhân UTĐTT chưa được nghiên cứu nhiều. Đã có vài báo cáo về tỷ lệ đột biến KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. Tuy nhiên, kỹ thuật khảo sát đột biến gen theo phương pháp PCR đặc hiệu alen trong nghiên cứu của Hồ Hữu Thọ [1], Bùi Ánh Tuyết [5] và Tạ Thành Văn [6] thì không thể phát hiện được các đột biến mới. Cho đến hiện tại, chỉ có nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ [7] xác định đột biến KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng dựa trên kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp của Sanger, là tiêu chuẩn vàng trong xác định đột biến gen và có thể phát hiện tất cả các đột biến mới. Đến nay, chưa có nghiên cứu nào được công bố ở Việt Nam về đặc điểm đột biến gen NRAS, BRAF, PIK3CA và biểu hiện protein PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tỷ lệ các biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng” dựa trên kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp của Sanger và hóa mô miễn dịch như là một nghiên cứu bước đầu nhằm góp phần làm sáng tỏ tỷ lệ các biến đổi phân tử ở các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và protein PTEN trong carcinôm tuyến đại – trực tràng ở Việt Nam. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: 1. Khảo sát một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. 2. Xác định tỷ lệ đột biến KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, mất biểu hiện protein PTEN và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỒNG PHONG NGHIÊN CỨU TỶ LỆ CÁC BIẾN ĐỔI PHÂN TỬ KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA VÀ PTEN TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2017 MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cam đoan Mục lục Bảng đối chiếu thuật ngữ Việt – Anh Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DỊCH TỄ HỌC UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2 CƠ CHẾ PHÂN TỬ TRONG BỆNH SINH CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG 1.3 ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA CARCINÔM ĐẠI - TRỰC TRÀNG 16 1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ GEN, PROTEIN LIÊN QUAN ĐƢỜNG TRUYỀN TÍN HIỆU HẠ NGUỒN EGFR 22 1.5 TỔNG QUAN ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG 30 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 41 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.3 Y ĐỨC 50 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG 51 3.2 BIỂU HIỆN PROTEIN PTEN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG 56 3.3 ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA 62 CHƯƠNG BÀN LUẬN 78 4.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG 78 4.2 BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN PTEN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG 82 4.3 ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA 87 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ 122 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU Phụ lục PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU DANH SÁCH BỆNH NHÂN BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH Bất ổn định gen Genomic instability Bất ổn định nhiễm sắc thể Chromosomal instability Bất ổn định vi vệ tinh Microsatellite instability Bất ổn định vi vệ tinh mức độ cao Microsatellite instability - high Bất ổn định vi vệ tinh mức độ thấp Microsatellite instability - low Bệnh đa polýp tuyên gia đình Familial adenomatous polyposis Biểu sinh Epigenetic Chết tế bào theo lập trình Programmed cell death Đảo CpG CpG island Điểm nóng đột biến Mutation hotspot Đột biến sinh dƣỡng Somatic mutation Đột biến dòng mầm Germ line mutation Gen đè nén u Tumour suppressor gene Gen sinh ung Oncogene Gen sửa lỗi bắt cặp sai Mismatch repair gene Hội chứng bệnh đa polýp thiếu niên Juvenile polyposis syndrome Kiểu hình methyl hóa đảo CpG CpG island methylator phenotype Lộ trình đè nén u Suppressor pathway Lộ trình cổ điển Classical pathway Mất tính dị hợp tử Loss of Heterozygosity Ổ tuyến bất thƣờng niêm mạc đại tràng Aberrant crypt focus Ổ tuyến bất thƣờng niêm mạc đại tràng nghịch sản Dysplastic aberrant crypt focus Protein hoạt hóa Activating protein Sự bắt cặp loại Homodimerization Sự bắt cặp khác loại Heterodimerization Tâm động Kinetochore Tiền gen sinh ung Proto-oncogene Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu bì Epithelial growth factor receptor Tự nhiên Wildtype Trạm kiểm soát phân bào Checkpoint Ung thƣ đại – trực tràng di truyền không bệnh đa polyp Hereditary nonpolyposis colorectal cancer U tuyến cƣa không Sessile serrated adenoma Vi vệ tinh Microsatellite Yếu tố tăng trƣởng chuyển dạng β Transformation growth factor - β Yếu tố chuyển đổi guanine Guanine exchange factors Yếu tố phiên mã Transcription factor DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ TIẾNG VIỆT BOĐNST Bất ổn định nhiễm sắc thể BOCVVT Bất ổn định vi vệ tinh SLBCS Sửa lỗi bắt cặp sai UTĐTT Ung thƣ đại – trực tràng TIẾNG ANH APC Adenomatous Polyposis Coli BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CIN Chromosomal instability (Bất ổn định nhiễm sắc thể) del deletion (Đột biến đoạn) dup duplication (Đột biến lặp đoạn) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu bì) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm) GAP GTPase Activating Proteins (Protein hoạt hóa GTPase) GEF Guanine nucleotide Exchange Factors (Yếu tố trao đổi nucleotid Guanine) GLOBOCAN Global Cancer Burden (Gánh nặng ung thƣ toàn cầu) GTP Guanosine triphosphate IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu ung thƣ quốc tế) ins insertion (Đột biến chèn đoạn) KRAS v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog LDL Low-Density Lipoprotein (Lipoprotein trọng lƣợng phân tử thấp) LINE Long Interspersed Nucleotide Elements (Các đoạn nucleotid kéo dài nằm xen kẻ ADN có khả chuyển vị) LRP LDL-receptor-related protein (Protein liên quan thụ thể LDL) MAPK Mitogen - activated protein kinase (Men phosphoryl hóa protein hoạt hóa phân bào) MEK Mitogen extracellular signal-regulated kinase (Men phosphoryl hóa điều hòa tín hiệu phân bào ngoại bào) MMR Mismatch repair (Sửa lỗi bắt cặp sai) MSI Microsatellite instability (Bất ổn định vi vệ tinh) NRAS Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3 kinase, catalytic subunit alpha PIP2 Phosphatidylinositol 3,4-diphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PTEN Phosphatase and tensin homolog DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các kiểu đột biến KRAS thƣờng gặp carcinôm tuyến đại trực tràng theo sở liệu COSMIC 32 Bảng 1.2: Một số đột biến gặp gene BRAF 34 Bảng 1.3: Tổng hợp kiểu đột biến thƣờng gặp PIK3CA 38 Bảng 2.1: Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM 44 Bảng 2.2: Chu kỳ luân nhiệt theo kỹ thuật COLD-PCR 48 Bảng 2.3: Chu kỳ luân nhiệt cycle sequencing 49 Bảng 3.1: Liên quan tình trạng biểu PTEN với tuổi 58 Bảng 3.2: Liên quan tình trạng biểu PTEN với giới tính 58 Bảng 3.3: Liên quan tình trạng biểu PTEN với vị trí u 59 Bảng 3.4: Liên quan tình trạng biểu PTEN với loại mô học 59 Bảng 3.5: Liên quan tình trạng biểu PTEN với độ mô học 60 Bảng 3.6: Liên quan tình trạng biểu PTEN với độ xâm lấn 60 Bảng 3.7: Liên quan tình trạng biểu PTEN với di hạch 61 Bảng 3.8: Liên quan tình trạng biểu PTEN với di xa 61 Bảng 3.9: Tóm tắt loại đột biến KRAS 63 Bảng 3.10: Liên quan tình trạng đột biến KRAS tuổi 70 Bảng 3.11: Liên quan tình trạng đột biến KRAS giới tính 71 Bảng 3.12: Liên quan tình trạng đột biến KRAS loại mô học 72 Bảng 3.13: Liên quan tình trạng đột biến KRAS với độ xâm lấn (pT) 73 Bảng 3.14: Liên quan đột biến PIK3CA với vị trí u 75 Bảng 3.15: Liên quan đột biến PIK3CA với độ xâm lấn 76 Bảng 4.1: Tỉ lệ đột biến gen KRAS ung thƣ đại - trực tràng 87 Bảng 4.2: Phân bố vị trí đột biến KRAS theo codon 89 Bảng 4.3: :Tỉ lệ đột biến BRAF nghiên cứu trƣớc 96 Bảng 4.4: Tỉ lệ đáp ứng với kháng thể đơn dòng kháng EGFR theo tình trạng đột biến BRAF 98 Bảng 4.5: Phân bố tỉ lệ đột biến gen PIK3CA exon exon 20 99 Bảng 4.6: Tỉ lệ đột biến PIK3CA qua nghiên cứu 101 Bảng 4.7: Tỉ lệ đột biến KRAS theo giới tính 106 Bảng 4.8: Liên quan đột biến PIK3CA với giới tính 113 Bảng 4.9: Liên quan đột biến PIK3CA với loại mô học carcinôm tuyến dạng nhầy 114 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: Phân bố đột biến điểm carcinôm tuyến đại - trực tràng toàn gen KRAS 31 Biểu đồ 1.2: Đặc tính hoạt hóa protein BRAF đột biến so với BRAF không đột biến 35 Biểu đồ 1.3: Các dạng đột biến điểm gây giảm hoạt động kinase protein BRAF 36 Biểu đồ 3.1: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo hai nhóm tuổi 51 Biểu đồ 2: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo giới tính 51 Biểu đồ 3.3: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo vị trí u 52 Biểu đồ 3.4: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo loại mô học 52 Biểu đồ 3.5: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo độ mô học 54 Biểu đồ 3.6: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo độ xâm lấn u 55 Biểu đồ 3.7: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo nhóm di hạch 55 Biểu đồ 3.8: Phân bố bệnh nhân UTĐTT theo giai đoạn bệnh TNM 56 Biểu đồ 3.9: Biểu PTEN carcinôm tuyến đại – trực tràng 56 Biểu đồ 3.10: Tỉ lệ đột biến KRAS 62 Biểu đồ 3.11: Phân bố vị trí đột biến KRAS 62 Biểu đồ 3.12: Phân bố tỉ lệ đột biến KRAS theo vị trí u 71 Biểu đồ 3.13: Phân bố tỉ lệ đột biến KRAS theo độ mô học 72 Biểu đồ 3.14: Phân bố tỉ lệ đột biến KRAS theo giai đoạn TNM 73 Biểu đồ 3.15: Phân bố tỉ lệ đột biến PIK3CA theo nhóm tuổi 74 Biểu đồ 3.16: Phân bố tỉ lệ đột biến PIK3CA theo giới tính 74 Biểu đồ 3.17: Phân bố tỉ lệ đột biến PIK3CA theo loại mô học 75 Biểu đồ 3.18: Phân bố tỉ lệ đột biến PIK3CA theo độ mô học 76 Biểu đồ 3.19: Phân bố tỉ lệ đột biến PIK3CA theo giai đoạn TNM 77 Biểu đồ 4.1: So sánh tỉ số nguy (Hazard Ratio) sống toàn nhóm KRAS đột biến KRAS tự nhiên 94 135 Saridaki Z., Tzardi M., Papadaki C., et al (2011), "Impact of KRAS, BRAF, PIK3CA mutations, PTEN, AREG, EREG expression and skin rash in >/= line cetuximab-based therapy of colorectal cancer patients".PLoS One, (1), pp e15980 136 SartoreBianchi A., Martini M., et al (2009), "PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFRtargeted monoclonal antibodies".Cancer Res, 69(5), pp 1851-7 137 Sawai H., Yasuda A., Ochi N., et al (2008), “Loss of PTEN expression is associated with colorectal cancer liver metastasis and poor patient survival” BMC Gastroenterology, 8, pp 56.doi: 10.1186/1471-230X-8-56 138 Schubbert S Shannon K, Bollag G (2007), "Schubbert S, Shannon K, Bollag G Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer Nat Rev Cancer 2007;7, pp 295–308 139 Shaukat A (2010), "Is BRAF mutation associated with interval colorectal cancers?".Dig Dis Sci, 55 (8), pp 2352-6 140 Shen H., Yuan Y., Hu H G., et al (2011), "Clinical significance of K-ras and BRAF mutations in Chinese colorectal cancer patients".World J Gastroenterol, 17, pp 809 – 816 141 Shen Y., Wang J., Han X., et al (2013), "Effectors of epidermal growth factor receptor pathway: the genetic profiling ofKRAS, BRAF, PIK3CA, NRAS mutations in colorectal cancer characteristics and personalized medicine".PLoS One, (12), pp e81628 142 Shi Y., Wang J., Chandarlapaty S., et al (2014) "PTEN is a protein tyrosine phosphatase for IRS1" Nature Structural & Molecular Biology 21 (6), pp 522–7 143 Shnitsar I., Bashkurov M., et al (2015) "PTEN regulates cilia through Dishevelled" Nature Communications 6, pp 8388 144 Siraj Abdul K, Bu Rong, Prabhakaran Sarita (2014), "A very low incidence of BRAF mutations in Middle Eastern colorectal carcinoma".Molecular Cancer, 13, pp 168 145 Smith Christopher G., Fisher David, Claes Bart, et al (2013), "Somatic Profiling of the Epidermal Growth Factor Receptor Pathway in Tumors from Patients with Advanced Colorectal Cancer Treated with Chemotherapy ± Cetuximab".Clinical Cancer Research, 19 (15), pp 4104-4113 146 Smith G., Carey F.A., Beattie J., et al (2002) “Mutations in APC, Kirsten-ras, and p53 alternative genetic pathways to colorectal cancer” Proc Natl Acad Sci USA 99, pp.9433–9438 147 Spano J P., Fagard R., Soria J C., et al (2005), "Epidermal growth factor receptor signaling in colorectal cancer: preclinical data and therapeutic perspectives".Ann Oncol, 16 (2), pp 189-94 148 Steck P.A., Pershouse M.A., Jasser S.A., et al (1997) "Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers" Nature Genetics 15 (4), pp 356–62 149 Stryker S.J., Wolff B.G., Culp C.E., et al (1987) “Natural history of untreated colonic polyps” Gastroenterology 93, pp.1009–1013 150 Sugai T., et al (2006), "Analysis of molecular alterations in left- and right-sided colorectal carcinomas reveals distinct pathways of carcinogenesis: proposal for new molecular profile of colorectal carcinomas".J Mol Diagn, (2), pp 193-201 151 Takayama T., Ohi M., Hayashi T., et al (2001) “Analysis of K-ras, APC, and beta-catenin in aberrant crypt foci in sporadic adenoma, cancer, and familial adenomatous polyposis” Gastroenterology 121, pp.599–611 152 Tejpar S., Celik I., Schlichting M., et al (2012), "Association of KRAS G13D tumor mutations with outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab".J Clin Oncol, 30 (29), pp 3570-7 153 Therkildsen C., Bergmann T K., et al (2014), "The predictive value of KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis".Acta Oncol, pp 221-227 154 Thibodeau S.N., Bren G., Schaid D (1993) “Microsatellite instability in cancer of the proximal colon” Science 260, pp.816–819 155 Thirunavukarasu P, Sathaiah M, Singla S, et al (2010) “Medullary carcinoma of the large intestine: a population based analysis” Int J Oncol, 37, pp 901-907 156 Tol Jolien (2009), "BRAF Mutation in Metastatic Colorectal Cancer".N Engl J Med 361, pp 98-99 157 Tong J H., Lung R W., Sin F M., et al (2014), "Characterization of rare transforming KRAS mutations in sporadic colorectal cancer".Cancer Biol Ther, 15 (6), pp 768-76 158 Toyota M., Ahuja N., Ohe-Toyota M., et al (1999) “CpG island methylator phenotype in colorectal cancer” Proc Natl Acad Sci USA 96, pp.8681–8686 159 Tran B., Kopetz S., et al (2011), "Impact of BRAF mutation and microsatellite instability on the pattern of metastatic spread and prognosis in metastatic colorectal cancer".Cancer, 117 (20), pp 462332 160 Trust Sanger Institute Genome Research Limited Catalogue of somatic mutations in cancer http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene 2014; Available at: 161 Tural D., Batur S., et al (2014), "Analysis of PTEN, BRAF and PI3K status for determination of benefit from cetuximab therapy in metastatic colorectal cancer patients refractory to chemotherapy with wild-type KRAS".Tumour Biol, 35 (2), pp 1041-9 162 Turnpenny P., Ellard S (2005) Emery's Elements of Medical Genetics (12th ed.) London: Elsevier, pp 2001-2011 163 Van Cutsem E., Kohne C H., Lang I., et al (2011), "Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status".J Clin Oncol, 29 (15), pp 2011-9 164 Vaughn C P., Zobell S D., Furtado L V., Baker C L., Samowitz W S (2011), "Frequency of KRAS, BRAF, and NRAS mutations in colorectal cancer".Genes Chromosomes Cancer, 50 (5), pp 307-12 165 Velho S (2005), "The prevalence of PIK3CA mutations in gastric and colon cancer".Eur J Cancer Care 41 (11), pp 1649-54 166 Vivanco I (2002), "The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer.".Nat Rev Cancer, (7), pp 489-501 167 Vogelstein B., Fearon E.R., Hamilton S.R., et al (1988) “Genetic alterations during colorectal-tumor development” N Engl J Med 319, pp 525–532 168 Von Einem J C., Heinemann V., von Weikersthal L F., et al (2014), "Left-sided primary tumors are associated with favorable prognosis in patients with KRAS codon 12/13 wild-type metastatic colorectal cancer treated with cetuximab plus chemotherapy: an analysis of the AIO KRK-0104 trial".J Cancer Res Clin Oncol 169 Waddell T (2014), "Targeting EGFR in colorectal cancer: beyond KRAS exon 2".Lancet Oncol, 15 (6), pp 540-1 170 Wan Paul T.C (2004), "Mechanism of Activation of the RAF-ERK Signaling Pathway by Oncogenic Mutations of B-RAF".Cell, 116, pp 855-867 171 Wang Q., Zhong M., Lu Y L., Yuan J., Wei L X (2012), "Correlation of KRAS gene mutations and clinicopathologic parameters in colorectal carcinom]".Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 41 (9), pp 603-6 172 Wangefjord S., Sundstrom M., Zendehrokh N., et al (2013), "Sex differences in the prognostic significance of KRAS codons 12 and 13, and BRAF mutations in colorectal cancer: a cohort study".Biol Sex Differ, (1), pp 17 173 Watanabe T., Yoshino T., Uetake H., et al (2013), "KRAS mutational status in Japanese patients with colorectal cancer: results from a nationwide, multicenter, cross-sectional study".Jpn J Clin Oncol, 43 (7), pp 706-12 174 Weber Georg F (2007), "Molecular_Mechanisms_of_Cancer", Springer, pp 45-215 175 Weisenberger D.J., Siegmund K.D., Campan M., et al (2006) “CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer” Nat Genet 38, pp.787–793 176 Weizmann Institute of Science(2014),The human gene database Available at: www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene" 177 Whitehall V.L., Walsh M.D., Young J., et al (2001) “Methylation of O-6-methylguanine ADN methyltransferase characterizes a subset of colorectal cancer with low-level ADN microsatellite instability” Cancer Res 61, pp.827–830 178 Woodford-Richens K.L., Rowan A.J., Gorman P., et al (2001) “SMAD4 mutations in colorectal cancer probably occur before chromosomal instability, but after divergence of the microsatellite instability pathway” Proc Natl Acad Sci USA 98, pp.9719–9723 179 Worthley D.L., Whitehall V.L., Spring K.J., Leggett B.A (2007) “Colorectal carcinogenesis: Road maps to cancer” World J Gastroenterol; 13(28), pp 3784-3791 180 Yamashita K., Dai T., Dai Y., et al (2003) “Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype” Cancer Cell 4, pp.121–131 181 Yamauchi M., Morikawa T., Kuchiba A., et al (2012), "Assessment of colorectal cancer molecular features along bowel subsites challenges the conception of distinct dichotomy of proximal versus distal colorectum".Gut, 61 (6), pp 847-54 182 Yang Zu-Yao (2013), "Promising biomarkers for predicting the outcomes of patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer treated with anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies: A systematic review with meta-analysis".International Journal of Cancer, 133 (8), pp 1914–1925 183 Yarden Y., Sliwkowski M.X (2001), "Untangling the ErbB signalling network".Nat Rev Mol Cell Biol, 2, pp 127–37 184 Yokota T, Ura T, Shibata N, et al (2011), "BRAF mutation is a powerful prognostic factor in advanced and recurrent colorectal cancer".Br J Cancer, 104, pp 856 - 862 185 Yokota T., Shibata N., Ura T., et al (2010), "Cycleave polymerase chain reaction method is practically applicable for V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS)/V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 (BRAF) genotyping in colorectal cancer".Transl Res, 156 (2), pp 98-105 186 Zhang L., Ma L., Zhou Q (2011), "Overall and KRAS-specific results of combined cetuximab treatment and chemotherapy for metastatic colorectal cancer: a meta-analysis".Int J Colorectal Dis, 26 (8), pp 1025-33 187 Zhang L., Wang Y., et al (2014), "Comparative analysis of real-time quantitative PCR-Sanger sequencing method and TaqMan probe method for detection of KRAS/BRAF mutation in colorectal carcinomas".Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 43 (2), pp 77-82 188 Zhao L., Vogt P K (2008), "Helical domain and kinase domain mutations in p110alpha of phosphatidylinositol 3-kinase induce gain of function by different mechanisms".Proc Natl Acad Sci U S A, 105 (7), pp 2652-7 189 Zhu K., Yan H., Wang R., et al (2014), "Mutations of KRAS and PIK3CA as independent predictors of distant metastases in colorectal cancer".Med Oncol, 31 (7), pp 16 190 Zhu X.L., Cai X., Zhang L., et al (2012), "KRAS and BRAF gene mutations in correlation with clinicopathologic features of colorectal carcinoma in Chinese".Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 41(9), pp.584589 191 Zhu Y.F., Yu B.H., Li D.L., et al (2012), "PI3K expression and PIK3CA mutations are related to colorectal cancer metastases".World J Gastroenterol, 18 (28), pp 3745-51 192 Zlobec I., Bihl M P., Schwarb H., Terracciano L., Lugli A (2010), "Clinicopathological and protein characterization of BRAF- and KRAS-mutated colorectal cancer and implications for prognosis".Int J Cancer, 127 (2), pp 367-80 Phụ lục PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU Họ tên: …………………………… Tuổi: … Giới: nam/ nữ Địa chỉ: ……………………………………………………………………… Điện thoại liên lạc:………………………………………………………… Ngày vào viện: ………………Số nhập viện:…………………………… Mã số Giải phẫu bệnh:………………………… LÂM SÀNG *Vị trí u: Manh tràng □ ĐT Trái □ *Di căn: Phổi □ Ruột thừa □ ĐT Phải□ ĐT Sigma □ Gan □ Trực tràng □ ĐT Ngang □ Hậu môn □ Khác (ghi rõ):………………… GIẢI PHẪU BỆNH Loại mô học:………………………………………………………………………… Độ mô học:………………………………………………………………………… Hạch : Số lượng hạch khảo sát……… Số lượng hạch di căn:…………… Vị trí hạch di căn:…………………………………………………… * Kiểu biệt hóa phối hợp: □ Thành phần dạng nhầy (tỉ lệ:………….%) □ Thành phần dạng tủy (tỉ lệ:………….%) □ Kém biệt hóa (tỉ lệ:………….%) Mức độ xâm lấn vi thể: □ Trong niêm mạc □ Xâm lấn lớp niêm đến lớp niêm □ Xâm lấn □ Xâm lấn đến mạc mô xung quanh đại - trực tràng □ Xâm lấn đến bề mặt mạc □ Xâm lấn quan lân cận (ghi rõ):… *pTNM: T……….N……….M………………pStage:…………………………… HÓA MÔ MIỄN DỊCH PTEN: âm tính Dương tính PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN KRAS: □ Không đột biến □ Đột biến (ghi rõ loại đột biến):……………………………… BRAF: □ Không đột biến □ Đột biến (ghi rõ loại đột biến):……………………………… NRAS: □ Không đột biến □ Đột biến (ghi rõ loại đột biến):……………………………… PIK3CA: □ Không đột biến □ Đột biến (ghi rõ loại đột biến):……………………………… Phụ lục PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Mẫu đơn đồng ý có số từ mà quý vị không hiểu Nên nhờ bác sĩ nhân viên nghiên cứu giải thích từ ngữ thông tin mà quý vị chưa hiểu rõ Quý vị đem chưa ký tên mẫu phiếu chấp thuận nhà để suy nghĩ bàn bạc với gia đình bạn bè trước định Quyền hạn quý vị: Những người tham gia vào nghiên cứu y sinh học có quyền hạn định, bao gồm: Được thông báo tính chất mục đích nghiên cứu Được giải thích phương thức thực nghiên cứu y sinh học Được mô tả nỗi lo lắng nguy gặp phải Được thông báo cách chữa trị y tế có cho người tham gia nghiên cứu dựa kết nghiên cứu Có hội để hỏi nghiên cứu phương thức liên hệ Có quyền biết kết xét nghiệm y sinh học thực mô bệnh phẩm quý vị Có quyền đồng ý không đồng ý với nghiên cứu y sinh học Về nghiên cứu: quý vị mời tham gia vào nghiên cứu mà thu thập mẫu bệnh phẩm mô u quý vị Các mẫu mô u dùng để thực xét nghiệm giải trình tự gen để xác định đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định biểu PTEN Các kết có giá trị tiên lượng bệnh cho quý vị dự đoán đáp ứng với thuốc nhắm trúng đích cetuximab hay panitumumab quý vị có định điều trị với loại thuốc Quý vị có quyền hỏi câu hỏi để làm rõ vấn đề quý vị thắc mắc, trước quý vị định có đồng ý hay không Mẫu thử nghiệm y sinh học: thứ lấy từ thể người có nguồn gốc từ mô, máu, nước tiểu Mẫu thử nghiệm sinh học là: mô bệnh phẩm phẫu thuật, tế bào, máu, chất lỏng thể nước bọt, dịch màng,… Trong nghiên cứu này, lấy mẫu thử nghiệm mô bệnh phẩm phẫu thuật sau lấy khỏi thể quý vị Sử dụng mẫu mô: mẫu bệnh phẩm phẫu thuật quý vị sử dụng cho mục đích nghiên cứu y sinh học Không sử dụng vào mục đích khác Bảo mật thông tin: cam kết thông tin quý vị bảo mật tuyệt đối Mọi rò rỉ thông tin lỗi chịu trách nhiệm trước quý vị trước pháp luật Phí tổn: quý vị trả chi phí để tham gia vào nghiên cứu Sự tự nguyện tham gia rút lui: Sự tham gia quý vị vào nghiên cứu tự nguyện Quý vị có quyền không tham gia vào nghiên cứu Nếu quý vị tham gia, quý vị rút lui khỏi nghiên cứu vào lúc nào, cách báo với nghiên cứu viên Quyết định quý vị không làm thay đổi việc chăm sóc y tế quý vị tương lai bệnh viện Thắc mắc: Nếu quý vị có thắc mắc liên quan đến nghiên cứu này, lúc quý vị cho bị chịu tổn thương liên quan đên nghiên cứu này, xin liên lạc với nghiên cứu viên: BS ………………………………………Điện thoại: …….……………… Đồng ý: chữ ký quý vị chứng tỏ quý vị đọc hiểu đồng ý chấp thuận tham gia nghiên cứu Quý vị bàn bạc với nghiên cứu viên quý vị định tham gia vào nghiên cứu Quý vị lưu ý, phiếu ghi ngày, tháng, năm ký tên đưa lại cho quý vị lưu giữ Bằng việc ký thỏa thuận này, quý vị không miễn trừ quyền hạn pháp lý mà có với tư cách bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu Họ tên bệnh nhân:………………………………………………………… Chữ ký bệnh nhân vào lúc: … giờ….ngày….tháng…….năm………… Họ tên nghiên cứu viên:…………………………………………………… Chữ ký nghiên cứu viên … giờ…., ngày…….tháng… năm…… DANH SÁCH 50 TRƯỜNG HỢP NGHIÊN CỨU Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Ung bướu Thành phố Cần Thơ KRAS BRAF PIK3CA PIK3CA NRAS NRAS (exon2) (exon15) (exon 9) (exon 20) (exon2) (exon3) Gly13Asp WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT Gly12Val WT WT WT WT WT A12-1101 WT WT WT WT WT WT Nam A11-1757 (BI) WT WT WT WT WT WT 39 Nam A12-1188 WT WT WT WT WT WT Nguyễn Thị Th 72 Nữ A11-2078-II Gly12Asp WT WT WT WT WT KNBP-08 Trần Kim X 48 Nữ A12-1200 WT WT WT WT WT WT KNBP-09 Trương Thị Th 63 Nữ A11-2283 Gly12Ser WT WT WT WT WT 10 KNBP-10 Nguyễn Thị Ú 82 Nữ A11-2365-B WT WT WT WT WT WT 11 KNBP-11 Nguyễn Văn Qu 61 Nam A12-1458 WT WT WT WT WT WT 12 KNBP-12 Huỳnh Quốc V 28 Nam A11-3371 Gly12Val WT WT WT WT WT 13 KNBP-13 Châu Văn U 53 Nam A11-3902-II WT WT WT WT WT WT 14 KNBP-14 Dương Văn Kh 65 Nam A11-3977-II Gly12Val WT WT WT WT WT 15 KNBP-15 Trần Thị B 53 Nữ A11-4310 WT WT WT WT WT WT 16 KNBP-16 Lê Thị Th 30 Nữ A11-4431-BIII WT WT WT Met1055Ile WT WT STT Mã số NC HỌ TÊN TUỔI GIỚI KNBP-01 Dương Thị H 70 Nữ A11-535 (U-II) KNBP-02 Phạm Thị H 73 Nữ A12-494 KNBP-03 Lê Văn S 48 Nam A11-1225 (B) KNBP-04 Trần văn L 70 Nam KNBP-05 Nguyễn Văn T 40 KNBP-06 Trần Văn Nh KNBP-07 GPB 17 KNBP-17 Lâm Hữu Đ 46 Nam A11-4450 18 KNBP-18 Huỳnh Thị Mỹ Th 36 Nữ 19 KNBP-19 Trần Hữu L 23 20 KNBP-20 Thị V 21 KNBP-21 22 WT WT WT WT WT WT A11-4630-II Gly12Val WT WT WT WT WT Nam A11-4711-II WT WT WT WT WT WT 61 Nữ A11-4850 WT WT WT WT WT WT Trần Thị Ánh Ng 47 Nữ A11-5245 WT WT Glu545Ala WT WT WT KNBP-22 Trần Ngọc T 53 Nam A11-5670-II WT WT WT WT WT WT 23 KNBP-23 La Văn S 44 Nam A11-5712-III WT WT WT WT WT WT 24 KNBP-24 Bùi Công Nh 74 Nam A11-5801 Gly13Ser WT WT WT WT WT 25 KNBP-25 Trần Thị Ng 60 Nữ A12-2447 WT WT WT WT WT WT 26 KNBP26 Dương Thái H 71 Nam A12-4694 Gly12Asp WT WT WT WT WT 27 KNBP27 Nguyễn Văn Ch 84 Nam A12-5238 Gly10Glu WT WT WT WT WT 28 KNBP28 Tô Văn X 81 Nam A12-5469 Gly12Asp, Gly12Val WT WT WT WT WT 29 KNBP29 Hồ Thanh H 34 Nam A12-5512 WT WT WT WT WT WT 30 KNBP30 Hồ Thu V 57 Nữ A12-5578 WT WT WT WT 31 KNBP31 Nguyễn Phước H 65 Nam A12-6128 WT WT WT WT WT WT 32 KNBP32 Cao Thị Ph 46 Nữ A13-31 WT WT WT WT WT WT 33 KNBP33 Trần Thị Thanh N 45 WT WT WT WT WT 34 KNBP34 Trần Văn U 35 KNBP35 36 c.3171A>G Nữ A13-510 55 Nam A13-525 WT WT WT WT WT WT Lâm Văn D 53 Nam A13-763 Gly12Ser WT WT WT WT WT KNBP36 Võ Thị N 56 Nữ A13-1476 Gly12Asp WT WT WT WT WT 37 KNBP37 Nguyễn Thành N 65 Nam A13-1873 WT WT WT WT WT WT 38 KNBP38 Nguyễn Thị L 75 Nữ A13-2014 WT WT WT WT WT WT (p.W1057X) 39 KNBP39 Trần Thị L 75 Nữ A13-3053 WT WT WT WT WT WT 40 KNBP40 Trần Văn Đ 42 Nam A13-3814 WT WT WT WT WT WT 41 KNBP41 Hồ Văn Ph 51 Nam A13-4920 WT K601E WT WT WT WT 42 KNBP42 Trịnh En L 31 Nam A13-5160 Gly12Ser, Gly13Asp WT WT WT WT WT 43 KNBP43 Lê Thị Đ 62 Nữ A13-5345 WT WT WT WT WT WT 44 KNBP44 Nguyễn Văn Ch 62 Nam A13-5924 WT WT WT WT WT 45 KNBP45 Nguyễn Văn Đ 43 Nam A13-6338 WT WT WT WT WT WT 46 KNBP46 Trương Minh S 62 Nam L181 WT WT WT WT WT WT 47 KNBP47 Nguyễn Thị Nh 66 Nữ 738YCT13 WT WT WT WT WT WT 48 KNBP48 Trần Thị Th 38 Nữ 1198YCT13 Gly12Ser WT WT WT WT WT 49 KNBP49 Trương Văn Tr 62 Nam 1298YCT13 Gly12Asp WT WT WT WT WT 50 KNBP50 Phạm Văn H 63 Nam 1320YCT13 Gly13Asp WT WT WT WT WT Xác nhận Ban Giám đốc Bệnh viện ... đột biến Đến nay, chưa có nghiên cứu công bố Việt Nam đặc điểm đột biến gen NRAS, BRAF, PIK3CA biểu protein PTEN carcinôm tuyến đại - trực tràng Do đó, thực đề tài Nghiên cứu tỷ lệ biến đổi phân. .. nghĩa carcinôm đại - trực tràng Carcinôm đại - trực tràng u biểu mô ác tính xuất nguồn từ đại - trực tràng U phải xâm lấn qua lớp niêm vào lớp niêm có khả di xa Hơn 90% carcinôm đại - trực tràng carcinôm. .. ĐIỂM ĐỘT BIẾN CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG 30 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 41 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.3