Tinh dầu lá vối có khoảng 30 thành phần đã được xác định trong đó các thành phần chính là (Z)-β-ocimen 32,1%, myrcen 24,6%, β-caryophylen 14,5% và (E)-β-ocimen 9,4% [2].
Theo nghiên cứu của Hà Thị Kim Quý và cộng sự năm 2016, từ lá
Cleistocalyx operculatus tìm thấy hai acetophenon mới là (2S)-2,6-dihydroxy- 4-methoxy-5,7-dimethylcoumaran-3-one và 2,4,6-trihydroxy-2-methoxy- 3,5-dimethylacetophenone, một flavonoid mới là (2S)-7,2-dihydroxy-5- methoxy-6,8-dimethylflavanone, cùng với sáu hợp chất đã biết là (2S)-7-
hydroxy-5-methoxy-6,8- dimethylflavanone, 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-
dimethylisoflavone,2,4-dihydroxy-6-methoxy-3,5-dimethylchalcone
19
dimethylether 3-O-β-D-galactopyranoside và 3-O-methylellagic acid-4-O-α- L-rhamnopyranosid.
Vỏ cây Vối chứa một chất triterpen nhóm olean được nhận dạng là acid arjunolic.
Có 9 chất đã được phân lập từ nụ vối trong đó 8 chất đã được nhận dạng là 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchacon, 5-7-dihydroxy- 6,8-dimethylflavon, 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanon, ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và acid cinamic [2].
Nụ Vối còn có tinh dầu trong đó có myrcen, geraniol, cis-caryophylen, 8-murolen, alo-aromadendren, δ-cadinen, farnesol.
Năm 2012, PGS.TS. Phương Thiện Thương, TS. Đào Trọng Tuấn (Viện Dược liệu) đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 flavonoid từ nụ Vối là : 7-
hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylisoflavone ; 5,7-dihydoroxy-6,8-
dimethyldihydroflavonol ; 2,7-dihydoroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanone ; 4,2’,4’-trihydoroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone ; 7-hydroxy-5-methoxy- 6,8-dimethylflavone ; 5-hydroxy-7-methoxy-6,8-dimethylflavanone ; 2’,4’- dihydoroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone ; 2’,4’-dihydoroxy-3’-methyl-6’- methoxychalcone ; 6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin ; (2S)-8-formyl-5- hydroxy-7-methoxy-6-methylflavanone ;7-hydroxy-5-methoxy-8-
methylflavanone ; 8-methylpinocembrin ; 5,7-dihydoroxy-6,8-
dimethylflavanone ; 2,2’,4’-trihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone [11].
1.4.5. Công dụng và tác dụng dƣợc lý
Công dụng
Từ xưa nụ và lá Vối đã được nhân dân Việt Nam nấu nước uống vừa thơm vừa có tác dụng tiêu cơm, nhuận tràng. Liều dùng hàng ngày là 10-20g. Lá vối tươi hay khô sắc đặc là thuốc sát trùng dùng rửa mụn nhọt, ghẻ lở.
20
Ở Trung Quốc, nụ Vối được dùng chữa sốt, đau đầu, ăn không tiêu, lỵ trực trùng, viêm dạ dày - ruột cấp [2].
Tác dụng dược lý
Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm phân lập, xác định thành phần của cây Vối, cũng như nghiên cứu tác dụng của cây.
Năm 2015, tác giả Yu WG và cộng sự vào đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của tinh dầu được phân lập từ chồi của Cleistocalyx operculatus
(Roxb.) Merr et Perry. Trong nghiên cứu này, chồi của Cleistocalyx operculatus ức chế đáng kể tác dụng kích thích tiết các cytokin gây viêm bởi lipopolysaccharid. Điều đó cho thấy, chồi của Cleistocalyx operculatus có tác dụng chống viêm là do ức chế biểu hiện của các cytokin gây viêm [19].
Nghiên cứu của tác giả Trương Tuyết Mai và Nguyễn Văn Chuyên về hoạt động chống tăng đường huyết của dịch chiết tách từ nụ Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry vào năm 2007 cho thấy, dịch chiết nụ hoa
Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry ức chế mạnh các alpha- glucosidase. Kiểm tra đường huyết sau ăn ở chuột bình thường và chuột nhắt đái tháo đường do streptozotocin cho thấy Cleistocalyx operculatus (500 mg/kg cân nặng) làm giảm glucose máu rõ rệt nhưng tác dụng này vẫn kém hơn khi so với acarbose (25 mg/kg cân nặng). Trên chuột đái tháo đường gây bằng streptozotocin, Cleistocalyx operculatus (500 mg/kg/ngày) có tác dụng làm giảm rõ rệt glucose huyết chuột khi so với lô chứng. Các kết quả này cho thấy Cleistocalyx operculatus rất có tiềm năng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường [26].
Một số phenolic có hoạt tính kháng virus cũng được chiết xuất từ lá Cleistocalyx operculatus. Theo Hà Thị Kim Quý và cộng sự, flavonoid từ lá Cleistocalyx operculatus (2S)-7,2-dihydroxy-5-methoxy-6,8- dimethylflavanone có khả năng ức chế enzym neuraminidases từ các virus cúm khác nhau, bao gồm cả H1N1, H9N2, và virus kháng oseltamivir H1N1
21
(H274Y đột biến), HEK293 (giá trị IC50 tương ứng từ 5,07 ± 0,94 mM đến 9,34 ± 2,52 mM) [23].
Gần đây một số công trình nghiên cứu về cây Vối đã được tiến hành nhằm làm rõ công dụng của cây Vối tại Việt Nam. Năm 2010, Viện dinh dưỡng, Việt Nam kết hợp với trường đại học Phụ nữ Ochanomizu, Nhật Bản đã tiến hành đánh giá hiệu quả kiểm soát đường huyết của nụ Vối trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 tại Hà Nội và đưa ra kết luận: sử dụng nụ Vối có tác dụng hạn chế tăng đường huyết sau ăn, kiểm soát được đường huyết lâu dài trên bệnh nhân đái tháo đường, kiểm soát được rối loạn lipid máu lâu dài trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 như làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol và triglycerid, tăng chỉ số HDL-C trên nhóm bệnh nhân dùng nụ Vối [7].
Vào năm 2012, PGS. TS. Phương Thiện Thương và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của 14 flavonoid từ nụ Vối đồng thời cũng đánh giá tác dụng của 11 flavonoid trên một số dòng tế bào ung thư in vitro
[11]. Kết quả cho thấy, tất cả các flavonoid đều có độc tính đối với dòng tế bào ung thư MCF7, A549 và Hela với giá trị IC50 nằm trong khoảng 1,3 - 27,7 µg/mL, trong đó 5-hydroxy-7-methoxy-6,8-dimethylflavanone cho tác dụng ức chế mạnh nhất sự phát triển của dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 là 1,3 µg/mL.
22
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Động vật nghiên cứu
Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, khỏe mạnh, 4-5 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 80 - 120g, do Học viện Quân y cung cấp.
Động vật được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu tại bộ môn Dược lực, chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do.
2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị 2.1.2.1.Hóa chất 2.1.2.1.Hóa chất
Các hợp chất được chiết tách từ nụ vối được cung cấp bởi Tiến sĩ Đào Trọng Tuấn (Viện Dược liệu) gồm 3 flavonoid:
7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavone (ký hiệu là CO1) 6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin (ký hiệu là CO2) 7-hydroxy-5-methoxy-8-methylflavanone (ký hiệu là CO3)
Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (glucose nồng độ cao, Invitrogen-Đức), huyết thanh bò (FBS, Invitrogen-Đức), penicillin/streptomycin (hãng Gibco), Trypsin 0.25% (hãng Corning), đệm phosphate, ethanol 70%, collagenase tuýp 2 (hãng Worthington), elastase (hãng Worthington).
Các hóa chất thí nghiệm khác (KH2PO4, NaOH, NaHCO3 được cung cấp bởi hãng Merk).
Chuẩn bị thuốc thử:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh : DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicillin/streptomycin và bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi sử dụng.
Dung dịch đệm HBSS không có canxi và magie. Dung dịch đệm HBSS có canxi và magie.
23
2.1.2.2.Trang thiết bị nghiên cứu
Dụng cụ nuôi cấy tế bào (chai nuôi cấy, đĩa petri, đĩa 6 giếng, đĩa 96 giếng…)
Micropipet với các loại thể tích 2-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL, ống Eppendort thể tích 15 mL và 50 mL
Máy đo PH (EUTECH) Máy li tâm (HERMLE Z300)
Tủ thao tác cấy tế bào (EUROCLONE Biological Safety Mỹ) Tủ ấm CO2 (SANYO)
Bể ổn nhiệt (MEMMERT) Tủ mát, tủ lạnh (40C, -200C) Dụng cụ đếm tế bào
Kính hiển vi soi ngược (OLYMPUS CX41) Nồi hấp khử trùng
Một số máy móc thiết bị khác phục vụ nuôi cấy tế bào
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống
Tiến hành triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của chuột theo 2 phương pháp:
Phương pháp 1: Theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự có chỉnh sửa.
Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee và cộng sự. Cụ thể phương pháp 1 được tiến hành gồm các bước như sau :
Bƣớc 1 : Tách động mạch chủ
Trước khi mổ chuột, làm ấm các dung dịch đệm và môi trường ở 370 C Làm chết chuột bằng cách trật khớp cổ, xịt cồn 70% để sát trùng. Để chuột ở tư thế nằm ngửa.
24
Bộc lộ ổ bụng và khoang ngực. Loại bỏ phổi, và gạt các cơ quan trong ổ bụng để thấy rõ toàn bộ động mạch chủ cho đến đoạn cuối phân nhánh ở thận. Sử dụng bơm tiêm vô trùng chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie bơm vào mỏm tim loại bỏ máu trong lòng động mạch. Cô lập động mạch chủ và đặt động mạch trong ống falcon có chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie. Loại bỏ mỡ và các tổ chức bám vào thành động mạch bằng kéo và kẹp.
Bƣớc 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ
Cắt động mạch chủ cho vào các ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 1%. Nhẹ nhàng đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 trong 15 phút.
Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ sang ống falcon hoặc đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 ở các nồng độ khác nhau (1%, 1,5%, 2% và 2,5%) và có bổ sung thêm elastase 1%. Ủ trong tủ ấm khoảng thời gian 2 giờ và 3 giờ (để yên trong 2/3 thời gian đầu, sau đó thỉnh thoảng lắc và quan sát sự tách rời của các tế bào).
Ly tâm loại bỏ dịch nổi.
Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM đã bổ sung FBS 10%, penicillin/streptomycin 1% (DMEM hoàn chỉnh) 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy. Để đĩa nuôi cấy có các tế bào ở 370C trong môi trường có chứa 95% O2 và 5% CO2, để yên 2-7 ngày. Quan sát sự phát triển của tế bào để lựa chọn thời gian thay môi trường mới phù hợp.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột
Cấy chuyển tế bào sau khi nuôi cấy sơ cấp bằng cách: Đầu tiên, hút bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng 3 mL dung dịch đệm PBS 1X vô trùng, 2 lần. Ủ tế bào trong 2 mL trypsin trong 3-4 phút. Gõ nhẹ nhàng đồng thời theo dõi dưới kính hiển vi cho tới khi hầu hết tế bào tách ra khỏi bề mặt nuôi
25
cấy. Trung hòa trypsin bằng cách thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi trên mặt và bổ sung thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Chuyển tế bào vào các đĩa nuôi cấy mới và nuôi ở nhiệt độ 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày, thay môi trường khi quan sát thấy sự biến đổi màu của môi trường để quyết định thời gian cần thiết để thay đổi môi trường và quan sát mật độ tế bào trong đĩa nuôi cấy để quyết định thời gian cấy chuyển. Tế bào được cấy chuyển thứ cấp 4 lần trước khi được sử dụng đánh giá tác dụng của thuốc.
Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee Moo Yeol và cộng sự có chỉnh sửa. Cụ thể, phương pháp 2 được tiến hành gồm các bước như sau:
Bước 1: Tách động mạch chủ (tiến hành như phương pháp 1). Bước 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ.
Động mạch chủ sau khi được tách rời khỏi cơ thể sống và được loại bớt các mô mỡ và các tổ chức bám xung quanh, cho vào ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2% pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie, đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C (với môi trường có 95% O2 và 5% CO2) trong 60 phút. Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ vào đĩa nuôi cấy có chứa dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và đặt trong tủ nuôi cấy 24 giờ.
Ngày hôm sau tiến hành loại bỏ các mảng bám và lớp tế bào nội mô phía trong lòng ống động mạch. Sau đó chuyển động mạch sang đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1% (pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie) cắt nhỏ động mạch và ủ trong tủ ấm 1 giờ. Dùng pipet trộn đều nhiều lần để giúp các tế bào tách nhau ra tốt hơn. Sau đó ly tâm loại bỏ hoàn toàn dịch nổi. Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM
26
hoàn chỉnh 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột giống như phương pháp 1.
2.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ
của một số chất chiết tách từ nụ Vối
2.2.2.1.Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối
Tế bào cơ trơn mạch máu sau khi tách và nuôi cấy được chia vào đĩa 96 giếng với mật độ thích hợp và được phân chia thành các lô:
Lô trắng: 4 giếng tế bào, không bổ sung PDGF và dịch chiết.
Lô chứng: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL gây tăng sinh tế bào và dung môi để pha dịch chiết (DMSO 0,1%).
Lô thử 1: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO1 với nồng độ 3 µg/mL.
Lô thử 2: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO2 với nồng độ 3 µg/mL.
Lô thử 3: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO3 với nồng độ 3 µg/mL.
Ủ tế bào với mẫu thử
Các mẫu thử được pha trong DMSO với nồng độ cuối cùng của các mẫu thử trong các giếng tế bào là 3 µg/mL và lượng DMSO bổ sung vào trong mỗi giếng ≤ 0, 1%. Ủ tế bào với mẫu thử trong 24 giờ. Mỗi mẫu thử được thử trong 4 giếng tế bào. Song song tiến hành với các giếng chứng (bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO).
Sau khi ủ tế bào với mẫu thử 24 giờ, thêm 20 μL thuốc thử MTT (nồng độ 5 mg/mL) vào mỗi giếng, trộn đều. Ủ các đĩa tế bào 5 giờ ở 370
27
môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Hút loại bỏ dung dịch nổi và thêm 50 µL DMSO, trộn đều và để trong bóng tối 15 phút. Đem đo quang ở bước sóng 550 nm bằng máy ELISA.
Bảng 2.1: Bố trí trong từng giếng với dịch chiết CO1, CO2, CO3
Thành phần Lô trắng Lô chứng Lô CO1 Lô CO2 Lô CO3
Tế bào + + + + + PDGF (50 ng/mL) + + + + DMSO (0,1%) + + CO1(3 µg/mL) + CO2(3 µg/mL) + CO3(3 µg/mL) + Cách đánh giá kết quả:
So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử với các giếng không ủ với mẫu thử (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử đến chức năng sống của tế bào.
Mức độ ức chế tăng sinh tế bào của mẫu thử so với lô chứng được tính theo công thức:
Trong đó: ODchứng : mật độ quang của dung dịch chứng ODthử : mật độ quang của dung dịch thử
28
2.2.2.2.Đánh giá độc tính trên tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối
Khi đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối, nhóm nghiên cứu cũng đánh giá khả năng gây độc tế bào của các dịch chiết này. Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào của các mẫu thử là kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay).
Tế bào cơ trơn động mạch chủ sau khi cấy chuyển 4 lần được chuyển vào đĩa 96 giếng có nồng độ 2.103
tế bào/giếng và được chia thành các lô như sau: Lô chứng: tế bào được bổ sung dung môi để pha mẫu thử DMSO 0,1%. Lô thử: tế bào được bổ sung thêm các mẫu thử với các nồng độ cuối cùng là 3 µg/mL, 6 µg/mL, 12 µg/mL (mẫu thử được pha trong DMSO) ủ trong vòng 48 giờ.
Sau 48 giờ, tế bào được ủ với MTT pha trong PBS (5 mg/mL) trong 5 giờ, sau đó loại bỏ dung dịch PBS có chứa MTT và cho vào mỗi đĩa tế bào