Đánh giá tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư của các phân đoạn từ củ của loài stephania dielsiana y c wu

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ứ c CHẾ MỘT SÓ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ củ CỦA LỎÀISTEPHANIA DIELSIANA Y.C.WU ' Nguyễn Thi Minh Trang HDKH: ^ TS Nguyễn Quốc Huy, ^ TS Hoàng Thị Mỹ Nhung ‘ Lớp N1K65 - Trường Đại học Dược Hà Nội ^ Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội ^ Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội Từ khóa: Stephania dieỉsiana Y c Wu, ức chế dòng tế bào ung thư Tóm tắt Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế sáu dòng tế bào ung thư ba phân đoạn SMỈ, SM2, SM3 phân lập từ dịch chiết củ Stephania dieỉsiana Y.C.Wu, bao gồm tế bào ung thư cổ tử cung (Hela), tế bào ung thư biểu mô cuống phổi phế nang người (H358), tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR8), tế bào ung thư dày (N87), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231), tế bào ung thư gan (HepG2) dòng tể bào lành tế bào thận phôi người (HEK293) phương pháp MTS Kết thu cho thấy phân đoạn SM2 có tác dụng ức chế tốt sáu dòng tế bào ung thư ức chế yếu dòng tê bào lành (HEK293), với IC 50 lần lư 22,84; 30,09; 12,21; 10,27; 18,24; 26,18; 48,12 ụ.g/ml, phân đoạn SMl có tác dụng yếu phân đoạn SM3 tác dụng dòng tế bào ung thư Đặt vấn đề Những năm gần đây, sổ lượng bệnh nhân mắc ung thư giới Việt Nam ngày gia tăng Thực tế đòi hỏi cần phải tàng cưÒTTig nghiên cửu phương pháp thuốc hóa chất điều trị ung thư Trong trình nghiên cứu tác dụng sổ họp chất từ chi Stephania Lour, số dòng tế bào ung thư, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ Lê Mai Hương phát tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư họp chất oxostephanin phân lập từ củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu dòng tế bào ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU), ung thư màng tim (RD) [3] Nhằm tiếp tục nghiên cứu tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu lựa chọn phân đoạn dịch chiết từ củ có tác dụng ức chế tốt tế bào ung thư, tiến tới phân lập lựa chọn hoạt chất có tác dụng, thực nghiên cứu "Đánh giá tác dụng ức chế sổ dòng tế bào ung thư phân đoạn từ củ loài Stephania dieỉsiana Y.c Wu" Sau số kết thu từ nghiên cứu Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Cắn phân đoạn dịch chiết SMl, SM2, SM3 phân lập từ dịch chiết củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu (Ba Vì, Hà Nội, 4/2013) Các dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư cổ tử cung (Hela ATCC), tế bào ung thư biểu mô cuống phổi phế nang người (H358 ATCC), tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR-8 ATCC), tế bào ung thư dày (N87 ATCC), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231 ATCC), tế bào ung thư gan (HEPG2 ATCC) Dòng tế bào lành: tể bào thận phôi người (HEK293 ATCC) Chất đối chứng dưong Taxol Thiết bị hóa chất Thiết bị Máy cất quay áp suất giảm, bình gạn, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, máy Elisa, tủ ấm 5% CO2, tủ hút, buồng đếm tế bào, đĩa nuôi cấy đa giếng, ống bảo quản mẫu, ống Falcon, ống ly tâm Hóa chất Dung môi chiết: methanol, acid acetic, nước cất, dung dịch amoniac N, n-hexan, diclomethan, ethylacetat Môi ừường nuôi cấy tế bào: dòng tế bào nuôi cấy môi trường DMEM RPMI có bổ sung 10% huyết thai bò FBS 1% kháng sinh penicillin/streptomycin Các hóa chất khác: thuốc nhuộm Blue Trypan, kit xác định lượng tế bào CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Prolifération Assay, dung dịch PBS, dung dịch Trypsin - EDTA Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất phân đoạn dịch chiết từ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu Cân 500 g bột dược liệu, thấm ẩm hỗn hợp dung môi methanol:acid acetic 5% (3:2) pH 4-5, chiết với dung môi methano:acid acetic 5% (3:2) pH 4-5 phương pháp ngấm kiệt Dịch chiết cất thu hồi dung môi chiết với n-hexan, diclomethan, ethylacetat Phần dịch chiết nước lại kiếm hóa dung dịch amoniac đến pH 9-10 chiết với diclomethan, ethylacetat cất thu hồi dung môi phân đoạn n-hexan, diclomethan, ethylacetat pH 4-5 pH 9-10 60°c [1,4] Hình Sắc ký đồ phân đoạn thu chất chuẩn oxostephanin (Thứ tự vết từ trái sang phải là phân đoạn n-hexan, diclomethan, ethylacetat pH 4-5 9-10, phân đoạn nước lại, oxostephanin) Lựa chọn phân đoạn để thử tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư: phân đoạn SMl, SM2 SM3 Bảng Khối lượng cắn thu phân đoạn SMl, SM2, SM3 Khôi lượng (g) Phân đoạn 0,28 n-hexan SMl Diclomethan (pH 4-5; pH 9-10) SM2 1,64 Ehthyl acetat (pH 4-5; pH 9-10) 6,46 SM3 Nước Stephania dielsiana Y.C.Wu Nguyên tắc Tỷ lệ tế bào sống sót xác định dựa vào phương pháp MTS MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H-tetrazolium) Khi có mặt phenazinemethosulfate (PMS), MTS enzym ty thể tế bào sống chuyển hóa thành dẫn chất formazan có màu tan môi trường nuôi cấy Lượng formazan tạo tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống môi trường nuôi cấy xác định phương pháp đo quang 490 nm Quy trình thí nghiệm Các dòng tế bào hoạt hóa nhân nuôi điều kiện ứiích hợp Nạp tế tế bào vào đĩa 96 giếng, giếng chứa 5000 - 7000 tế bào 180 (J.1 môi trưòfng nuôi cấy thích họfp, ủ tủ ấm 37°c, 5% CO2 24 để tế bào ổn định bám lên mặt đĩa Tiếp tục ủ tế bào 48 với phân đoạn Taxol nồng độ theo bảng Bảng Dải nồng độ ứiử nghiệm phân đoạn chất đổi chứng Taxol (đv: |J.g/ml) Mẩu C2 C4 C1 C3 C5 C6 C7 C8 C9 Phân đoạn 10 0 500 250 Taxol 30 0.3 10 50 25 3x10' 3x10’ 10 2.5 Đo mật độ quang (OD) mẫu máy ELISA Các giá trị OD xử lý phần mềm thống kê GraphPad PrismS, thu đưòíng cong tỷ lệ tế bào sống sót phụ thuộc nồng độ số IC50 [2 , 5, ], Kết Dựa vào giá trị OD, xây dựng đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo nồng độ chất thử N87 L o g [SMO u glm l OVCAR -8 HeLa L o g (SM |, ug/m i t o g (S M Ỉ us/iT d MOA Hep62 L o g {SM], u g /m l A% H 358 L o g [SNQ, u g /m l • SM2 *> SM1 » SM3 Hình Đường cong tỷ lệ tê bào sông sót theo nông độ chât thử sáu dòng tê bào ung thư Tỷ lệ sống sót tế bào ung thư ủ với phân đoạn SM2 thấp dòng tế bào ung thư tất nồng độ dải nồng độ thử nghiệm, với phân đoạn SM l, tỷ lệ sống sót giảm khoảng nồng độ 10^ - 10^ |j.g/ml trừ dòng N87, với phân đoạn SM3 tỷ lệ sống sót giảm không đáng kể nhẹ Từ đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo nồng độ chất thử, xác định giá trị IC50 (nồng độ chất thử có khả ức chế 50% tăng trưởng tế bào) phân đoạn với dòng tể bào Bảng Giá trị IC50 phân đoạn SMl, SM2, SM3 chất đối chứng dương Taxol dòng tế bào thử (đv: Ịig/ml) Mâu thử SMl SM2 SM3 Taxol N87 OVCAR 35.730 10.270 ND 0.450 174.100 MDAMB-231 ND 18.240 ND 0.500 -8 12.210 ND 0.040 HeLa HepG2 H358 94.600 22.840 ND 87.200 26.180 ND 0.032 ND 30.090 ND 0.700 HEK 293 ND 48.120 ND 13.600 0.011 (ND: xác định, c nông độ cân xác c ịnh lớn 5000 I^g/ml) Trên sáu dòng tế bào ung thư, giá trị IC50 phân đoạn SM nhỏ nhất, giá trị IC50 phân đoạn SM3 lớn khoảng nồng độ thử nghiệm, giá trị IC50 phân đoạn SMl cao phân đoạn SM2 từ - 14 lần Đối với phân đoạn SM2, giá trị IC50 dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR-8 ), tế bào ung thư dày (N87), tế bào ung thư vú (MDA-MB231) thấp so với giá trị ừên ba dòng tế bào ung thư lại, dòng tế bào lành cao dòng tế bào ung thư Quan sát đường cong tỷ lệ tế bào sống sót theo nồng độ phân đoạn SM2 chất đối chứng dương Taxol ừ-ên bảy dòng tế bào thử nghiệm thấy tưcmg đồng hình dạng, chứng tỏ phân đoạn SM2 có tác động điển hình chất ức chế tăng trưởng tế bào ung thư A% SM2 100- A » V o * 50 T axol A% • ■ Log [SIVI], ug/m l OVCAR-8 HepG2 HeLa HEK293 N87 H358 MDA ISOn » OVAR-8 100 - -2 ■ i T V * HepG2 HeLa HEK293 MDA H358 • N 78 Log (TaxoỊ], ug/ml Hình Đường cong tỷ lệ tê bào sông sót theo nông độ ba phân đoạn đôi chứng dương Taxol ừên dòng tế bào thử Bàn iuận Trong số ba phân đoạn, phân đoạn SM2 có tác dụng ức chế tế bào ung thư mạnh dòng tế bào ung thư, tế bào lành SM2 có tác dụng ức chế mức độ thấp hon so với dòng tế bào ung thư Theo tiêu chuẩn đánh giá NCI (Viện Nghiên cứu Quốc gia Ung thư, Mỹ), chất chiết tự nhiên dạng thô có IC50 100 Ịag/ml coi có hoạt tính ức chế tế bào ung thư; 20 Ịig/ml có hoạt tính mạnh [5, ], Các giá trị IC50 SM2 nằm giới hạn có độc tính với dòng tế bào ung thư, SM2 có hoạt tính mạnh với OVCAR-8 , MDA-MB-231 N87 SM1 có tác dụng ba dòng tế bào ung thư HeLa, HepG2 N87 Kết luận Phân đoạn SM2 có tác dụng ức chế tốt tăng trưởng dòng tế bào ung thư N87, OVCAR-8 , MDA-MB-231, HeLa, HepG2, H358 với IC50 10.270; 12.210; 18.240; 22.840; 26.180; 30.090 ịig/ml Phân đoạn SMl có tác dụng ức chế ba dòng tế bào ung thư N87, HepG2, HeLa với IC50 tương ứng 35.73; 87.2; 94.6 |xg/ml Phân đoạn SM3 tác dụng dòng tế bào ung thư thử nghiệm Tài liệu tham khảo Bộ môn Dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, tập II, NXB Y học, tr 5-27 Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Minh Khởi, Hoàng Thị Mỹ Nhung, Nguyễn Thị Quỳ, Phương Thiện Thưcmg, Phí Thị Xuyến (2011), Độc tính lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu số dòng tế bào ung thư, Tạp chí Dược liệu, số 16(5), tr 303-306 Nguyễn Quốc Huy, Lê Mai Hương, Phạm Thanh Kỳ (2009), Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào họp chất phân lập từ số loài bình vôi (Stephania Lour.) Việt Nam, Tạp dược liệu, số 14(4), tr 218-220 Nguyễn Thượng Dong (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 39-44 Figg w , McLeod H L (2004), Handbook o f anticancer pharmacokinetics and pharmacodynamics, Ed XV Humana Press Inc., Teicher B A., Andrews p A (2004), Anticancer drug development guide (Second edition), Humana Press Inc  ... thư: tế bào ung thư c tử cung (Hela ATCC), tế bào ung thư biểu mô cuống phổi phế nang người (H358 ATCC), tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR-8 ATCC), tế bào ung thư d y (N87 ATCC), tế bào ung thư. .. bào ung thư, tế bào lành SM2 c t c dụng c chế m c độ thấp hon so với dòng tế bào ung thư Theo tiêu chuẩn đánh giá NCI (Viện Nghiên c u Qu c gia Ung thư, Mỹ), chất chiết tự nhiên dạng thô c IC50...Nguyên liệu phương pháp nghiên c u Nguyên liệu C n phân đoạn dịch chiết SMl, SM2, SM3 phân lập từ dịch chiết c loài Stephania dielsiana Y. C. Wu (Ba Vì, Hà Nội, 4/2013) C c dòng tế bào ung thư: tế