Trên thực tế hiện đã có một số công ty cung cấp dòng tế bào cơ trơn động mạch chủ SMC thương mại như SV40LT-SMC Clone HEP-SA (ATCC® CRL-2018™) … tuy nhiên tại phòng thí nghiệm Dược lực hiện không có dòng tế bào này. Hơn nữa việc sử dụng các dòng tế bào được tách ra từ cơ thể sống được cho là có nhiều ưu điểm hơn so với các dòng tế bào đã được sử lý để thương mại hóa do còn giữ được nhiều đặc tính tự nhiên của tế bào hơn.
Đã có khá nhiều các nghiên cứu viết về qui trình tách tế bào động mạch chủ từ lợn như trong nghiên cứu của tác giả Russell Ross [33], từ chuột nhắt như trong nghiên cứu của tác giả Neeta Adhikari [13], hay từ chuột cống như trong nghiên cứu của tác giả Rupande Tripathi [38] và tác giả Ricardo Villa- bellosta [39], trong nghiên cứu của mình tác giả Moo Yeol Lee cũng đã sử dụng chuột nhắt 4-5 tuần tuổi [25].
Tuy nhiên các công bố này đều mô tả một cách khá ngắn gọn qui trình tách, cô lập cũng như nuôi cấy sơ cấp, nuôi cấy thứ cấp đối với loại tế bào này. Hơn nữa, theo các nghiên cứu đã được công bố, một số thông số nghiên cứu quan trọng trong qui trình tách, cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ như loại enzym đã dùng cũng như thời gian ủ động mạch với enzym… rất khác nhau giữa các nghiên cứu. Cụ thể như trong nghiên cứu của hai tác giả Ricardo Villa-bellosta và Rupande Tripathi đều tách tế bào cơ trơn động mạch từ chuột cống nhưng tác giả Ricardo Villa-bellosta chỉ sử dụng enzym collagenase tuýp 2 trong cả 2 lần ủ (lần 1 ủ trong 15 phút, lần 2 ủ trong 90 phút), còn tác giả Rupande Tripathi ngoài sử dụng enzym collagenase tuýp 2 (ủ lần 1 từ 8-10 phút) còn sử dụng thêm enzym elastase (ủ lần 2 trong 1 giờ). Hai tác giả Neeta Adhikari và Moo Yeol Lee sử dụng chuột nhắt để tách tế bào cơ trơn động mạch cũng có sự khác nhau khi sử dụng enzym tách tế bào. Tác giả Neeta Adhikari chỉ sử dụng enzym collagenase tuýp 2, còn tác giả Moo Yeol Lee ngoài ủ tế bào lần 1 với enzym collagenase tuýp 2 trong 50
41
phút lần 2 sử dụng cả hai enzym collagenase tuýp 2 và elastase trong 1 giờ để tách tế bào.
Trong nghiên cứu này việc lựa chọn mô hình nghiên cứu được chọn lọc theo các nghiên cứu của nước ngoài nhưng có thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Chúng tôi lựa chọn sử dụng chuột cống do có động mạch chủ lớn hơn so với chuột nhắt, việc mổ lấy động mạch cũng thuận lợi hơn so với chuột nhắt đồng thời việc loại bỏ các mảng bám, mỡ dính vào thành động mạch cũng dễ dàng hơn so với thực hiện trên chuột nhắt.
Các tế bào trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau và với chất nền ngoại bào nhờ các cầu nối protein hình thành giữa các tế bào với nhau. Để tách rời các tế bào trong khối mô, người ta thường dùng các enzym protease. Mô là tập hợp tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi mô cần phải phá bỏ những cầu nối này, nhưng không gây tổn thương cho tế bào. Người ta có thể dùng cơ học hay enzym cắt. Nếu dùng phương pháp cơ học sẽ cho hiệu quả tách tế bào không cao như sử dụng enzym nhưng phương pháp sử dụng enzym nếu dùng ở nồng độ quá cao có thể gây chết tế bào. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi kết hợp cả hai phương pháp cơ học và sử dụng enzym để tăng hiệu quả tách tế bào đồng thời giảm thời gian tế bào tiếp xúc với enzym.
Trong các nghiên cứu trước đây, một số tác giả chỉ dùng collagenase mà không dung elastase. Enzym collagenase là enzym protease có vai trò phá hủy rào chắn là màng tế bào bao quanh các tế bào, vì vậy khi cho tế bào ủ với enzym collagenase lần 1 sẽ có tác dụng thủy phân liên kết giữa các tế bào cơ trơn động mạch với các mô cơ quan khác bám xung quanh kiến việc tách các mô bám xung quanh dễ dàng hơn và ít gây tổn thương cho tế bào cơ trơn. Còn elastase là enzym thường được sử dụng để phân tách các mô có chứa mạng
42
lưới sợi giữa các tế bào vì elastin được tìm thấy ở nồng độ cao nhất trong các sợi đàn hồi của mô liên kết. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cả 2 enzym collagenase và elastase để tăng khả năng tách của tế bào và enzym elastase chỉ được sử dụng ở giai đoạn ủ enzyme lần 2 (sau khi đã loại bỏ các mô bám xung quanh động mạch chủ.
Để có thể tìm phương pháp tách tế bào cơ trơn động mạch chủ tại bộ môn Dược lực chúng tôi đã tiến hành theo 2 phương pháp:
Phương pháp 1: Theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự có chỉnh sửa. Trong đó toàn bộ qui trình tách cô lập tế bào cơ trơn động mạch chủ được tiến hành trong 1 ngày.
Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee và cộng sự có chỉnh sửa. Qui trình này được tiến hành trong 2 ngày trong đó có thời gian nghỉ không cho động mạch tiếp xúc với enzym (collagenase và elastase trong 24 giờ).
Trong quá trình là thực nghiệm, trước tiên chúng tôi đã tiến hành tách tế bào theo phương pháp 1 (theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự). Với các bước tiến hành phương pháp 1 như đã mô tả trong phần kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy, để các tế bào có thể tách rời nhau cần ủ động mạch chủ với enzym lần 2 (collagelnase 2% và elastase 1%) trong vòng 3 tiếng. Với nồng độ enzym nhỏ hơn (collagelnase 1% và 1,5%) các tế bào tách rời khỏi nhau ít tuy nhiên khi tăng nồng độ collagelnase lên 2,5% và ủ trong 3 giờ các tế bào tách rời nhau khá tốt nhưng rất nhiều tế bào bị tan rã. Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn nồng độ collagelnase là 2% và ủ trong 3 giờ. Với nồng độ enzym và thời gian ủ này, các tế bào tách rời nhau khá tốt tuy nhiên với thời gian ủ này các tế bào sống khá yếu (lượng tế bào sống sót thu được sau 1 ngày nuôi cấy ít) và hình thái tế bào không đẹp (nhiều tế bào không còn ở dạng hình thoi sáng mà có các hình thù như hình sao, hình tam
43
giác, rìa tế bào không trơn nhẵn, nhân tế bào không tròn. Điều đó cho thấy các tế bào này đã bị biến đổi không còn giữ được hình thái ban đầu. Do đó nhóm nghiên cứu đã giảm thời gian ủ enzym xuống còn 2,5 giờ. Tế bào thu được nhiều hơn, hình dạng tế bào chủ yếu là hình thoi sáng mặc dù vậy vẫn còn khá nhiều tế bào hình thái không đẹp.
Tiêp tục giảm thời gian ủ enzym xuống còn 2 giờ, các tế bào không tách rời nhau và vẫn thành cụm, cụm tế bào chết dần khi nuôi cấy.
Do đó ở phương pháp 1 chúng tôi đã lựa chọn các chỉ số nghiên cứu như trình bày trong phần kết quả (với nồng độ enzym collagenase 2% và elastase 1%, thời gian ủ enzym lần 2 là 3 giờ).
Với các thông số nghiên cứu đã lựa chọn nhóm nghiên cứu đã tách thành công tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống và có thể nuôi cấy để sử dụng đánh giá tác dụng của thuốc, tuy nhiên nhược điểm cần khắc phục của phương pháp này là: Sau khi ủ collagenase lần 1 mới chỉ tách được các mô bám xung quanh tế bào động mạch chủ mà không tách được lớp áo ngoài của động mạch chủ vì vậy tế bào tách ra lẫn rất nhiều tạp. Mặc dù sau nuôi cấy 1 ngày chỉ những tế bào cơ trơn mới có khả năng bám dính xuống dưới bề mặt nuôi cấy, các tế bào tạp còn lại sẽ bị chết và nổi lên trong môi trường nuôi cấy và có thể loại được nhưng chính những tế bào này khi chết có thể giải phóng ra các chất ảnh hưởng đến chất lượng của các tế bào sống và tăng khả năng lây nhiễm tế bào. Đây chính là lý do chính kiến nhóm nghiên cứu phải tiếp tục tìm kiếm phương pháp tách tế bào cơ trơn trong đó phải loại được các tế bào nội mô thành mạch máu và lớp áo ngoài của thành động mạch nhằm thu các tế bào cơ trơn động mạch chủ (nằm ở lớp giữa của thành động mạch) có hình thái đúng với tự nhiên (ít bị biến đổi nhất).
44
Chúng tôi tiếp tục tiến hành tách động mạch chủ bằng phương pháp 2 trong đó thời gian ủ enzym được chia làm 2 lần. Tăng thời gian ủ collagenase lần 1 lên 1 giờ và giữa 2 lần ủ enzym động mạch chủ được « nghỉ » trong 24 giờ với mục đích để tế bào ít bị ảnh hưởng hơn bởi tác động của enzym. Kết thúc thời gian này việc loại các mảng bám xung quanh động mạch đã khá dễ dàng đồng thời chúng tôi đã bóc tách và loại bỏ được lớp vỏ ngoài thành mạch máu (các tế bào nội mô thành mạch máu bám tương đối lỏng lẻo vào thành mạch nên dễ dàng loại bỏ ngay trong giai đoạn ủ với collagenase lần 1). Như vậy sau khi ủ collagenase lần 1 và để động mạch nghỉ 24 giờ rồi bóc tách mô xung quanh và lớp tế ngoài của động mạch chúng tôi thu được chỉ lớp giữa của động mạch (lớp này gồm chủ yếu là các tế bào cơ trơn). Tiếp tục ủ với collagenase 2% lần 2 và elastase 1% trong 1 giờ chúng tôi đã thu được các tế bào đều có hình thoi sáng và đặc biệt có rất ít tế bào chết trôi nổi trong môi trường nuôi cấy sau nuôi cấy ngày 1. Vì vậy chúng tôi chọn qui trình 2 để áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.