Hóa chất và trang thiết bị - Đánh giá tác dụng ức- 123docz.net

2.1.2.1.Hóa chất

Các hợp chất được chiết tách từ nụ vối được cung cấp bởi Tiến sĩ Đào Trọng Tuấn (Viện Dược liệu) gồm 3 flavonoid:

7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavone (ký hiệu là CO1) 6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin (ký hiệu là CO2) 7-hydroxy-5-methoxy-8-methylflavanone (ký hiệu là CO3)

Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (glucose nồng độ cao, Invitrogen-Đức), huyết thanh bò (FBS, Invitrogen-Đức), penicillin/streptomycin (hãng Gibco), Trypsin 0.25% (hãng Corning), đệm phosphate, ethanol 70%, collagenase tuýp 2 (hãng Worthington), elastase (hãng Worthington).

Các hóa chất thí nghiệm khác (KH2PO4, NaOH, NaHCO3 được cung cấp bởi hãng Merk).

Chuẩn bị thuốc thử:

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh : DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicillin/streptomycin và bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi sử dụng.

Dung dịch đệm HBSS không có canxi và magie. Dung dịch đệm HBSS có canxi và magie.

2.1.2.2.Trang thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ nuôi cấy tế bào (chai nuôi cấy, đĩa petri, đĩa 6 giếng, đĩa 96 giếng…)

Micropipet với các loại thể tích 2-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL, ống Eppendort thể tích 15 mL và 50 mL

Máy đo PH (EUTECH) Máy li tâm (HERMLE Z300)

Tủ thao tác cấy tế bào (EUROCLONE Biological Safety Mỹ) Tủ ấm CO2 (SANYO)

Bể ổn nhiệt (MEMMERT) Tủ mát, tủ lạnh (40C, -200C) Dụng cụ đếm tế bào

Kính hiển vi soi ngược (OLYMPUS CX41) Nồi hấp khử trùng

Một số máy móc thiết bị khác phục vụ nuôi cấy tế bào

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống

Tiến hành triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của chuột theo 2 phương pháp:

 Phương pháp 1: Theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự có chỉnh sửa.

 Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee và cộng sự. Cụ thể phương pháp 1 được tiến hành gồm các bước như sau :

Bƣớc 1 : Tách động mạch chủ

Trước khi mổ chuột, làm ấm các dung dịch đệm và môi trường ở 370 C Làm chết chuột bằng cách trật khớp cổ, xịt cồn 70% để sát trùng. Để chuột ở tư thế nằm ngửa.

Bộc lộ ổ bụng và khoang ngực. Loại bỏ phổi, và gạt các cơ quan trong ổ bụng để thấy rõ toàn bộ động mạch chủ cho đến đoạn cuối phân nhánh ở thận. Sử dụng bơm tiêm vô trùng chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie bơm vào mỏm tim loại bỏ máu trong lòng động mạch. Cô lập động mạch chủ và đặt động mạch trong ống falcon có chứa dung dịch đệm HBSS có canxi và magie. Loại bỏ mỡ và các tổ chức bám vào thành động mạch bằng kéo và kẹp.

Bƣớc 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ

Cắt động mạch chủ cho vào các ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 1%. Nhẹ nhàng đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 trong 15 phút.

Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ sang ống falcon hoặc đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 ở các nồng độ khác nhau (1%, 1,5%, 2% và 2,5%) và có bổ sung thêm elastase 1%. Ủ trong tủ ấm khoảng thời gian 2 giờ và 3 giờ (để yên trong 2/3 thời gian đầu, sau đó thỉnh thoảng lắc và quan sát sự tách rời của các tế bào).

Ly tâm loại bỏ dịch nổi.

Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM đã bổ sung FBS 10%, penicillin/streptomycin 1% (DMEM hoàn chỉnh) 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy. Để đĩa nuôi cấy có các tế bào ở 370C trong môi trường có chứa 95% O2 và 5% CO2, để yên 2-7 ngày. Quan sát sự phát triển của tế bào để lựa chọn thời gian thay môi trường mới phù hợp.

Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột

Cấy chuyển tế bào sau khi nuôi cấy sơ cấp bằng cách: Đầu tiên, hút bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng 3 mL dung dịch đệm PBS 1X vô trùng, 2 lần. Ủ tế bào trong 2 mL trypsin trong 3-4 phút. Gõ nhẹ nhàng đồng thời theo dõi dưới kính hiển vi cho tới khi hầu hết tế bào tách ra khỏi bề mặt nuôi

cấy. Trung hòa trypsin bằng cách thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi trên mặt và bổ sung thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh. Chuyển tế bào vào các đĩa nuôi cấy mới và nuôi ở nhiệt độ 370C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày, thay môi trường khi quan sát thấy sự biến đổi màu của môi trường để quyết định thời gian cần thiết để thay đổi môi trường và quan sát mật độ tế bào trong đĩa nuôi cấy để quyết định thời gian cấy chuyển. Tế bào được cấy chuyển thứ cấp 4 lần trước khi được sử dụng đánh giá tác dụng của thuốc.

Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee Moo Yeol và cộng sự có chỉnh sửa. Cụ thể, phương pháp 2 được tiến hành gồm các bước như sau:

Bước 1: Tách động mạch chủ (tiến hành như phương pháp 1). Bước 2: Cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ.

Động mạch chủ sau khi được tách rời khỏi cơ thể sống và được loại bớt các mô mỡ và các tổ chức bám xung quanh, cho vào ống falcon có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2% pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie, đậy hờ nắp của ống và ủ ấm ở 370C (với môi trường có 95% O2 và 5% CO2) trong 60 phút. Loại bỏ collagenase tuýp 2, chuyển động mạch chủ vào đĩa nuôi cấy có chứa dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và đặt trong tủ nuôi cấy 24 giờ.

Ngày hôm sau tiến hành loại bỏ các mảng bám và lớp tế bào nội mô phía trong lòng ống động mạch. Sau đó chuyển động mạch sang đĩa petri có chứa collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1% (pha trong dung dịch đệm HBSS không canxi và magie) cắt nhỏ động mạch và ủ trong tủ ấm 1 giờ. Dùng pipet trộn đều nhiều lần để giúp các tế bào tách nhau ra tốt hơn. Sau đó ly tâm loại bỏ hoàn toàn dịch nổi. Rửa tế bào bằng dung dịch đệm DMEM

hoàn chỉnh 2 lần. Thêm dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy.

Nuôi cấy thứ cấp tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột giống như phương pháp 1.

2.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ

của một số chất chiết tách từ nụ Vối

2.2.2.1.Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối

Tế bào cơ trơn mạch máu sau khi tách và nuôi cấy được chia vào đĩa 96 giếng với mật độ thích hợp và được phân chia thành các lô:

Lô trắng: 4 giếng tế bào, không bổ sung PDGF và dịch chiết.

Lô chứng: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL gây tăng sinh tế bào và dung môi để pha dịch chiết (DMSO 0,1%).

Lô thử 1: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO1 với nồng độ 3 µg/mL.

Lô thử 2: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO2 với nồng độ 3 µg/mL.

Lô thử 3: tế bào được bổ sung thêm PDGF 50 ng/mL và mẫu thử CO3 với nồng độ 3 µg/mL.

 Ủ tế bào với mẫu thử

Các mẫu thử được pha trong DMSO với nồng độ cuối cùng của các mẫu thử trong các giếng tế bào là 3 µg/mL và lượng DMSO bổ sung vào trong mỗi giếng ≤ 0, 1%. Ủ tế bào với mẫu thử trong 24 giờ. Mỗi mẫu thử được thử trong 4 giếng tế bào. Song song tiến hành với các giếng chứng (bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO).

Sau khi ủ tế bào với mẫu thử 24 giờ, thêm 20 μL thuốc thử MTT (nồng độ 5 mg/mL) vào mỗi giếng, trộn đều. Ủ các đĩa tế bào 5 giờ ở 370

môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Hút loại bỏ dung dịch nổi và thêm 50 µL DMSO, trộn đều và để trong bóng tối 15 phút. Đem đo quang ở bước sóng 550 nm bằng máy ELISA.

Bảng 2.1: Bố trí trong từng giếng với dịch chiết CO1, CO2, CO3

Thành phần Lô trắng Lô chứng Lô CO1 Lô CO2 Lô CO3

Tế bào + + + + + PDGF (50 ng/mL) + + + + DMSO (0,1%) + + CO1(3 µg/mL) + CO2(3 µg/mL) + CO3(3 µg/mL) + Cách đánh giá kết quả:

So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử với các giếng không ủ với mẫu thử (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử đến chức năng sống của tế bào.

Mức độ ức chế tăng sinh tế bào của mẫu thử so với lô chứng được tính theo công thức:

Trong đó: ODchứng : mật độ quang của dung dịch chứng ODthử : mật độ quang của dung dịch thử

2.2.2.2.Đánh giá độc tính trên tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối

Khi đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối, nhóm nghiên cứu cũng đánh giá khả năng gây độc tế bào của các dịch chiết này. Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào của các mẫu thử là kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay).

Tế bào cơ trơn động mạch chủ sau khi cấy chuyển 4 lần được chuyển vào đĩa 96 giếng có nồng độ 2.103

tế bào/giếng và được chia thành các lô như sau: Lô chứng: tế bào được bổ sung dung môi để pha mẫu thử DMSO 0,1%. Lô thử: tế bào được bổ sung thêm các mẫu thử với các nồng độ cuối cùng là 3 µg/mL, 6 µg/mL, 12 µg/mL (mẫu thử được pha trong DMSO) ủ trong vòng 48 giờ.

Sau 48 giờ, tế bào được ủ với MTT pha trong PBS (5 mg/mL) trong 5 giờ, sau đó loại bỏ dung dịch PBS có chứa MTT và cho vào mỗi đĩa tế bào thêm 50 µL DMSO trộn đều và để trong 15 phút. Đem đo quang ở bước sóng 550 nm bằng máy ELISA.

Cách đánh giá kết quả

2.2.3. Xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm SPSS 20.0.

Số liệu được biểu diễn dưới dạng (X± SD) giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. So sánh giá trị trung bình của các mẫu bằng one-way ANOVA với test hậu kiểm Dunnet để so sánh giá trị trung bình giữa các mẫu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nếu p< 0,05.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

3.1. Kết quả tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống

Sau khi tiến hành tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống và kiểm soát các điều kiện nuôi cấy chúng tôi đã thu được 2 qui trình tách tế bào như sau:

Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phƣơng pháp 1:

Hình 3.1. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 1 Tiệt trùng bằng cồn 70% Rửa tế bào 2 lần 5 ngày Làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ Mổ tách động mạch chủ Collagenase tuýp 2 nồng độ 1% trong 15 phút Collagenase tuýp 2 nồng độ 2% + Elastase nồng độ 1% trong 3 giờ

Nuôi cấy trong môi trường DMEM hoàn chỉnh

Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyển và nuôi cấy tế bào

Quy trình được mô tả chi tiết như sau: làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ, để chuột ở tư thế nằm ngửa, trước khi mổ sát trùng bằng cồn 70%. Dùng kéo bộc lộ khoang ngực và ổ bụng. Loại bỏ phổi và gạt các bộ phận trong ổ bụng (thao tác thực hiện nhẹ nhàng tránh chảy máu). Khi đã thấy được động mạch chủ nhẹ nhàng loại bỏ các mảng bám xung quanh động mạch.

Hình 3.2. Bộc lộ động mạch chủ chuột

Hình 3.3. Đăt động mạch chủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 Động

Cho động mạch chủ vào dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 1%, ủ trong tủ ấm 370C trong 15 phút.

Loại bỏ collagenase tuýp 2. Loại bỏ các mảng bám xung quanh động mạch chủ.

Tiếp tục ủ động mạch chủ trong collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1% trong 2 giờ.

Rửa tế bào 2 lần bằng DMEM đã bổ sung FBS 10% và penicillin/ streptomycin 1% (DMEM hoàn chỉnh). Cách thực hiện như sau: bổ sung DMEM hoàn chỉnh, trộn đều tế bào, ly tâm với tốc độ 3000 vòng trong 3 phút, loại bỏ môi trường cũ, thêm DMEM hoàn chỉnh. Sau đó cho vào đĩa nuôi cấy ở 370C trong môi trường không khí chứa 95% O2 và 5% CO2. Để yên tế bào trong 5 ngày mà không tác động gì thêm.

Nuôi cấy thứ cấp tế bào: rửa tất cả các giếng nuôi cấy bằng 3 mL PBS 1X vô trùng, 2 lần. Tách tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy cũ bằng 2 mL trypsin 0,25% trong 3-4 phút, đồng thời gõ nhẹ nhàng. Quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra tế bào đã tách hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy chưa. Trung hòa trypsin bằng DMEM hoàn chỉnh. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi rồi thêm DMEM hoàn chỉnh. Chuyển tế bào vào đĩa nuôi cấy mới ở 370C, môi trường 95% O2 và 5% CO2, theo dõi tế bào hàng ngày. Thay môi trường khi quan sát thấy sự biến đổi màu của môi trường để quyết định thời gian cần thiết để thay đổi môi trường và quan sát mật độ tế bào trong đĩa nuôi cấy để quyết định thời gian cấy chuyển. Tế bào được cấy chuyển thứ cấp 4 lần trước khi được sử dụng đánh giá tác dụng của dịch chiết.

Với 2 động mạch chủ tách từ 2 chuột cống, bằng phương pháp này đã tách được tế bào cơ trơn động mạch chủ. Sau nuôi cấy 5 ngày số lượng tế bào mới chỉ phủ kín được khoảng 40% bề mặt của chai nuôi cấy kích thước 25 cm. Các tế bào cơ trơn hình thoi tương đối sáng tuy nhiên còn nhiều tế bào có

hình thái không đẹp như nhân không tròn, rìa tế bào không gọn (xuất hiện các tế bào có hình thù xấu như hình tam giác, hình sao, rìa xù xì).

Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phƣơng pháp 2:

Hình 3.4. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 2 Tiệt trùng bằng cồn 70%

Loại mô mỡ và các tổ chức xung quanh

5 ngày Làm chết chuột bằng cách làm trật khớp cổ Mổ tách động mạch chủ Collagenase tuýp 2 nồng độ 2% trong 60 phút

Cắt nhỏ và ủ động mạch trong collagenase tuýp 2 nồng độ 2% + elastase 1% trong 1 giờ

Dùng pipet trộn đều tế bào

Ly tâm, loại dịch nổi

Bổ sung DMEM hoàn chỉnh Rửa tế bào 2 lần

Nuôi cấy trong MT DMEM hoàn chỉnh

Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyển và nuôi cấy tế bào

Quy trình được mô tả chi tiết như sau:

Mổ cô lập động mạch chủ như phương pháp 1.

Sau khi thu được động mạch chủ cho vào dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2%, ủ trong 50 phút.

Loại các mô mỡ và các tạp bám xung quang động mạch.

Đặt động mạch trong dung dịch đệm DMEM hoàn chỉnh và để trong tủ nuôi cấy 24 giờ.

Loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa động mạch bằng dung dịch đệm HBSS không canxi và magie 2 lần.

Loại bỏ lớp vỏ ngoài của động mạch của động mạch.

Cắt nhỏ động mạch và ủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 nồng độ 2% và elastase 1%, cắt nhỏ và ủ ở trong tủ nuôi cấy 370C trong môi trường có chứa 95% O2 và 5% CO2, trong 60 phút.

Dùng pipet trộn đều tế bào để giúp tế bào tách nhau ra tốt hơn.

Ly tâm với tốc độ 3000 vòng trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi. Bổ sung DMEM hoàn chỉnh và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng DMEM hoàn chỉnh (tương tự như phương pháp 1).