Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai gene mrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI GENE nrLSU (NUCLEAR RIBOSOMAL LARGE SUBUNIT) KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS LAO ĐỨC THUẬN SVTH: TRỊNH HOÀNG LUÂN MSSV: 1153010446 KHÓA: 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn khoa Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô trƣờng Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy Lao Đức Thuận cô Lê Huyền Ái Thúy – ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em suốt trình thực nghiệm hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với tất tinh thần trách nhiệm lòng yêu nghề, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập tốt, có hội củng cố phát triển học mà em trau dồi bốn năm ngồi ghế nhà trƣờng nhằm trang bị cho em kiến thức để tự tin bƣớc vào đời Trong trình làm việc, thời gian ngắn nhƣng giúp em có đƣợc học kinh nghiệm từ thực tế với giúp đỡ nhiệt tình quý thầy cô Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi sai sót, em kính mong quý thầy cô góp ý, dẫn thêm để đề tài đƣợc hoàn chỉnh Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô trƣờng Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh lời chúc sức khỏe gặt hái đƣợc nhiều thành công sống Bình Dƣơng, tháng 05 năm 2015 SINH VIÊN Trịnh Hoàng Luân Trang i DANH MỤC VIẾT TẮT ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : base-pair nu : nucleotide DNA : deoxyribonucleotide triphosphate RNA : ribonucleic acid LSU : large subunit rDNA : ribosomal DNA rRNA : ribosomal RNA Trang ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Các thông số thiết lập cho chu kỳ nhiệt phản ứng PCR để khuếch đại vùng gene nrLSU 22 Bảng 3.1 Kiểm tra cặp mồi với thông số vật lý IDT 25 Bảng 3.2 Kết đo OD mẫu DL0038A DL0038B đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp phenol/chlloroform có bổ sung β-mercaptoethanol CTAB 29 Bảng 3.3 Chiều dài trình tự hai mẫu DL0038A, DL0038B trƣớc sau hiệu chỉnh 38 Bảng 3.4 Hình ảnh cấu trúc bậc hai mẫu DL0038A, DL0038B số mẫu nấm khác 44 Bảng 3.5 Tổng hợp kết định danh hai mẫu nấm DL0038A DL0038B 47 Trang iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cordyceps sinensis, loài nấm kí sinh côn trùng Hình 1.2 Sơ đồ vị trí vùng domain thuộc trình tự nrLSU Hình 2.1 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038A 18 Hình 2.2 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038B 19 Hình 3.1 Kiểm tra mồi BLAST NCBI 26 Hình 3.2 Vị trí mồi xuôi LR05 đƣợc gióng cột với trình tự liệu 27 Hình 3.3 Vị trí mồi ngƣợc LR5 đƣợc gióng cột với trình tự liệu 27 Hình 3.4 Kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 với Cordyceps Takaomontana 28 Hình 3.5 Hình điện di cho phản ứng PCR mẫu DL0038A, DL0038B 29 Hình 3.6 Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038A 30 Hình 3.7 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A 31 Hình 3.8 Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038A 32 Hình 3.9 Kết hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A NCBI - BLAST 33 Hình 3.10 Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038B 34 Hình 3.11 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B 35 Hình 3.12 Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038B 36 Hình 3.13 Kết hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B NCBI - BLAST 37 Hình 3.14 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Likelihood với sở liệu với bootstrap 1000 lần 40 Hình 3.15 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Neighbor-Joining với sở liệu với bootstrap 1000 lần 41 Hình 3.16 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Parsimony với sở liệu với bootstrap 1000 lần 42 Trang iv MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1 Đặc điểm chung thành phần loài 1.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 1.3 Tiềm ứng dụng GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU) PHẢ HỆ PHÂN TỬ CẤU TRÚC THỨ CẤP 11 PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ 13 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẶP MỒI SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 15 DANH MỤC CÁC PHẦN MỀM SỬ DỤNG .15 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU .17 VẬT LIỆU 18 4.1 Dụng cụ thiết bị 19 4.2 Hóa chất 20 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BỘ GENE .21 PHẢN ỨNG PCR 22 6.1 Thành phần phản ứng PCR 22 6.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .22 6.3 Điện di 22 6.4 Giải trình tự 23 Trang v HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ .23 XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI BẰNG PHẦN MỀM MEGA 6.0 23 DỰ ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BẬC HAI 24 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN PHÂN TÍCH MỒI 15 KẾT QUẢ ĐO OD Ở BƢỚC SÓNG 260nm VÀ 280nm .29 PCR VÀ ĐIỆN DI GENE nrLSU: 29 HIỆU CHỈNH 30 4.1 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A 30 4.2 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B 34 CÂY PHÁT SINH LOÀI .39 CẤU TRÚC BẬC 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Trang vi ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc định danh dựa công cụ sinh học phân tử công cụ đắc lực việc hỗ trợ định danh hình thái Thông qua việc xây dựng phả hệ phân tử, nhà nghiên cứu dựa vào tiêu nhƣ địa hình học (Topology), giá trị bootstrap, phân nhóm để lý giải mối tƣơng quan đối tƣợng cây, kết hợp với kiện hình thái, giải phẫu học nhằm định danh xác đối tƣợng quan tâm Theo Vilgalys cs, gene nrLSU vùng gene mục tiêu đƣợc ứng dụng việc phân tích xây dựng phả hệ để hỗ trợ công tác định danh Trình tự nrLSU vùng gene mã hóa RNA 25S-28S ribosome (tiểu phần lớn ribosome) Vùng gene chứa nhiều thông tin di truyền có tính bảo tồn cao, đƣợc biết rộng rãi giới có khả thiết kế đƣợc cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại giải trình tự nhiều loài nấm Cặp mồi LR0R/LR5 cặp mồi phổ quát đƣợc sử dụng nhiều nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm năm gần Cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 cho kết khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg cs, 2007) Vùng D1, D2 domain khác nằm vùng gene nrLSU có khả giải việc định danh loài có mối liên quan gần gũi với domain chứa nhiều thông tin di truyền, có tính biến động Và khuôn khổ đề tài, tập trung vào việc định danh hai mẫu nấm ký sinh côn trùng (DL0038A, DL0038B) dựa phân tích phát sinh chủng loài cấu trúc bậc hai gene nrLSU (sử dụng phần mềm dự đoán cấu trúc Mfold) (Zuker, 2003) với thông số thiết yếu nhƣ nồng độ Na+= 0,05M; Mg2+ = 0,00M, nhiệt độ mặc định cho trình tính toán lƣợng tiêu hao trình gấp cuộn (tạo cấu trúc bậc 2) 25oC Trang PHẦN 1: TỔNG QUAN CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1 Đặc điểm chung thành phần loài Cordyceps chi nấm ký sinh côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora & Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, ngành nấm túi Ascomycota Điểm bật nấm ký sinh côn trùng giá trị y dƣợc tiềm quý Điển hình Cordyceps sinensis, loại nấm dƣợc liệu quý hiếm, đƣợc ứng dụng nhiều tảng y học Trung Quốc nhiều kỷ Ở quốc gia khác Cordyceps sinensis có nhiều tên gọi khác chẳng hạn nhƣ DongChongXiaCao (Trung Quốc), Tockukaso (Nhật Bản) có nghĩa Đông trùng hạ thảo (Choi, 1999) Trong tự nhiên, Cordyceps phân bố chủ yếu vùng núi có độ cao từ 3.500 đến 5.000m so với mặt nƣớc biển, chẳng hạn nhƣ cao nguyên Himalaya, Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam… Do Cordyceps luôn dƣợc liệu quý có giá trị dƣợc lý cao kho tàng dƣợc liệu dân gian (Nguyễn Lân Dũng, 2005) Cordyceps nội ký sinh ấu trùng cá thể trƣởng thành nhiều loài côn trùng khác Quả thể nấm có dạng hình trụ, phân nhánh hay có hình dạng phức tạp Sau xâm nhập vào thể côn trùng, bào tử nấm nảy mầm phát triển thành hệ sợi nấm Hệ sợi nấm xâm chiếm thay mô vật chủ hình thành thể gặp điều kiện thích hợp Do vậy, thể Cordyceps thƣờng đƣợc tìm thấy xác nhộng ấu trùng côn trùng sau thời gian nhiễm nấm [18] Về thành phần loài, 400 loài Cordyceps (Sung cs, 2007) đƣợc mô tả Phần lớn công bố đến từ quốc gia thuộc vùng châu Á, bật nƣớc Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Trang Dựa vào kết xây dựng phả hệ phân tử ML, NJ, MP, nhìn chung, địa hình học (Topology) ba phả hệ giống Hai mẫu nấm DL0038A, DL0038B phân nhóm với loài Cordyceps Takaomontana (AB044637) với giá trị bootstrap 100%, 100%, 100% (ứng với lần lƣợt ML, NJ, MP) Ngoài ra, nhóm DL0038A, DL0038B Takaomontana phân nhóm với Lecanicillium fusisporum Lecanicillium tenuipes với giá trị bootstrap 78%, 79%, 77% (ứng với lần lƣợt ML, NJ, MP) Điều có nghĩa trình tự DL0038A, DL0038B có tính tƣơng đồng với loài Do đó, để xác định xác, tiến hành so sánh cấu trúc bậc gene nrLSU DL0038A, DL0038B với trình tự thuộc nhóm CẤU TRÚC BẬC Kết dự đoán xây dựng cấu trúc bậc hai mạch sense antisense DL0038A, DL0038B mẫu liên quan đƣợc thể bảng 3.3 Nhìn chung, cấu trúc bậc hai mạch sense antisense DL0038A, DL0038B có cấu trúc tƣơng tự với mạch sense, antisense mẫu Cordyceps takaomontana (AB044637) khác so với trình tự mẫu Lecanicillium fusisporum (AF339549) Lecanicillium tenuipes (AF339526) Cụ thể, mức lƣợng hình thành cấu trúc bậc hai mạch sense, antisense mẫu DL0038A -108,71 Kcal/mol, -105,74 Kcal/mol mẫu DL0038B -109,41 Kcal/mol, -105,35 Kcal/mol có giá trị xấp xỉ gần với mẫu Cordyceps takaomontana -108,79 Kcal/mol, -105,85 Kcal mol Trong đó, mức lƣợng hình thành cấu trúc bậc hai loài Lecanicillium fusisporum -103,11 Kcal/mol, -104,67 Kcal/mol Lecanicillium tenuipes -103,07 Kcal/mol, -101,73 Kcal/mol có giá trị chênh lệch nhiều Về hình dạng cấu trúc bậc hai, mạch sense mẫu DL0038A DL0038B có hình thành ba cuống lớn (ký hiệu dấu mũi tên) với chùy nhỏ (ký hiệu dấu tam giác) Tại cuống này, đoạn “bắt cặp” xen kẽ với đoạn “không bắt cặp” để hình thành hình dạng đặc trƣng cuống Ngoài Trang 43 cuống lớn (ký hiệu số 1) lại hình thành cấu trúc phân ba nhánh chứa đoạn bắt cặp không bắt cặp xen kẽ lẫn Hình dạng đặc trƣng hoàn toàn giống mẫu DL0038A, DL0038B với mẫu Cordyceps Takaomontana, khác với mẫu Lecanicillium fusisporum Lecanicillium tenuipes hình thành phân nhánh hai Đối với mạch antisense mẫu DL0038A DL0038B có hình thành hai cuống lớn (ký hiệu dấu mũi tên) với chùy nhỏ (ký hiệu dấu tam giác) Tại cuống này, đoạn “bắt cặp” xen kẽ với đoạn “không bắt cặp” để hình thành hình dạng đặc trƣng cuống Ngoài cuống lớn (ký hiệu số 1) lại hình thành cấu trúc phân hai nhánh chứa đoạn bắt cặp không bắt cặp xen kẽ lẫn Hình dạng đặc trƣng hoàn toàn giống mẫu DL0038A, DL0038B với mẫu Cordyceps Takaomontana, khác với mẫu Lecanicillium fusisporum Lecanicillium tenuipes Bảng 3.4 Hình ảnh cấu trúc bậc hai mẫu DL0038A, DL0038B s mẫu nấm khác Loài – Mẫu Mạch sense Mạch antisense ∆G= -103,07 Kcal/mol ∆G= -101,73 Kcal/mol Lecanicillium tenuipes Trang 44 Lecanicillium fusisporum ∆G= -103,11 Kcal/mol ∆G= -104,67 Kcal/mol Cordyceps takaomontana ∆G= -108,79 Kcal/mol ∆G= -105,85 Kcal/mol Trang 45 1 DL0038A ∆G= -108,71 Kcal/mol ∆G= -105,74 Kcal/mol 1 DL0038B ∆G= -109,41 Kcal/mol ∆G= -105,35 Kcal/mol Nhƣ vậy, dựa việc dự đoán cấu trúc bậc hai kết hợp với định danh hình thái, kết luận hai mẫu DL0038A DL0038B Cordyceps takaomontana Trang 46 Bảng 3.5 Tổng hợp kết định danh hai mẫu nấm DL0038A DL0038B Mẫu DL0038A Mẫu DL0038B Loài định danh hình thái Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Loài tƣơng đồng GenBank Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Cây tiến hóa ML Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Cây tiến hóa NL Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Cây tiến hóa MP Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Cấu trúc bậc hai Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana Nhƣ vậy, dựa việc định danh mẫu nấm phƣơng pháp Tin-Sinh kết hợp với định danh hình thái, kết luận hai mẫu DL0038A DL0038B Cordyceps takaomontana Trang 47 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận + Về lý thuyết Chúng xây dựng thành công phƣơng pháp luận việc định danh mẫu nấm ký sinh côn trùng (cụ thể DL0038A, DL0038B) dựa phân tích phát sinh chủng loài cấu trúc bậc hai gen nrLSU gồm bƣớc nhƣ: Khảo sát in sillico để đánh giá hệ mồi gene nrLSU Thu thập xây dựng sở liệu cục vùng gen mục tiêu nrLSU Xây dựng quy trình thực nghiệm nhằm tối ƣu vùng gen mục tiêu Giải trình tự hiệu chỉnh trình tự để xuất trình tự xác Xây dựng phát sinh chủng loài MP, NJ, ML phƣơng pháp dò tìm mô hình tiến hóa để xuất xác Phân tích cấu trúc bậc hai chƣơng trình trực tuyến Mfold đƣa kết định danh + Về thực nghiệm Xây dựng thành công quy trình tối ƣu PCR để khuyếch đại gen nrLSU Giai đoạn Kéo dài cuối Biến tính Biến tính Mồi bắt cặp Kéo dài 95 95 53.5 72 72 Thời gian phút 30 giây 30 giây phút phút Chu kỳ Nhiệt độ (oC) 35 Dựa vào phƣơng pháp định danh hình thái kết hợp với phần mềm Tin – Sinh học định danh đƣợc hai mẫu nấm DL0038A DLO0038B loài Cordyceps Takaomontana Trang 48 Đề nghị Kết hợp hai loại liệu phân tử hình thái giúp định danh thành công hai mẫu DL0038A DL0038B Những thông tin quy trình định danh hữu ích cho nhóm nghiên cứu tiếp tục công tác định danh mẫu nấm lại liệu mẫu có Trang 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1999), “Sinh học phân tử”, Nhà xuất ản Giáo dục [2] Lao Đức Thuận, Đinh Minh Hiệp, Trƣơng Bình Nguyên, Phạm Nguyễn Đức Hoàng, Lê Huyền Ái Thúy (2014), “Hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng phân tích phân tử vùng gen ITS1 -5.8S- ITS2”, (Đang chờ xuất bản) [3] Lê Trần Bình, Quyền Đình Thi (2009), “Cơ sở công nghệ sinh học tập – Công nghệ gen”, Nhà xuất ản Giáo dục Việt Nam Tài liệu nƣớc [4] Alberts et al (1994), “The Molecular Biology of the Cell”, New York: Garland Science [5] Bok J W., Lermer L., Chilton J., Klinggeman H.G., Tower G.H (1999), “Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis” Phytochemistry 51(7):891-898 [6] Bryn T.M Dentinger; David J McLaughlin (2006), “Reconstructing the Clavariaceae using nuclear large subunit rDNA sequences and a new genus segregated from the Clavaria”,Mycologia 98 (5); 746- 762 [7] Chou., ZG., (1994), “Cordyceps sinensis effect on activity of NK and LAK cells in leucocythemia patients”, Shanghai J immunol, 14-30 [8] Cleaver, John Holliday & Matt (2008), “Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes)”, A Review “International Journal of Medicinal Mushrooms” 10, 219-234 [9] Dirks, Robert M.; Lin, Milo; Winfree, Erik & Pierce, Niles A (2004), "Paradigms for computational nucleic acid design", Nucleic Acids Research, 32 (4): 1392–1403 Trang 50 [10] Dowell K (2008), “Molecular Phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationship”, Math 500, pp 116 [11] Evans H C (2003), “Use of clavicipitalean fungi for the biological control of arthropod pests”, New York: 517–548 [12] Fell J W., Boekhout T., Fonseca A., Scorzetti G., Statzell-Tallman A (2000), “Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1 D2 domain sequence analysis”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 1351-1371 [13] Felsenstein J (1985), “Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap”, Evolution, 39(4), pp 783-791 [14] Gi-Ho Sung, Nigel L Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J.Jennifer Luangsa-ard, Bhushan Shrestha, Joseph W Spatafora, (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous”, Studies in Mycology, 57, 5-59 [15] Gue-ho E., Improvisi L., Christen R., Hoog G S (1993), “Phylogenetic relationships of Cryptococcus neoformans and some related basidiomycetous yeasts determined from partial large subunit rRNA sequences”, Antonie van Leeuwenhoek 63: 175-189 [16] Hall B.G (2001), “Phylogenetic Trees Made Easy: A How-to Manual for Molecular Biologists”, Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates [17] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), “Toiypocladium injatum is the anamorph of Cordyceps subsessilis”, Mycologia, 88(5), pp 715-719 [18] Holliday J., Cleaver M (2008), “Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 10(3), pp 219-234 [19] Hui-Chen Lo, Chienyan Hsieh, Fang-Yi Lin, Tai-Hao Hsu, (2013), “A Systematic Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-Chong XiaCao and related bioactive ingredients”, J Tradit Complement Med, 3(1): 16-32 Trang 51 [20] Innis M A., Gelfand D H., (1990), “Optimization of PCRs”, Academic Press, pp.3-12 [21] Itoh H., Shioda T., Matsura T., Koyama S., Nakanishi T., Kajiyama G., Kawasaki T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys., 313 (1), pp 120-125 [22] Jack A.Tuszynski et al 2006, “The evolution of the structure of tubulin and its potential consequences for the role and function of microtubules in cells and embryos”, Int.J.Dev.Biol 50:341-358 [23] Jean-Marc Moncalvo, M Lutzoni, Francois, A Rehner, Stephen, Johnson, Jacqui, Vilgalys, Rytas, (2000), “Phylogenetic relationships of agatic fungi based on nuclear large subunit ribosomal DNA sequences”, Syst Biol, 49 (2): 278-305 [24] Ji Seon Lee, Mi Ok Lim, Kyoung Yeh Cho, Jung Hee Cho, Seung Yeup Chang, Doo Hyun Nam (2006), “Indentification of medicinal Mushroom Species Based on Nuclear”, The Journal of Microbiology, 44 (1): 29-34 [25] John C Holliday, Phillip Cleacer, Megan Loomis – Powers Dinesh Patel, (2004), “Analysis of quality and techniques for hybridization of medical fungus Cordyceps siensis (Berk.)Sacc (Ascomycetes)”, International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol 6, 151-164 [26] Josep Guarro, Josepa Gené, and Alberto M Stchigel (1999), “Developments in Fungal Taxonomy”, Clinical Microbiology Reviews, pp 454-500 [27] Juuti, J.T., S Jokela, M.T Tarkka, L Paulin and J Lahdensalo, 2005 “Two phylogenetically highly distinct beta-tubulin genes of the basidiomycete Suillus bovinus”, Curr Genet., 47: 253-263 [28] Kiho T., Kobayashi T., Morimoto H (2000), “Structural features of an antidiabetic polysaccharide (TAP) from Tremella aurantia”, Chem Pharm Bull (Tokyo) 48: 1793-1795 Trang 52 [29] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23: 329-364 [30] Kretzer A M., Bruns T D (1999), “Use of atp6 in Fungal Phylogenetics: An Example from the Boletales”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 13(3), pp 483-492 [31] Kuo Y.C., Tsai W.J., Shiao M S., Chen C.F., Lin C.Y., (1996), “Cordyceps sinensis as a immunomodulatory agnet”, Am J Chin Med, 24(2):111 – 125 [32] Kurtzman C.P., Robnett C J (1998), “Identification and phylogeny of ascomycetous yests from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences”, Antonie Van Keeuwenhoek 73: 331-371 [33] Lemey P., Salemi M., Vandamme A M (2009), “The Phylogenetic Handbook: A practical approach to phylogenetic analysis and hypothesis testing”, Cambridge University press [34] Li S P, Tsim K W (2004), “The biological and pharmacological properties of Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine that has broad clinical applications”, Herbal and Traditional Medicine (New York), pp 657-682 [35] Liang Z-Q (1991), “Determination and identification of anamorph of Cordyceps pruinosa”, Acta Mycologica Sinica 10: 72–80 [36] Liu Y J., Whelen S., Hall B D (1999), “Phylogenetic Relationships Among Ascomycetes: Evidence from an RNA Polymerse II Subunit”, Molecular Biology and Evolution, 16(2), pp 1799-1808 [37] Lutzoni F., Kauff F., Cox C J., McLaughlin D., Celio G, Dentinger B, Padamsee M, Hibbett DS, James TY, Baloch E, Grube M, Reeb V, Hofstetter V, Schoch C, Arnold AE, Miadlikowska J, Spatafora J, Johnson D, Hambleton S, Crockett M, Schoemaker R, Sun GH, Lücking R, Lumbsch HT, O’Donnell K, Binder M, Diederich P, Ertz D, Gueidan C, Hall B, Hansen K, Harris RC, Hosaka K, Lim YW, Liu Y, Matheny B, Nishida H, Pfister D, Rogers J, Rossman A, Schmitt I, Sipman H, Stone J, Sugiyama J, Yahr R, Vilgalys R (2004), “Assembling the fungal tree of life: progress, Trang 53 classification, and evolution of subcellular traits”, American Journal of Botany, 91(10), pp 1446-1480 [38] Manabe N., Sugimoto M., Azuma Y., Taketomo N., Yamashita A., Tshuboi H., Tsunoo A., Kinjo N., Nian – Lai H., Miyamoto H, (1996), “Effectof the mycelial extract of cultured Cordyceps sinensis on in vivo hepatic energy metabolism in the mouse”, Jpn J Pharmacol 70(1): 85-88 [39] Mathews DH, Disney MD, Childs JL, Schroeder SJ, Zuker M, and Turner DH (May 2004), "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure", 101 (19): 7287–92 [40] McCoy C W (1990), “Entomogenous fungi as microbial pesticides”, pp 139-159 In R R Baker, and P E Dunn (eds.), New Directions in Biological Control Alan R Liss, New York [41] Md Asaduzzaman Khan, Mousumi Tania, Dian-zheng Zhang, Han-chun Chen, (2010), “Cordyceps Mushroo: A Potent Anticancer Nutraceutical” The Open Nutraceuticals Journal, 3, 179-183 [42] Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Kwon Y M., Shinozuka K., Kunitomo M (1999), “Inhibitory effect of Cordyceps sinensis on spontaneous liver metastasis of Lewis lung carcinoma and B16 melanoma cells in syngeneic mice”, Japanese Journal of Pharmacology, 79(3): 335341 [43] Ng T B, Wang H X (2005), “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, J Pharm Pharmacol, 57: 1509-1519 [44] O’Donnell K., Cigelnik E., Nirenberg H I (1998), “Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex”, Mycologia, 90(3), pp 465-493 [45] Peter Yakovchuk, “Ekaterina Protozanova and Maxim D FrankKamenetskii”, Base-stacking and base-pairing contributions into thermal Trang 54 sta ility of the DNA dou le helix”, Nucleic Acids Research 2006 34(2):564574 [46] Pokalsky A R., Hiatt W R., Ridge N., Houck C M and Shewmaker C K (1989), “Structure and expression of elongation factor alpha in tomato”, Nucleic Acids Res, 17(12), pp 4661-4673 [47] Rainer Sonnenberg, Arne W Nolte, Diethard Tautz, (2007), “An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences of their use in species identification” Frontier in Zoology, 4, 4-6 [48] Reeb V., Lutzoni F., (2004), “Contribution ofRPB2 to multilocus phylogenetic studies of the euascomycetes (Pezizomycotina, Fungi) with special emphasis on the lichen-forming Acarosporaceae and evolution of polyspory”, Molecular Phylogenetics and Evolution 32: 1036-1060 [49] Sangdee A & Sangdee K (2013), “Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand”, African Journal of Microbiology Research, 7(2), pp 137-146 [50] Schabereiter-Gurtner C., Piñar G., Lubitz W and Rölleke S (2001), “Analysis of fungal communities on historical church window glass by denaturing gradient gel electro- phoresis and phylogenetic 18S rDNA sequence analysis”, J Microbiol Methods 47: 345-354 [51] Shim J.S., Min E.G., Chang H.R., Lee C.Y., Kim S.S., Han Y.H (2000), “Cytoctxicity against human cancer cell lines by Paecilomyces tenuipes DGUM 32001”, Korean J Microbiol 36: 312-315 [52] Smit E., Leeflang P., Glandorf B., van Elsas, J.D., and Wernars, K (1999), “Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electro- phoresis”, Appl Environ Microbiol, 65: 2614-2621 [53] Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S (2013), “MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0”, Molecular Biology and Evolution30: 2725-2729 Trang 55 [54] Teresita M Porter, G Brian Golding, (2012), “Factors that effect large subunit ribosomal DNA amplicon sequencing studies of fungal communities: Classification method, primer choice and error”, (4): 1-12 [55] Waddington M., (2009), “Identification of fungi using ribosomal internal transcribed spacer (ITS) DNA sequences”, Pharmaceutical Technology [56] Wang S.Y., Shiao M.S., (2000), “Pharmacological functions of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4): 248-257 [57] Xia T, SantaLucia J Jr, Burkard ME, Kierzek R, Schroeder SJ, Jiao X, Cox C, Turner DH (October 1998), "Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs", Biochemistry 20 (37) [58] Zuker M (1989), “On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule”, Science, 244 (1989) 48-52 Website [59] http://sites.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm [60] http://vi.wikipedia.org/wiki/Ribosome [61] http://www.bioinformatics.org/sms/iupac.html [62] http://www.biology-online.org/dictionary/Housekeeping_genes Trang 56 ... cy ghộp vt liu hay c quan Trang GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU) Trong nghiờn cu nh danh v sinh hc phõn t, nhúm nm ký sinh cụn trựng hay nhiu loi sinh vt khỏc thỡ vic la chn trỡnh... oỏn chc nng gene, cỏc nghiờn cu nhõn dũng phõn t hay cỏc mi liờn h tin húa, a dng sinh hc cho cụng ngh sinh hc phõn t v cụng ngh sinh hc núi chung Vo nm 1990, d ỏn B gene ngi c trin khai v hon... khuụn kh ti, chỳng tụi trung vo vic nh danh hai mu nm ký sinh cụn trựng (DL0038A, DL0038B) da trờn phõn tớch phỏt sinh chng loi v cu trỳc bc hai gene nrLSU (s dng phn mm d oỏn cu trỳc Mfold) (Zuker,