Sau khi tiến hành tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống và kiểm soát các điều kiện nuôi cấy chúng tôi đã thu được 2 qui trình tách tế bào như sau:
Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phƣơng pháp 1:
Hình 3.1. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 1 Tiệt trùng bằng cồn 70% Rửa tế bào 2 lần 5 ngày Làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ Mổ tách động mạch chủ Collagenase tuýp 2 nồng độ 1% trong 15 phút Collagenase tuýp 2 nồng độ 2% + Elastase nồng độ 1% trong 3 giờ
Nuôi cấy trong môi trường DMEM hoàn chỉnh
Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyển và nuôi cấy tế bào
30
Quy trình được mô tả chi tiết như sau: làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ, để chuột ở tư thế nằm ngửa, trước khi mổ sát trùng bằng cồn 70%. Dùng kéo bộc lộ khoang ngực và ổ bụng. Loại bỏ phổi và gạt các bộ phận trong ổ bụng (thao tác thực hiện nhẹ nhàng tránh chảy máu). Khi đã thấy được động mạch chủ nhẹ nhàng loại bỏ các mảng bám xung quanh động mạch.
Hình 3.2. Bộc lộ động mạch chủ chuột
Hình 3.3. Đăt động mạch chủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 Động
31
Cho động mạch chủ vào dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 1%, ủ trong tủ ấm 370C trong 15 phút.
Loại bỏ collagenase tuýp 2. Loại bỏ các mảng bám xung quanh động mạch chủ.
Tiếp tục ủ động mạch chủ trong collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1% trong 2 giờ.
Rửa tế bào 2 lần bằng DMEM đã bổ sung FBS 10% và penicillin/ streptomycin 1% (DMEM hoàn chỉnh). Cách thực hiện như sau: bổ sung DMEM hoàn chỉnh, trộn đều tế bào, ly tâm với tốc độ 3000 vòng trong 3 phút, loại bỏ môi trường cũ, thêm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó cho vào đĩa nuôi cấy ở 370C trong môi trường không khí chứa 95% O2 và 5% CO2. Để yên tế bào trong 5 ngày mà không tác động gì thêm.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào: rửa tất cả các giếng nuôi cấy bằng 3 mL PBS 1X vô trùng, 2 lần. Tách tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy cũ bằng 2 mL trypsin 0,25% trong 3-4 phút, đồng thời gõ nhẹ nhàng. Quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra tế bào đã tách hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy chưa. Trung hòa trypsin bằng DMEM hoàn chỉnh. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi rồi thêm DMEM hoàn chỉnh. Chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy mới ở 370C, môi trường 95% O2 và 5% CO2, theo dõi tế bào hàng ngày. Thay môi trường khi quan sát thấy sự biến đổi màu của môi trường để quyết định thời gian cần thiết để thay đổi môi trường và quan sát mật độ tế bào trong đĩa nuôi cấy để quyết định thời gian cấy chuyển. Tế bào được cấy chuyển thứ cấp 4 lần trước khi được sử dụng đánh giá tác dụng của dịch chiết.
Với 2 động mạch chủ tách từ 2 chuột cống, bằng phương pháp này đã tách được tế bào cơ trơn động mạch chủ. Sau nuôi cấy 5 ngày số lượng tế bào mới chỉ phủ kín được khoảng 40% bề mặt của chai nuôi cấy kích thước 25 cm. Các tế bào cơ trơn hình thoi tương đối sáng tuy nhiên còn nhiều tế bào có
32
hình thái không đẹp như nhân không tròn, rìa tế bào không gọn (xuất hiện các tế bào có hình thù xấu như hình tam giác, hình sao, rìa xù xì).
Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phƣơng pháp 2:
Hình 3.4. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 2 Tiệt trùng bằng cồn 70%
Loại mô mỡ và các tổ chức xung quanh
5 ngày Làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ Mổ tách động mạch chủ Collagenase tuýp 2 nồng độ 2% trong 60 phút
Cắt nhỏ và ủ động mạch trong collagenase tuýp 2 nồng độ 2% + elastase 1% trong 1 giờ
Dùng pipet trộn đều tế bào
Ly tâm, loại dịch nổi
Bổ sung DMEM hoàn chỉnh Rửa tế bào 2 lần
Nuôi cấy trong MT DMEM hoàn chỉnh
Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyển và nuôi cấy tế bào
33
Quy trình được mô tả chi tiết như sau:
Mổ cô lập động mạch chủ như phương pháp 1.
Sau khi thu được động mạch chủ cho vào dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2%, ủ trong 50 phút.
Loại các mô mỡ và các tạp bám xung quang động mạch.
Đặt động mạch trong dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và để trong tủ nuôi cấy 24 giờ.
Loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa động mạch bằng dung dịch đệm HBSS không canxi và magie 2 lần.
Loại bỏ lớp vỏ ngoài của động mạch của động mạch.
Cắt nhỏ động mạch và ủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1%, cắt nhỏ và ủ ở trong tủ nuôi cấy 370C trong môi trường có chứa 95% O2 và 5% CO2, trong 60 phút.
Dùng pipet trộn đều tế bào để giúp tế bào tách nhau ra tốt hơn.
Ly tâm với tốc độ 3000 vòng trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi. Bổ sung DMEM hoàn chỉnh và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng DMEM hoàn chỉnh (tương tự như phương pháp 1).
Thêm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó cho vào đĩa nuôi cấy ở 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2, để yên trong 5 ngày.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào: tương tự phương pháp 1.
Với 2 động mạch chủ tách từ 2 chuột cống, bằng phương pháp này đã tách được tế bào động mạch chủ. Sau nuôi cấy 5 ngày số lượng tế bào đã phủ kín được khoảng 70% bề mặt của chai nuôi cấy kích thước 25 cm. Các tế bào cơ trơn hình thoi tương đối sáng, rìa tế bào gọn, đặc biệt trong môi trường nuôi cấy có rất ít mảng tế bào chết.
34
Hình 3.5. Tế bào cơ trơn động mạch chủ thu được theo phương pháp 1
35
3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối của một số chất chiết tách từ nụ Vối
3.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối của một số chất chiết tách từ nụ Vối
Tế bào cơ trơn động mạch chủ được tách từ chuột cống bằng phương pháp 2. Sau khi được cấy chuyển thứ phát 4 lần được chia vào các đĩa 96 giếng với mật độ 5.103 tế bào/giếng.
Lô chứng: tế bào được ủ với dung môi pha mẫu thử. Lô thử: tế bào được ủ với mẫu thử trong 24 giờ.
Sau đó ủ với MTT và đo mật độ quang ở bước sóng 550 nm. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang của các lô thử so với lô chứng
Lô Mẫu thử/ nồng độ Giá trị mật độ
quang (TB±SD) p/ so với lô chứng trắng p/ so với lô chứng Chứng trắng - 0,845 ± 0,130 Chứng PDGF (50 ng/mL) 2,407 ± 0,615 < 0,01 Thử 1 PDGF (50 ng/mL) + CO1( 3 µg/mL) 1,534 ± 0,413 < 0,05 Thử 2 PDGF (50 ng/mL) + CO2( 3 µg/mL) 2,229 ± 0,530 > 0,05 Thử 3 PDGF (50 ng/mL) + CO3( 3 µg/mL) 2,157 ± 0,390 > 0,05 Nhận xét:
- Giá trị mật độ quang lô tế bào ủ với PDGF lớn hơn rõ rệt lô tế bào không ủ với PDGF (p<0,01)
36
- Tế bào ủ với CO1 có giá trị mật độ quang khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô tế bào có ủ PDGF (p<0,05).
- Tế bào ủ với CO2và CO3 đều không có giá trị mật độ quang thấp hơn rõ rệt so với lô tế bào có ủ PDGF (p>0,05).
Số lần tăng sinh tế bào so với lô chứng trắng của các mẫu thử như sau:
PDGF 50 ng/mL *: p< 0,05 khi so với lô chứng
##: p< 0,001 khi so với lô chứng trắng
Hình 3.7. Số lần tăng sinh tế bào của các lô thử so với lô chứng trắng Nhận xét: Lô chứng (có bổ sung PDGF) tế bào tăng sinh gấp 2,847 lần so với không bổ sung PDGF. Ở các lô tế bào có ủ mẫu thử, chỉ có lô tế bào ủ với CO1 có mật độ quang nhỏ hơn đáng kể so với lô chứng nhưng nhưng mật độ quang vẫn lớn hơn 1,815 lần so với lô tế bào không ủ PDGF (lô chứng trắng). 1 2.847## 1.815*## 2.636## 2.551## 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
37