Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột cống trắng của ba hợp chất flavonoid nụ vối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH TỪ CHUỘT CỐNG TRẮNG CỦA BA HỢP CHẤT FLAVONOID NỤ VỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH TỪ CHUỘT CỐNG TRẮNG CỦA BA HỢP CHẤT FLAVONOID NỤ VỐI CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 60720405 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế TS Trần Thị Hiền HÀ NỘI - 2017 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vai trò tăng sinh tế bào trơn động mạch xơ vữa động mạch 1.1.1 Một vài nét bệnh xơ vữa động mạch 1.1.2 Cấu tạo động mạch, hình thành mảng xơ vữa vai trò tăng sinh tế bào trơn bệnh xơ vữa động mạch 1.2 Một số phương pháp cô lập tách tế bào trơn động mạch từ động vật 12 1.2.1 Phương pháp cô lập nuôi cấy tế bào trơn tác giả Ricardo Villa-bellosta 12 1.2.2 Phương pháp cô lập nuôi cấy tế bào trơn tác giả Rupande Tripathi 13 1.2.3.Phương pháp cô lập nuôi cấy tế bào trơn tác giả Neeta Adhikari 14 1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ 14 1.3.1 Phương pháp Alamar Blue 14 1.3.2 Phương pháp MTT 16 1.3.3 Phương pháp SRB 16 1.4 Một vài nét vối 17 1.4.1 Tên khoa học 17 1.4.2 Đặc điểm thực vật 17 1.4.3 Phân bố, sinh thái 17 1.4.4 Thành phần hóa học 18 1.4.5 Công dụng tác dụng dược lý 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu 22 2.1.1 Động vật nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất trang thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Triển khai tách tế bào trơn động mạch chủ từ chuột cống 23 2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối 26 2.2.3 Xử lý số liệu 28 CHƢƠNG 3:29 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 29 3.1 Kết tách tế bào trơn động mạch chủ từ chuột cống 29 3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối 35 3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối 35 3.2.2 Đánh giá độc tính tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối 37 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 38 4.1 Tách tế bào trơn động mạch chủ chuột cống trắng 40 4.2 Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối 44 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT OxLDLs Lipoprotein tỉ trọng thấp bị oxy hóa NO Nitric oxid AT-II Angiotensin MTT 3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid LPS Lipopolysaccharide VSMC Tế bào trơn động mạch chủ DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 2.1: Bố trí giếng với dịch chiết CO1, CO2, CO3 27 Bảng 3.1 Giá trị mật độ quang lô thử so với lô chứng 35 Bảng 3.2 Kết đánh giá độc tính mẫu thử CO1, CO2 CO3 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo động mạch Hình 3.1 Qui trình tách tế bào trơn động mạch chủ theo phương pháp 29 Hình 3.2 Bộc lộ động mạch chủ chuột 30 Hình 3.3 Đăt động mạch chủ dung dịch collagenase tuýp 30 Hình 3.4 Qui trình tách tế bào trơn động mạch chủ theo phương pháp 32 Hình 3.5 Tế bào trơn động mạch chủ thu theo phương pháp 34 Hình 3.6 Tế bào trơn động mạch chủ thu theo phương pháp 34 Hình 3.7 Số lần tăng sinh tế bào lô thử so với lô chứng trắng 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Xơ vữa động mạch bệnh ngày phổ biến đặc biệt nước có kinh tế phát triển giới Bệnh thường tiến triển âm thầm để lại hậu nghiêm trọng cho sức khỏe sống Theo ước tính tổ chức Y tế giới WHO, hàng năm có khoảng 17 triệu người tử vong bệnh tim mạch có nguyên nhân từ xơ vữa động mạch Các nghiên cứu bệnh triển khai nhằm hiểu rõ nguyên nhân gây bệnh phương pháp điều trị Kết cho thấy tăng sinh tế bào trơn đóng vai trò quan trọng chế bệnh sinh xơ vữa động mạch [12] Vì có nghiên cứu tiến hành để đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào trơn chất điều trị xơ vữa động mạch Việt Nam nước nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong phú Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tốt phân lập đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh ưu điểm dễ hấp thu, chuyển hóa thể, tác dụng phụ độc tính so với chất có nguồn gốc tổng hợp hóa học Ở nước ta, Vối có tên khoa học Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry họ Sim Myrtaceae, sử dụng theo kinh nghiệm dân gian điều trị nhiều chứng bệnh chữa sốt, viêm dày, đặc biệt đái tháo đường, mỡ máu [2] Tuy nhiên công trình khoa học nghiên cứu Vối Đặc biệt chưa có nghiên cứu tác dụng nụ Vối bệnh biến chứng liên quan đến đái tháo đường, mỡ máu xơ vữa động mạch Từ thực tế đó, thực đề tài: “Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ tách từ chuột cống trắng ba hợp chất dịch chiết nụ Vối” với hai mục tiêu: Triển khai kỹ thuật tách tế bào trơn động mạch chủ tách từ chuột cống trắng Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ chuột cống trắng yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF) số chất từ nụ Vối kỹ thuật MTT CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vai trò tăng sinh tế bào trơn động mạch xơ vữa động mạch 1.1.1 Một vài nét bệnh xơ vữa động mạch 1.1.1.1 Định nghĩa Tổ chức Y tế giới định nghĩa: “Xơ vữa động mạch phối hợp tượng thay đổi cấu trúc nội mạc động mạch lớn vừa, bao gồm tích tụ cục lipid, phức hợp glucid, máu sản phẩm máu, mô xơ cặn lắng acid, tượng kèm theo thay đổi lớp trung mạc” [1] Xơ vữa động mạch tượng xơ hóa thành động mạch chủ yếu xảy động mạch trung bình động mạch lớn Biểu chủ yếu lắng đọng mỡ mảng tế bào lớp bao thành động mạch (gọi mảng vữa) Xơ vữa động mạch bệnh động mạch bị xơ cứng nhỏ hẹp bình thường, bệnh xảy vùng thể nguyên nhân gây đột quỵ (rối loạn tuần hoàn não), đau tim thiểu tuần hoàn cẳng chân Xơ vữa động mạch gây hai biến chứng nguy hiểm nhồi máu tim tai biến mạch não Xơ vữa động mạch nhiễm mỡ xơ hóa số chỗ thành động mạch Lipid đến gắn vào thành động mạch vị trí tổn thương thành mảng gọi mảng xơ vữa Xơ vữa động mạch thường xảy động mạch lớn vừa, vào tiểu động mạch Các mảng xơ vữa gây bệnh nhiều khác nhau, có mảng nằm yên thời gian dài tác hại nào, số mảng xơ vữa nằm nơi “xung yếu” lỗ vào hai động mạch thận, khúc gần động mạch vành trái, cửa ngõ động mạch sọ não gây tăng huyết áp, gây tai biến nặng mạch vành, mạch não [3] 1.1.1.2 Phân loại xơ vữa động mạch Có số cách phân loại xơ vữa động mạch phân loại theo nguyên nhân, phân loại theo vị trí tổn thương, phân loại theo giai đoạn xơ vữa động mạch… Phân loại xơ vữa động mạch theo nguyên nhân: Xơ vữa động mạch nguyên nhân huyết động: loại này, tăng huyết áp đóng vai trò quan trọng, xơ vữa động mạch xuất sớm Hiện tượng co mạch nhiều kéo dài gặp tăng huyết áp, tạo điều kiện cho tổn thương xơ vữa động mạch hình thành chỗ hay vùng Các rối loạn vận mạch khác gây tình trạng ổn định trương lực động mạch, dẫn tới tình trạng tăng lipid máu [9], [6] Xơ vữa động mạch nguyên nhân chuyển hóa: rối loạn di truyền liên quan đến chuyển hóa lipid cholesterol yếu tố nguy hại lớn Chế độ ăn uống không hợp lý, việc sử dụng nhiều mỡ động vật làm tăng loại cholesterol có hại cholesterol tỷ trọng thấp (LDL) thấp (VLDL) Trong bệnh nội tiết dễ gây vữa xơ động mạch phải kể đến bệnh đái tháo đường, thiểu giáp, thiểu hormon sinh dục [9] Xơ vữa động mạch nguyên nhân hỗn hợp: có mặt nguyên nhân nói trên, tăng huyết áp tăng lipid máu Phân loại xơ vữa động mạch theo vị trí tổn thƣơng: theo vị trí tổn thương gồm xơ vữa động mạch chủ nhánh động mạch lớn, xơ vữa động mạch vành, não, thận, mạc treo Các động mạch ngoại vi chi Xơ vữa động mạch nơi khác gặp Phân loại theo giai đoạn xơ vữa động mạch: Xơ vữa động mạch gồm hai giai đoạn Giai đoạn đầu gọi giai đoạn tiền lâm sàng Ở giai đoạn này, quan định, tổn thương chưa đủ lớn để phát phương pháp dùng chụp cản quang động 4.1 Tách tế bào trơn động mạch chủ chuột cống trắng Trên thực tế có số công ty cung cấp dòng tế bào trơn động mạch chủ SMC thương mại SV40LT-SMC Clone HEP-SA (ATCC® CRL-2018™) … nhiên phòng thí nghiệm Dược lực dòng tế bào Hơn việc sử dụng dòng tế bào tách từ thể sống cho có nhiều ưu điểm so với dòng tế bào sử lý để thương mại hóa giữ nhiều đặc tính tự nhiên tế bào Đã có nhiều nghiên cứu viết qui trình tách tế bào động mạch chủ từ lợn nghiên cứu tác giả Russell Ross [33], từ chuột nhắt nghiên cứu tác giả Neeta Adhikari [13], hay từ chuột cống nghiên cứu tác giả Rupande Tripathi [38] tác giả Ricardo Villabellosta [39], nghiên cứu tác giả Moo Yeol Lee sử dụng chuột nhắt 4-5 tuần tuổi [25] Tuy nhiên công bố mô tả cách ngắn gọn qui trình tách, cô lập nuôi cấy sơ cấp, nuôi cấy thứ cấp loại tế bào Hơn nữa, theo nghiên cứu công bố, số thông số nghiên cứu quan trọng qui trình tách, cô lập tế bào trơn động mạch chủ loại enzym dùng thời gian ủ động mạch với enzym… khác nghiên cứu Cụ thể nghiên cứu hai tác giả Ricardo Villa-bellosta Rupande Tripathi tách tế bào trơn động mạch từ chuột cống tác giả Ricardo Villa-bellosta sử dụng enzym collagenase tuýp lần ủ (lần ủ 15 phút, lần ủ 90 phút), tác giả Rupande Tripathi sử dụng enzym collagenase tuýp (ủ lần từ 8-10 phút) sử dụng thêm enzym elastase (ủ lần giờ) Hai tác giả Neeta Adhikari Moo Yeol Lee sử dụng chuột nhắt để tách tế bào trơn động mạch có khác sử dụng enzym tách tế bào Tác giả Neeta Adhikari sử dụng enzym collagenase tuýp 2, tác giả Moo Yeol Lee ủ tế bào lần với enzym collagenase tuýp 50 40 phút lần sử dụng hai enzym collagenase tuýp elastase để tách tế bào Trong nghiên cứu việc lựa chọn mô hình nghiên cứu chọn lọc theo nghiên cứu nước có thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Chúng lựa chọn sử dụng chuột cống có động mạch chủ lớn so với chuột nhắt, việc mổ lấy động mạch thuận lợi so với chuột nhắt đồng thời việc loại bỏ mảng bám, mỡ dính vào thành động mạch dễ dàng so với thực chuột nhắt Các tế bào khối mô liên kết chặt chẽ với với chất ngoại bào nhờ cầu nối protein hình thành tế bào với Để tách rời tế bào khối mô, người ta thường dùng enzym protease Mô tập hợp tế bào tổ chức tinh vi đặc trưng, chúng liên kết thành khối thống nhất, thông qua cầu nối gian bào Tách tế bào khỏi mô cần phải phá bỏ cầu nối này, không gây tổn thương cho tế bào Người ta dùng học hay enzym cắt Nếu dùng phương pháp học cho hiệu tách tế bào không cao sử dụng enzym phương pháp sử dụng enzym dùng nồng độ cao gây chết tế bào Vì nghiên cứu kết hợp hai phương pháp học sử dụng enzym để tăng hiệu tách tế bào đồng thời giảm thời gian tế bào tiếp xúc với enzym Trong nghiên cứu trước đây, số tác giả dùng collagenase mà không dung elastase Enzym collagenase enzym protease có vai trò phá hủy rào chắn màng tế bào bao quanh tế bào, cho tế bào ủ với enzym collagenase lần có tác dụng thủy phân liên kết tế bào trơn động mạch với mô quan khác bám xung quanh kiến việc tách mô bám xung quanh dễ dàng gây tổn thương cho tế bào trơn Còn elastase enzym thường sử dụng để phân tách mô có chứa mạng 41 lưới sợi tế bào elastin tìm thấy nồng độ cao sợi đàn hồi mô liên kết Vì nghiên cứu sử dụng enzym collagenase elastase để tăng khả tách tế bào enzym elastase sử dụng giai đoạn ủ enzyme lần (sau loại bỏ mô bám xung quanh động mạch chủ Để tìm phương pháp tách tế bào trơn động mạch chủ môn Dược lực tiến hành theo phương pháp: Phương pháp 1: Theo phương pháp tác giả Rupande Tripathi cộng có chỉnh sửa Trong toàn qui trình tách cô lập tế bào trơn động mạch chủ tiến hành ngày Phương pháp 2: Theo phương pháp tác giả Lee cộng có chỉnh sửa Qui trình tiến hành ngày có thời gian nghỉ không cho động mạch tiếp xúc với enzym (collagenase elastase 24 giờ) Trong trình thực nghiệm, trước tiên tiến hành tách tế bào theo phương pháp (theo phương pháp tác giả Rupande Tripathi cộng sự) Với bước tiến hành phương pháp mô tả phần kết nghiên cứu nhận thấy, để tế bào tách rời cần ủ động mạch chủ với enzym lần (collagelnase 2% elastase 1%) vòng tiếng Với nồng độ enzym nhỏ (collagelnase 1% 1,5%) tế bào tách rời khỏi nhiên tăng nồng độ collagelnase lên 2,5% ủ tế bào tách rời tốt nhiều tế bào bị tan rã Vì lựa chọn nồng độ collagelnase 2% ủ Với nồng độ enzym thời gian ủ này, tế bào tách rời tốt nhiên với thời gian ủ tế bào sống yếu (lượng tế bào sống sót thu sau ngày nuôi cấy ít) hình thái tế bào không đẹp (nhiều tế bào không dạng hình thoi sáng mà có hình thù hình sao, hình tam 42 giác, rìa tế bào không trơn nhẵn, nhân tế bào không tròn Điều cho thấy tế bào bị biến đổi không giữ hình thái ban đầu Do nhóm nghiên cứu giảm thời gian ủ enzym xuống 2,5 Tế bào thu nhiều hơn, hình dạng tế bào chủ yếu hình thoi sáng nhiều tế bào hình thái không đẹp Tiêp tục giảm thời gian ủ enzym xuống giờ, tế bào không tách rời thành cụm, cụm tế bào chết dần nuôi cấy Do phương pháp lựa chọn số nghiên cứu trình bày phần kết (với nồng độ enzym collagenase 2% elastase 1%, thời gian ủ enzym lần giờ) Với thông số nghiên cứu lựa chọn nhóm nghiên cứu tách thành công tế bào trơn động mạch chủ từ chuột cống nuôi cấy để sử dụng đánh giá tác dụng thuốc, nhiên nhược điểm cần khắc phục phương pháp là: Sau ủ collagenase lần tách mô bám xung quanh tế bào động mạch chủ mà không tách lớp áo động mạch chủ tế bào tách lẫn nhiều tạp Mặc dù sau nuôi cấy ngày tế bào trơn có khả bám dính xuống bề mặt nuôi cấy, tế bào tạp lại bị chết lên môi trường nuôi cấy loại tế bào chết giải phóng chất ảnh hưởng đến chất lượng tế bào sống tăng khả lây nhiễm tế bào Đây lý kiến nhóm nghiên cứu phải tiếp tục tìm kiếm phương pháp tách tế bào trơn phải loại tế bào nội mô thành mạch máu lớp áo thành động mạch nhằm thu tế bào trơn động mạch chủ (nằm lớp thành động mạch) có hình thái với tự nhiên (ít bị biến đổi nhất) 43 Chúng tiếp tục tiến hành tách động mạch chủ phương pháp thời gian ủ enzym chia làm lần Tăng thời gian ủ collagenase lần lên lần ủ enzym động mạch chủ « nghỉ » 24 với mục đích để tế bào bị ảnh hưởng tác động enzym Kết thúc thời gian việc loại mảng bám xung quanh động mạch dễ dàng đồng thời bóc tách loại bỏ lớp vỏ thành mạch máu (các tế bào nội mô thành mạch máu bám tương đối lỏng lẻo vào thành mạch nên dễ dàng loại bỏ giai đoạn ủ với collagenase lần 1) Như sau ủ collagenase lần để động mạch nghỉ 24 bóc tách mô xung quanh lớp tế động mạch thu lớp động mạch (lớp gồm chủ yếu tế bào trơn) Tiếp tục ủ với collagenase 2% lần elastase 1% thu tế bào có hình thoi sáng đặc biệt có tế bào chết trôi môi trường nuôi cấy sau nuôi cấy ngày Vì chọn qui trình để áp dụng cho nghiên cứu 4.2 Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ số chất chiết tách từ nụ Vối Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch chủ sử dụng nghiên cứu phương pháp MTT (MTT assay) MTT [3-(4,5- dimethylthiazol – – yl) – diphenyl tetrazolium bromid] chất hóa học có màu vàng, MTT tích điện dương thâm nhập vào nhân tế bào sống tạo thành formazan không tan, có màu tím đen ty thể tế bào sống có chứa enzym succinat dehydrogenase 44 Ở tế bào chết enzym succinat dehydrogenase nên không tạo thành formazan Các tế bào sau hòa tan dung môi hữu (chúng sử dụng DMSO) để hòa tan formazan, sau đo quang để định lượng formazan Sự giảm lượng MTT hoạt động trao đổi chất tế bào chứng cho khả sống chết tế bào Trước nhà nghiên cứu có nhiều phương pháp để đánh giá mức độ tăng sinh tế bào Trong có phương pháp sử dụng chất phóng xạ 51Cr 125I, phương pháp thử nghiệm sinh tổng hợp DNA kết hợp với BrdU 5-bromo-2-deoxyuridin) Đồng thời có phương pháp đánh giá tăng sinh mà không sử dụng chất phóng xạ phương pháp sử dụng muối tetrazolium đo lường gián tiếp hoạt động chuyển hóa tế bào (MTT, XTT, MTS, WST1), phương pháp kháng thể đơn dòng, phát dấu hiệu tăng sinh MKI-67, PCLA Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp MTT phương pháp có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp lại phù hợp với điều kiện thí nghiệm So với phương pháp sử dụng chất phóng xạ có thời gian thí nghiệm kéo dài, đặc biệt cần tuân thủ nghiêm ngặt qui trình liên quan đến sử dụng, thải bỏ chất phóng xạ (hiện phòng thí nghiệm môn Dược lý chưa sử dụng quy trình này) Phương pháp MTT không độc hại, đơn giản dễ dàng sử dụng Thuốc thử MTT bổ sung trực tiếp vào tế bào môi trường nuôi cấy không 45 độc hại cho tế bào người sử dụng Phương pháp MTT tốn kém, rẻ tiền Do có tính đồng cao nên phương pháp MTT sử dụng quy mô lớn, hoạt lực tương đương với phương pháp sử dụng 3H thymindine hợp chất tetrazolium khác Hoạt động di chuyển tăng sinh tế bào trơn điều hoà yếu tố kích thích tăng trưởng chất ức chế Yếu tố ức chế bao gồm: heparin sulfat, nitric oxid (NO) yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF-β) Các chất kích thích PDGF, ET-1, thrombin, FGF, FN-1 IL-1 PDGF đóng vai trò quan trọng Khi có tổn thương thành mạch máu, tạo thành vệt mỡ, tế bào bọt yếu tố tăng trưởng tiểu cầu, yếu tố tăng sinh xơ tăng hoạt hóa tế bào trơn chuyển sang trạng thái hoạt động, tăng sinh tăng di chuyển tế bào trơn mạch máu từ màng Tế bào trơn tăng sản xuất chất góp phần hình thành mảng xơ vữa yếu tố tăng trưởng tiểu cầu đóng vai trò quan trọng hình thành mảng xơ vữa Vì vậy, nghiên cứu sử dụng yếu tố tăng trưởng tiểu cầu để kích thích tăng sinh tế bào trơn dộng mạch đồng thời đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào trơn động mạch yếu tố tăng trưởng tiểu cầu chất chiết tách từ nụ Vối 7-hydroxy-5-methoxy6,8-dimethylflavone (CO1); 6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin (CO2); 7-hydroxy-5-methoxy-8-methylflavanone (CO3) Kết nghiên cứu cho thấy, giá trị mật độ quang lô tế bào ủ với PDGF lớn rõ rệt lô tế bào không ủ với PDGF Điều có nghĩa: lô tế bào có mặt PDGF, lượng tế bào tăng lên đáng kể so với lượng tế bào lô không ủ với PDGF (p