Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng bằng phân tích phát sinh chủng loài dựa trên vùng gen nrLSU và rpb1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG BẰNG PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI DỰA TRÊN VÙNG GEN nrLSU VÀ Rpb1 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: ThS Lao Đức Thuận CN Vũ Tiến Luyện SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo MSSV: 1153010761 Khóa: 2011 - 2015 Bình Dương, tháng 05 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, cố gắng thân có hướng dẫn thầy cô, anh chị giúp đỡ bạn bè Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Công nghệ Sinh Học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho em kiến thức tảng nhất, em xin cảm ơn thầy Lao Đức Thuận, người trực tiếp hướng dẫn em suốt trình thực hoàn thành chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh định hướng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn thành đề tài Bên cạnh đó, em xin cảm ơn anh Vũ Tiến Luyện nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm giúp em thực tốt đề tài Con cảm ơn mẹ gia đình bên con, tạo điều kiện tốt để hoàn thành việc học Em xin chân thành cảm ơn anh, chị bạn phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh quan tâm, giúp đỡ em trình làm đề tài Một lần nữa, em xin gửi đến tất thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn kính chúc sức khỏe, may mắn, gặt hái nhiều thành công tương lai Bình Dương, Ngày 05 tháng 05 năm 2015 SINH VIÊN Nguyễn Thị Thu Thảo Danh mục hình Hình 1.1 Ophiocordyceps sinensis Hình 1.2 Cấu trúc rDNA vùng gen nrLSU với cặp mồi LR0R/LR5 Hình 1.3 Cấu trúc vùng gen Rpb1 Hình 2.1 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038A Hình 2.2 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038B Hình 2.3 Hình thái giải phẫu nấm DL0069 Hình 2.4 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0075 Hình 3.1 Kết kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 BLAST (NCBI) Hình 3.2 Kết kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr BLAST (NCBI) Hình 3.3 Mồi xuôi LR0R gióng cột với trình tự nrLSU loài chi Cordyceps Hình 3.4 Mồi ngược LR5 gióng cột với trình tự nrLSU loài chi Cordyceps Hình 3.5 Mồi xuôi CRPB1 gióng cột với trình tự Rpb1 loài chi Cordyceps Hình 3.6 Mồi xuôi RPB1Cr gióng cột với trình tự Rpb1 loài chi Cordyceps Hình 3.7 Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp kích thước sản phẩm với Ophiocordyceps coccidiicola Hình 3.8 Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp kích thước sản phẩm với Cordyceps militaris Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR gen nrLSU Rpb1 tách chiết theo phương pháp phenol:chloroform Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR gen nrLSU Rpb1 tách chiết theo phương pháp phenol:chloroform bổ sung β-mercaptoethanol Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR gen nrLSU Rpb1 tách chiết theo phương pháp phenol:chloroform bổ sung β-mercaptoethanol CTAB Hình 3.12 Mô tả sai khác nu hai mạch xuôi ngược gen nrLSU đầu 3‟ Hình 3.13 Hiệu chỉnh vùng tín hiệu bị nhiễu mạch nrLSU Hình 3.14 Thể mức độ tương đồng trình tự hai mạch Hình 3.15 Vị trí sai lệch hai kết giải trình tự đầu mạch xuôi nrLSU Hình 3.16 Mô tả sai khác nu hai mạch xuôi ngược gen nrLSU đầu 5‟ Hình 3.17 Hình kết BLAST trình tự nrLSU mạch xuôi hiệu chỉnh Hình 3.18 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen nrLSU phương pháp Maximum Likelihood Hình 3.19 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen Rpb1 phương pháp Maximum Likelihood Hình 3.20 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen nrLSU kết hợp với Rpb1 phương pháp Maximum Likelihood Danh mục bảng Bảng 2.1 Trình tự mồi đánh giá đề tài Bảng 2.2 Các thông số thiết lập cho chu kì nhiệt phản ứng PCR khuếch đại vùng gen nrLSU Rpb1 Bảng 3.1 Thông tin trình tự thông số vật lí cặp mồi sử dụng để khuếch đại vùng gen nrLSU Rpb1 Bảng 3.2 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform Bảng 3.3 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform có bổ sung βmercaptoethanol Bảng 3.4 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform có bổ sung βmercaptoethanol CTAB Bảng 3.5 Hiệu chỉnh nu vị trí (1) đến (8) Bảng 3.6 Tổng hợp kết hiệu chỉnh trình tự mẫu nấm ký sinh côn trùng Bảng 3.7 Kết chiều dài trình tự trước sau hiệu chỉnh Bảng 3.8 Thông tin trình tự sử dụng để xây dựng sở liệu vùng gen nrLSU, Rpb1 sau tinh chế Bảng 3.9 Tổng hợp kết dò tìm mô hình tiến hóa chức Find Best DNA/Protein Models (ML) phần mềm MEGA 6.06 dựa CSDL gen nrLSU , Rpb1 nrLSU_Rpb1 Bảng 3.10 Tổng hợp kết định danh mẫu nấm từ liệu phân tử hình thái Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan loài nấm ký sinh công trùng 1.1.1 Đặc điểm chung thành phần loài 1.1.2 Tiềm ứng dụng 1.2 Nghiên cứu hỗ trợ định danh phát sinh loài 1.2.1 Đặc điểm nhận dạng định danh .6 1.2.2 Trình tự nrLSU Rpb1 định danh phân tử nấm .8 1.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc 11 1.4 Kỹ thuật PCR giải trình tự .13 1.4.1 Kỹ thuật PCR 13 1.4.2 Kỹ thuật giải trình tự 14 1.5 Nghiên cứu phát sinh loài .14 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng 21 2.2 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 23 2.2.1 Dụng cụ 23 2.2.2 Thiết bị .23 2.2.3 Hóa chất 24 2.3 Danh mục phần mềm sử dụng .24 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .25 2.4.1 Khảo sát In silico 25 2.4.2 Thực nghiệm 26 2.4.3 Phân tích phát sinh loài 30 PHẦN 3.1 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Kết đánh giá mồi 31 3.1.1 Kết đánh giá mồi IDT .31 3.1.2 Kiểm tra mồi BLAST NCBI 33 3.1.3 Kiểm tra mồi gióng cột với Clustal 35 3.1.4 Kết kiểm tra Annhyb 36 3.2 Kết thực nghiệm 38 3.3 Kết hiệu chỉnh trình tự 42 3.5 Xây dựng sở liệu 47 3.6 Kết dựng phát sinh loài 50 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 60 4.2 Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT Rpb1: RNA polymerase binding nrLSU: nuclear ribosomal large subunit DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid rDNA: ribosomal deoxyribonucleic acid rRNA: ribosomal ribonucleic acid PCR: Polymerase Chain Reaction BLAST: Basic Local Alignment Search Tool NCBI: National Center for Biotechnology Information IDT: Integrated DNA Technologies MP: Maximum Marsimony ML: Maximum Likelihood NJ: Neighbor-Joining bp: base-pair nu: nucleotide Khóa luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Cordyceps chi nấm ký sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, với 400 loài mô tả Trong đó, Cordyceps sinensis (Đông Trùng Hạ Thảo) loài biết đến nhiều dược liệu sử dụng từ lâu y học cổ truyền nhiều nước châu Á Những nghiên cứu, đánh giá Cordyceps thành phần hóa học chúng cho thấy nhiều ứng dụng điều trị tiềm năng, điển hình như: khả ức chế tế bào khối u, điều hòa hệ thống miễn dịch, có tác dụng chống viêm tác dụng tích cực bệnh tim mạch, tiểu đường, cải thiện chức gan, thận, Định danh loài nấm ký sinh côn trùng vấn đề cấp thiết gặp nhiều khó khăn hạn chế công tác định danh dựa hình thái chúng phân biệt với dựa theo màu sắc hình dạng thể, bào tử hay ký chủ, Bên cạnh đó, khả biến đổi cao theo điều kiện môi trường, vùng địa lý, thành phần loài phong phú biến đổi thể vô tính (anamorph) thể hữu tính (teleomorph) nguyên nhân dẫn đến nhiều mâu thuẫn thành phần loài chi nấm Để giải vấn đề trên, kỹ thuật phân tử áp dụng để hỗ trợ công tác phân loại loài nấm Vùng gene mã hoá cho RNA ribosome (DNA ribosome, rDNA) sử dụng phổ biến để nghiên cứu nhiều năm gần rDNA nhóm gene có nhiều sao, không mã hóa cho protein vùng gen bảo tồn nên xem sở xác để tìm tương đồng hay khác biệt sinh vật loài hay khác loài Tuy nhiên, phát sinh loài xây dựng dựa liệu vùng gen mã hóa rRNA ribosome chưa giải mối quan hệ cấp độ chi loài House-keeping genes gen biểu thường xuyên mức tương đối ổn định điều kiện nào, chúng mã hóa cho protein giữ vai trò quan trọng liên quan đến chức cần thiết cho trình nuôi dưỡng trì tế bào Nhờ vậy, định danh phân tử nấm housekeeeping genes sử dụng nhiều chúng vùng trình tự bảo tồn cao giúp ích cho việc so sánh phân tích mối quan hệ loài Hiện nay, hướng nghiên cứu kết hợp nhiều gen SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp gồm gen mã hóa rRNA ribosome gen mã hóa protein phổ biến đem lại nhiều kết giúp định danh tốt Đông Trùng Hạ Thảo sử dụng từ lâu, nhiên, khan giá cao, nhiều sản phẩm không rõ nguồn gốc bày bán thị trường dẫn đến cần thiết phải kiểm soát thẩm định chất lượng Do đó, việc hiểu biết đầy đủ thành phần loài tạo diều kiện cho việc khai thác, nuôi trồng nội địa nguồn dược liệu quý này, đồng thời, góp phần làm giảm giá thành kiểm soát chất lượng sản phẩm Hơn nữa, việc có thông tin khoa học đầy đủ xác sở cho nghiên cứu ứng dụng sau Việt Nam Trong giới hạn đề tài, tiếp cận vùng gen nrLSU kết hợp Rpb1 xây dựng sơ liệu cục vùng gen này, tiến hành thực nghiệm xây dựng quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm, quy trình PCR để khuếch đại vùng gen mục tiêu nrLSU, Rpb1, giải trình tự, xây dựng so sánh phả hệ phân tử từ sở liệu thu thập Quy trình nhằm hỗ trợ định danh xác loài nấm ký sinh côn trùng, góp phần xây dựng quy trình định danh nấm tin cậy, làm sở cho nghiên cứu ứng dụng Việt Nam SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.19 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen Rpb1 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 54 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.20 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen nrLSU kết hợp với Rpb1 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 55 Khóa luận tốt nghiệp Mẫu DL0038A, DL0038B phân nhóm với đại diện tham chiếu Cordyceps takaomontana thuộc ngân hàng giống CBS 116.25 với mã số truy cập AB044637 (Sung et al., 2007) dựng phát sinh loài với vùng gen nrLSU với giá trị bootstrap ba NJ/MP/ML 67/62/66% Tuy nhiên, tiến hành xây dựng phát sinh loài với vùng gen Rpb1 kết hợp hai gen, Cordyceps talkaomontana không sử dụng làm đại diện tham chiếu cho hai mẫu trình tự Rpb1 Cordyceps talkaomontana chưa có ngân hàng liệu NCBI Trong báo Sung et al (2007) có đề cập đến thể vô tính (anamorph) Cordyceps takaomontana Isaria tenuipes, trình tự gen Rpb1 Isaria tenuipes sử dụng làm tham chiếu cho hai mẫu DL0038A, DL0038B Kết dựng phát sinh loài cho thấy hai mẫu DL0038A DL0038B cho kết phân nhóm với trình tự tham chiếu Isaria tenuipes (mã số truy cập KC610757 - nrLSU, KC242730 - Rpb1) Giá trị bootstrap hỗ trợ cho phân nhóm dựng đáng tin cậy, cụ thể NJ/ML/MP=98/97/98% với CSDL gen nrLSU, với CSDL gen Rpb1 NJ/MP/ML=95/88/94%, đặc biệt kết hợp hai gen có bootstrap 100% ba phương pháp dựng Dựa vào kết kết luận hai mẫu DL0038A DL0038B Cordyceps takaomontana Isaria tenuipes Khi tiến hành dựng phát sinh loài đơn gen kết hợp hai gen mẫu DL0069 phân vào Simplicilium clade gồm Simplicillium lamellicola (AF339552 nrLSU, DQ522404 - Rpb1) Simplicillium lanosoniveum (nrLSU - AF339553, AF339554, Rpb1 - DQ522405, DQ522406) Giá trị bootstrap ủng hộ cho phân nhóm 90% CSDL gen nrLSU (NJ/MP/ML=98/91/97%) Sự phân nhóm DL0069 CSDL gen Rpb1 có giá trị bootstrap không cao dựng với CSDL nrLSU với giá trị bootstrap ba phương pháp dựng lớn 50% (NJ/MP/ML=57/55/58%) phân nhóm xem đáng tin cậy Hơn nữa, phân nhóm DL0069 ủng hộ với giá trị bootstrap cao (NJ/MP/ML=98/95/97%) dựng dựa CSDL kết hợp hai gen nrLSU - Rpb1 Kết định danh hình thái so sánh với liệu GenBank phù hợp với kết phân tích phát sinh loài Dựa kết có được, SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 56 Khóa luận tốt nghiệp kết luận mẫu DL0069 Simplicillium sp Simplicillium lamellicola Simplicillium lanosoniveum Mẫu DL0075 cho kết phân nhóm ba NJ, MP, ML tiến hành xây dựng đơn gen đa gen Mẫu phân nhóm trình tự tham chiếu Cordyceps staphylinidicola (thuộc ngân hàng giống ARSEF 5717, mã số truy cập EF468836 - nrLSU, EF468881 - Rpb1), Cordyceps scarabaeicola (thuộc ngân hàng giống ARSRF 5689, mã số truy cập AF339524 nrLSU, DQ522380 - Rpb1) Beauveria caledonica (thuộc ngân hàng giống ARSEF 2567, mã số truy cập AF339520 - nrLSU, EF469086 - Rpb1) Giá trị bootstrap ủng hộ cho phân nhóm cao ba NJ, MP, ML, cụ thể 98/97/98% - nrLSU, 100/99/100% - Rpb1 100/99/100% - nrLSU_Rpb1 Theo báo Sung et al (2007), Cordyceps scarabaeicola Cordyceps staphylinidicola thể hữu tính Beauveria sp., điều giải thích cho phân nhóm Beauveria caledonica clade Kết định danh sơ hình thái so sánh liệu với GenBank cho mẫu DL0075 loài thuộc chi Cordyceps Như vậy, kết luận DL0075 Cordyceps staphylinidicola Cordyceps scarabaeicola Beauveria caledonica SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 57 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.10 Tổng hợp kết định danh mẫu nấm từ liệu phân tử hình thái Mẫu Hình thái NJ nrLSU MP ML NJ DL0038A DL0038B DL0069 DL0075 Cordyceps Cordyceps takaomontana takaomontana Simplicilium sp Cordyceps sp Isaria tenuipes Isaria tenuipes Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola hoặc Cordyceps Cordyceps Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola takaomontana takaomontana Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Isaria tenuipes Isaria tenuipes Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola hoặc Cordyceps Cordyceps Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola takaomontana takaomontana Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Isaria tenuipes Isaria tenuipes Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola hoặc Cordyceps Cordyceps Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola takaomontana takaomontana Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Isaria tenuipes Isaria tenuipes Rpb1 MP Isaria tenuipes SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Isaria tenuipes 58 Khóa luận tốt nghiệp ML NJ nrLSU -Rpb1 MP ML Kết luận Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Cordyceps Cordyceps Simplicillium sp Cordyceps staphylinidicola takaomontana takaomontana Simplicillium lamellicola Cordyceps scarabaeicola Isaria tenuipes Isaria tenuipes Simplicillium lanosoniveum Beauveria caledonica Ghi chú: Isaria tenuipes thể vô tính Cordyceps takaomontana, Beauveria caledonica thể vô tính Cordyceps staphylinidicola Cordyceps scarabaeicola SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 59 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Khóa luận tốt nghiệp 4.1 KẾT LUẬN Một số kết luận rút qua trình thực đề tài sau: - Cặp mồi LR0R/LR5, CRPB1/RPB1Cr đánh giá phù hợp cho thực nghiệm khuếch đại vùng gen mục tiêu nrLSU Rpb1 - Thu thập, xây dựng sở liệu cục vùng gen nrLSU Rpb1 xây dựng thành công phát sinh loài cục dựa 74 trình tự gen nrLSU, 81 trình tự gen Rpb1 50 trình tự kết hợp nrLSU-Rpb1 tham khảo từ Sung cộng sự, 2007 - Xây dựng quy trình thực nghiệm khuếch đại vùng gen mục tiêu nrLSU Rpb1 sử dụng phương pháp tách chiết phenol:chloroform bổ sung βmercaptoethanol CTAB, nhiệt độ bắt cặp tối ưu phản ứng PCR 55oC với cặp mồi LR0R/LR5 46,3oC với cặp mồi CRPB1/RPB1Cr - Giải hiệu chỉnh trình tự gen nrLSU trình tự gen Rpb1 ứng với mẫu DL0038A, DL0038B, DL0069, DL0075, trình tự có độ xác cao phù hợp cho phân tích sau - Xây dựng phát sinh loài dựa liệu vùng gen nrLSU, Rpb1 liệu kết hợp nrLSU-Rpb1 ba phương pháp Neighbor Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood hỗ trợ định danh xác mẫu nấm ký sinh côn trùng DL0038A, DL0038B, DL0075, riêng với mẫu DL0069 định danh tới mức chi (Simplicilium), kết phù hợp với kết định danh hình thái 1.4 ĐỀ NGHỊ Một số hướng nghiên cứu tiếp tục cho đề tài đề nghị như: - Tiếp tục hỗ trợ định danh thêm mẫu nấm ký sinh côn trùng khác phân tích phát sinh loài dựa vùng gen nrLSU Rpb1 - Tiếp tục xây dựng CSDL trình tự nrLSU Rpb1 với trình tự đáng tin cậy hiệu chỉnh Đưa trình tự lên CSDL GenBank nhận mã Accession Number, nguồn liệu phân tử đáng tin cậy để tiếp tục để sử dụng cho phân tích sau SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 60 Khóa luận tốt nghiệp - Kết hợp thêm liệu gen khác để củng cố thêm tính xác cho mẫu định danh xác định tên loài cho mẫu DL0069 chưa thể kết luận đề tài - Công bố thành phần loài nấm ký sinh côn trùng tạo điều kiện phát triển nghiên cứu ứng dụng đời sống SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 61 Khóa luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Đái Duy Ban (2009), Đông trùng hạ thảo, Nhà xuất y học, tr 3-5 Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên (2014), Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược, Hội thảo quốc tế: Hợp tác khoa học công nghệ phát triển bền vững nông nghiệp Lâm Đồng - Tây Nguyên 2014, tr 39-40 Lê Tấn Hưng, V Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thanh Phong, Trương Thị Hồng Vân, Somsak Sivichai (2010), „Nấm côn trùng vườn Quốc gia Cát Tiên: Nguồn tài nguyên quý cho ứng dụng sinh học‟, Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Hà Nội, tr 110 Nguyễn Dương Khuê (2005), „Sử dụng nấm Metarhizium anisophiae Sorok Phòng trừ mối nhà theo phương pháp lây nhiễm‟, Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ 5, Hà Nội, tr 409-414 Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang Nguyễn Đức Thành (2002), „Nghiên cứu, sản xuất ứng dụng chế phẩm sinh học để quản lý loài sâu hại lúa‟, Viện lúa ĐBSCL, tr 274-295 Phạm Quang Thu (2009), „Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang‟, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, số - tháng 4/2009 Phạm Quang Thu (2009), „Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc‟, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, số - tháng 6/2009 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 62 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009), „Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai‟, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, số - tháng 9/2009 10 Phạm Thành Hổ (2013), „Nhập môn công nghệ sinh học‟, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 70-73 11 Phạm Thị Thùy (2010), „Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizum để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát triển nấm Cordyceps làm thực phẩm chức cho người‟, Báo cáo Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 224-231 12 Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân, Phạm Kim Sơn (2006), „Tạo sinh khối thử nghiệm hiệu lực số loại nấm ký sinh sâu ăn tạp rầy mềm hại rau cải Thành phố Cần Thơ‟, Tạp chí nghiên cứu khoa học trường Đại học Cần Thơ 13 Trần Văn Mão (2004), Sử dụng côn trùng vi sinh vật có ích, tập II, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 49-90 14 Võ Thị Oanh, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tiến (2007), „Đặc điểm sinh học khả gây bệnh nấm Metarhizum anisopliae (Metsch.) Sorokin sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.)‟, Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tr 58-63 Tiếng Anh 15 Andreas D Baxevanis, B.F Francis Ouellette (2001), Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins, Wiley Interscience, 323356 16 Au D., Wang L., Yang D et al (2012), „Application of microscopy inauthentication of valuable Chinese medicine I - Cordyceps sinensis, its counterfeits, and related products‟, Microsc Res Tech.,75: 54-64 17 Baldauf S.L., Roger A.J., Wenk-Siefert I., Doolittle W.F (2000), „A kingdomlevel phylogeny of eukaryotes based on combined protein data‟, Science, 290: 972-977 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 63 Khóa luận tốt nghiệp 18 Castlebury L.A., Rossman A.Y., Sung G.H., Hyten A.S., Spatafora J.W (2004), „Multigene phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys chartarum, the indoor air fungus‟, Mycol Res., 108: 864-872 19 Chen Y., Guo H., Du Z., Liu X.Z., Che Y., Ye X (2009), „Ecology-based screen identifies new metabolites from a Cordyceps-colonizing fungus as cancer cell proliferation inhibitors and apoptosis inducers‟, Cell Prolif , 42(6): 838-847 20 Chou., ZG (1994), „Cordyceps sinensis effect on activity of NK and LAK cells in leucocythemia patients‟, Shanghai J Immunol, 14-30 21 Ewens W.J., R Grant (2005), Statistical Methods in Bioinformatics, Springer Science and Business Media: New York 22 Franca L.T.C., Carrilho E., Kist T.B.L (2002), „A review of DNA sequencing techniques‟, University Press, 169-200 23 Hajek A.E and Leger R.J.St (1994), „Interactions between fungal pathogens and insect hosts‟, Annu Rev Entomol., 39: 293-322 24 Halpern, Georges M (2007), Healing Mushrooms, Square One Publishers, 6586 25 Holliday J.C., Cleaver M.P (2008), „Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A review‟, Int J Med Mushr., 10(3): 219-234 26 Jensen A.B., Gargas A., Eilenberg J., Rosendahl S (1998), „Relationships of the insect-pathogenic order entomophthorales (Zygomycota, Fungi) based on phylogenetic analysis of nuclear small subunit ribosomal DNA sequences (SSU rDNA)‟, Fungal Genet Biol, 24: 325-334 27 John M S Bartlett, David Stirling, Optimization of Polymerase Chain Reactions, Methods in Molecular Biology, 226: 91-92 28 John W Stiller and Matthew S Cook (2004), „Functional Unit of the RNA Polymerase II C-Terminal Domain Lies within Heptapeptide Pairs‟, Eukaryot Cell, 3(3): 735-740 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 64 Khóa luận tốt nghiệp 29 Karen Dowell (2008), „Molecular Phylogenetics: An introduction to computational methods and tools for analyzing evolutionary relationships‟, Math 500, 1-16 30 Kim C S., Lee S Y., Cho S H et al., editors (2008), „Cordyceps militaris induces the IL-18 expression via its promoter activation for IFN-gamma production‟, J Ethnopharmacol., 120: 366-71 31 Kim K.M., Kwon Y.G., Chung H.T., Yun Y.G., Pae H.O., Han J.A., Ha K.S., Kim T.W., Kim Y.M (2003), „Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits in vitro and in vivo inflammatory mediators by suppressing NF-kB activation‟, Toxicol Appl Pharmacol, 190(1): 1-8 32 Kobayashi Y (1982), „Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella‟, Trans Mycol Soc Jpn., 23: 329-364 33 Kuo C.F., Chen C.C., Luo Y.H et al (2005), „Cordyceps sinensis mycelium protects mice from group A streptococcal infection‟, J Med Microbiol, 54(8): 795-802 34 Kuo Y.C., Tsai W.J., Shiao M.S., Chen C.F., Lin C.Y (1996), „Cordyceps sinensis as an immunomodulatory agent‟, Am J Chin Med, 24(2): 111-125 35 Linder C.R., T Warnow (2005), An overview of phylogeny reconstruction, In the Handbook of Computational Molecular Biology, Chapman and Hall/CRC Computer & Information Science 36 Liò P., N Goldman (1998), „Models of Molecular Evolution and Phylogeny‟, Genome Research, 8: 1233-1244 37 Liu H.J., Hu H.B., Chu C et al (2011), „Morphological and microscopicidentification studies of Cordyceps and its counterfeits‟, Acta Pharm Sin B, 1: 189-195 38 Masuda M., Urabe E., Sakurai A., Sakakibara M (2006), „Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris‟, Enzyme MicrobTechnol; 39: 641-646 39 Niranjan Reddy B.P (2011), „Basics for the Construction of Phylogenetic Trees‟, Webmed Central BIOLOGY, 2(12): WMC002563 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 65 Khóa luận tốt nghiệp 40 P Brandon Matheny, Yajuan J Liu, Joseph F Ammirati, Benjamin D Hall (2002), „Using Rpb1 Sequences To Improve Phylogenetic Inference Among Mushrooms (Inocybe, Agaricales)‟, American Journal of Botany, 89(4): 688698 41 Patel K.J., Ingalhalli R.S (2013), „Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link – An Important Medicinal Mushroom‟, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(1): 315-319 42 Shah P.A and Pell J.K (2003), „Entomopathogenic fungi as biological control agents‟, Appl Microbiol Biotech., 61: 413-423 43 Shimizu D (1994), Color iconography of Vegetable wasps and plant worms, Seibundo Shinkosha, Tokyo, 198-199 (in Japanese) 44 Shonkor Kumar DAS, Shinya Fujihara, Mina Masuda and Akihiko Sakurai (2010), Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant, San Francisco, USA, 20-22 45 Sicheritz-Ponte´n T., Andersson S.G.E (2001), „A phylogenomic approach to microbial evolution‟, Nucleic Acids Research, 29: 545-552 46 Sumit S.D., Sanjay K., Priti M., Rameshwar S., Anil K.P (2011), „D1/D2 Domain of Large-Subunit Ribosomal DNA for Differentiation of Orpinomyces spp.‟, Appl Environ Microbiol, 6722-6735 47 Sung G.H., N.L.H.-J., Sung J.M., Jennifer Luangsa-ard J., Bhushan Shrestha, Joseph W Spatafora (2007), „Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi‟, Studies in Mycology, 57: 5-59 48 Sung G.H., Sung J.M., Hywel-Jones N.L., Spatafora J.W (2007), „A multigene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach‟, Molecular Phylogenetics and Evolution, 44: 1204-1223 49 Waddington M (2009), „Identification of Fungi Using Ribosomal Internal Transcribed Space DNA Sequences‟, Pharmaceutical technology SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 66 Khóa luận tốt nghiệp 50 Wang S.Y., Shiao M.S (2000), „Pharmacological functions of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species‟, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4): 248-257 51 Weng S.C., Chou C.J., Lin L.C., Tsai W.J., Kuo Y.C (2002), „Immunomodulatory functions of extracts from the Chinese medicinal fungus Cordyceps cicadae‟, J Ethnopharmacol.,83: 79-85 52 Winkler D (2008), „Yartsa Gunbu (Cordyceps sinensis) and the Fungal Commodification of the Rural Economy in Tibet AR‟, Economic Botany, 63(2): 291-306 53 Xuanwei Z., Zhenghua G., Ying S., Juan L., Kexuan T (2009), „Cordyceps fungi: Natural products, pharmacological funtions and developmental products‟, Journal of Pharmacy and pharmacology, 61(3): 279-291 54 Zhou X., Luo L., Dressel W et al (2008), „Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient of Cordyceps sinensis‟, Am J Chin Med, 36(5): 967-980 Internet 55 http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm 56 http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer _design.htm 57 http://cordyceps.us/pages/biology 58 http://cordyceps.us/pages/systematics 59 http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction 60 http://lutzonilab.org/rna-polymerase-rpb1/ 61 http://oomyceteworld.net/protocols/primer%20designing2.pdf 62 http://www.anonbiotec.com/images/Buddha_Mushroom/1.jpg 63 http://www.bioinformatics.org/sms/iupac.html 64 http://www.cesti.gov.vn/khong-gian-cong-nghe/san-xuat-dong-trung-hathao.html 65 http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 67 ... hữu ích gen Rpb1 việc phân tích phát sinh loài công bố kết cho thấy vùng gen đem lại kết phân tích phát sinh loài ổn định phù hợp vùng gen nrLSU Theo đó, điều tra so sánh phát sinh học nấm sử... cứu phả hệ phân tử hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng loài sinh vật khác [48, 46] 1.2.2.2 Trình tự gen Rpb1 định danh phân tử nấm Vùng gen giữ nhà - housekeeping genes gen biểu thường xuyên... đề trên, kỹ thuật phân tử áp dụng để hỗ trợ công tác phân loại loài nấm [26] 1.2.2 Trình tự nrLSU Rpb1 định danh phân tử nấm Định danh phân tử phương pháp phân loại sinh vật mức độ phân tử dựa