Tiến hành triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của chuột theo 2 phương pháp:
Phương pháp 1: Theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự có chỉnh sửa.
Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee và cộng sự. Cụ thể phương pháp 1 được tiến hành gồm các bước như sau :
Bƣớc 1 : Tách động mạch chủ
Trước khi mổ chuột, làm ấm các dung dịch đệm và môi trường ở 370 C Làm chết chuột bằng cách trật khớp cổ, xịt cồn 70% để sát trùng. Để chuột ở tư thế nằm ngửa.
24
Bộc lộ ổ bụng và khoang ngực. Loại bỏ phổi, và gạt các cơ quan trong ổ bụng để thấy rõ toàn bộ động mạch chủ cho đến đoạn cuối phân nhánh ở thận. Sử dụng bơm tiêm vô trùng chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie bơm vào mỏm tim loại bỏ máu trong lòng động mạch. Cô lập động mạch chủ và đặt động mạch trong ống falcon có chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie. Loại bỏ mỡ và các tổ chức bám vào thành động mạch bằng kéo và kẹp.
Bƣớc 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ
Cắt động mạch chủ cho vào các ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 1%. Nhẹ nhàng đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 trong 15 phút.
Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ sang ống falcon hoặc đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 ở các nồng độ khác nhau (1%, 1,5%, 2% và 2,5%) và có bổ sung thêm elastase 1%. Ủ trong tủ ấm khoảng thời gian 2 giờ và 3 giờ (để yên trong 2/3 thời gian đầu, sau đó thỉnh thoảng lắc và quan sát sự tách rời của các tế bào).
Ly tâm loại bỏ dịch nổi.
Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM đã bổ sung FBS 10%, penicillin/streptomycin 1% (DMEM hoàn chỉnh) 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy. Để đĩa nuôi cấy có các tế bào ở 370C trong môi trường có chứa 95% O2 và 5% CO2, để yên 2-7 ngày. Quan sát sự phát triển của tế bào để lựa chọn thời gian thay môi trường mới phù hợp.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột
Cấy chuyển tế bào sau khi nuôi cấy sơ cấp bằng cách: Đầu tiên, hút bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng 3 mL dung dịch đệm PBS 1X vô trùng, 2 lần. Ủ tế bào trong 2 mL trypsin trong 3-4 phút. Gõ nhẹ nhàng đồng thời theo dõi dưới kính hiển vi cho tới khi hầu hết tế bào tách ra khỏi bề mặt nuôi
25
cấy. Trung hòa trypsin bằng cách thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi trên mặt và bổ sung thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Chuyển tế bào vào các đĩa nuôi cấy mới và nuôi ở nhiệt độ 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày, thay môi trường khi quan sát thấy sự biến đổi màu của môi trường để quyết định thời gian cần thiết để thay đổi môi trường và quan sát mật độ tế bào trong đĩa nuôi cấy để quyết định thời gian cấy chuyển. Tế bào được cấy chuyển thứ cấp 4 lần trước khi được sử dụng đánh giá tác dụng của thuốc.
Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee Moo Yeol và cộng sự có chỉnh sửa. Cụ thể, phương pháp 2 được tiến hành gồm các bước như sau:
Bước 1: Tách động mạch chủ (tiến hành như phương pháp 1). Bước 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ.
Động mạch chủ sau khi được tách rời khỏi cơ thể sống và được loại bớt các mô mỡ và các tổ chức bám xung quanh, cho vào ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2% pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie, đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C (với môi trường có 95% O2 và 5% CO2) trong 60 phút. Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ vào đĩa nuôi cấy có chứa dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và đặt trong tủ nuôi cấy 24 giờ.
Ngày hôm sau tiến hành loại bỏ các mảng bám và lớp tế bào nội mô phía trong lòng ống động mạch. Sau đó chuyển động mạch sang đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1% (pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie) cắt nhỏ động mạch và ủ trong tủ ấm 1 giờ. Dùng pipet trộn đều nhiều lần để giúp các tế bào tách nhau ra tốt hơn. Sau đó ly tâm loại bỏ hoàn toàn dịch nổi. Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM
26
hoàn chỉnh 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột giống như phương pháp 1.