Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ vùng gen nrLSU

B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP. H CHÍ MINH KHOA CÔNG NGH SINH HC BÁO CÁO KHOÁ LUN TT NGHIP H TR  A TRÊN PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN nrLSU. KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: PGS. TS. LÊ HUYN ÁI THÚY ThS. LAO C THUN SVTH: NGUYN TH HI NGC MSSV: 1053010498 NIÊN KHÓA: 2010-2014 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014 LI CM N  hoàn thành khoá lun tt nghip này, li đu tiên, em xin t lòng bit n sơu sc đn thy ThS. Lao c Thun, đƣ tn tình hng dn, ch bo vƠ giúp đ em trong sut quá trình nghiên cu và thc hin đ tài. Em xin chân thành gi li cm n đn cô PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy, ThS. Lao c Thun, ThS. Trng Kim Phng và tt c các Thy, Cô trong khoa Công Ngh Sinh Hc, Trng i Hc M Tp. H Chí Minh đƣ tn tình hng dn, giúp đ và truyn đt cho em vn kin thc quý giá trong sut 4 nm hc tp ti trng. Nhng kin thc, kinh nghim và nim đam mê nghiên cu khoa hc mà em nhn đc t quý Thy, Cô s lƠ hƠnh trang đ em vng bc trong tng lai. Cm n tt c các bn bè trong phòng thí nghim Sinh hc phân t đƣ nhit tình giúp đ, đng viên mình nhng lúc khó khn trong thi gian thc hin đ tài. Cui cùng em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c bn bè vƠ gia đình, đc bit là cha m và nhng ngi thân yêu, nhng ngi đƣ luôn to điu kin, ng h và đng viên em vt qua nhng khó khn trong cuc sng. Em xin chân thành cm n! Bình Dng, ngƠy 22 tháng 05 nm 2014 SINH VIÊN THC HIN Nguyn Th Hi Ngc Danh mc bng biu B nrLSU 23 Bng 3.1. Bng đánh giá mi khuch đi vùng gen nrLSU nm ký sinh côn trùng. 26 Bng 3.2. Kt qu kim tra DNA bng quang ph k kho sát trên 3 mu nm ký sinh côn trùng đc tách chit theo phng pháp phenol:chloroform. 30 Bng 3.3. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph các mu nm tách chit có b sung -mercaptoethanol 31 Bng 3.4. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph k các mu nm tách chit có b sung -mercaptoethanol 32 B ng hp thit lp chu k nhit PCR khuch đi các vùng gen nrLSU ca các mu nm ký sinh côn trùng 33 Bng 3.6. Bng hiu chnh các nucleotide ti các v trí (i) đn (vi) 35 Bng 3.7. Tng hp kt qu hiu chnh trình t các mu nm ký sinh côn trùng. 38 Bng 3.8. Kt qu chiu dài các trình t trc và sau hiu chnh. 39 Bng 3.9. nrLSU 40 B [38] 41 B 59 Danh mc hình nh Hình 1.1. Cordyceps sinensis 3 4 Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA. 9 Hình 1.4. S đ v trí các vùng domain thuc trình t nrLSU 10 Hình 3.1. Kt qu kim tra mi bng BLAST trên GenBank 27 Hình 3.2. V trí mi xuôi LR0R đc sp gióng ct vi các trình t d liu. 28 Hình 3.3. V trí mi ngc LR5 đc sp gióng ct vi các trình t d liu. 28 Hình 3.4. Kt qu Annhyb cp mi LR05/LR5 vi trình t gen nrLSU. 29 Hình 3.5. Kt qu đin di sn phm cp mi LR0R/LR5 tách chit theo phng pháp phenol: chloroform. 30 Hình 3.6. Kt qu đin di sn phm vi cp mi LR0R/LR5 tách chit theo phng pháp phenol:chloroform b sung -mercaptoethanol. 31 Hình 3.7. Kt qu đin di 7 mu vi cp mi LR0R/LR5 trong quy trình b sung -mercaptoethanol và ti u hóa nhit đ. 32 Hình 3.8. Hiu chnh tín hiu nhiu  đu mch xuôi ca nrLSU mu DL0015. 34 Hình 3.9. V trí sai lch ca hai kt qu gii trình t  đu mch xuôi ca LSU. 35 Hình 3.10. Hiu chnh  vùng gia trên 2 mch nrLSU. 36 Hình 3.11. Hiu chnh vùng 3, vùng 4 trên mch xuôi ca gen nrLSU. 36 Hình 3.12. Hiu chnh vùng cui mch xuôi (5‟-3‟) ca gen LSU 37 Hình 3.13. Hiu chnh vùng cui trên mch xuôi ca gen nrLSU. 37 Hình 3.14. Hình kt qu BLAST trình t nrLSU mch xuôi sau hiu chnh. 37 Hình 3.15. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot plot. 38 Hình 3.16. Cơy NJ đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 47 Hình 3.17. Cơy ML đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 48 Hình 3.18. Cơy MP đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 49 Hình 3.19. Cây ph h phân t NJ ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 54 Hình 3.20. Cây ph h phân t ML ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 55 Hình 3.21. Cây ph h phân t MP ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 56 MC LC T VN  1 CHNG 1. TNG QUAN 1.1. NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 2 1.1.1. c đim chung và thành phn loài 2 1.1.2. Tim nng ng dng 4 1.2. NGHIÊN CU NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 6 1.2.1. c đim nhn dng vƠ đnh danh 6 1.2.2. nh danh phân t 7 1.2.3. DNA ribosome và trình t nrLSU trong đnh danh phân t nm 8 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRONG NC 10 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRÊN TH GII 11 1.5. PH H PHÂN T 12 1.5.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài 12 1.5.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh chng loài 12 1.6. K THUT PCR VÀ GII TRÌNH T T NG 17 1.6.1. K thut PCR 17 1.6.2. Gii trình t t đng 18 CHNG 2. VT LIU ậ PHNG PHỄP 2.1. THI GIAN VÀ A IM NGHIÊN CU 19 2.2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIểN CU 19 2.2.1. B mu nm ký sinh côn trùng 19 2.2.2. Dng c - thit b - hoá cht 19 2.2.3. Danh mc các phn mm s dng 20 2.3. TIN TRÌNH NGHIÊN CU 21 2.3.1. Tách chit DNA tng s t h si nm ký sinh côn trùng 22 2.3.2. Kim tra sn phm DNA đƣ tách chit 22 2.3.3. PCR 23 2.3.4. in di 23 2.3.5. Gii trình t 23 2.3.6. Hiu chnh trình t 24 2.3.7. So sánh vi c s d liu Genbank 25 2.3.8. Xây dng b c s d liu DNA 25 2.3.9. Dò tìm mô hình tin hoá 25 2.3.10. Xây dng cây phát sinh loài 25 CHNG 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1. KT QU ÁNH GIÁ MI 26 3.1.1. Kim tra cp mi vi các thông s vt lý trên IDT 26 3.1.2. Kim tra mi bng BLAST trên NCBI 27 3.1.3. Kim tra mi bng sp gióng ct vi Clustal2w 28 3.1.4. Kt qu Annhyb cp mi LR0R/LR5 vi trình t gen nrLSU 29 3.2. XÂY DNG QUY TRÌNH THC NGHIM NHM KHUCH I VÙNG GEN LSU CHO CÁC MU NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 29 3.3. KT QU HIU CHNH TRÌNH T 33 3.4. .KT QU SO SÁNH VI C S D LIU TRÊN GENBANK 40 3.5. XÂY DNG B D LIU TRÌNH T GEN LSU 41 3.6. KT QU XÂY DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 46 CHNG 4. KT LUN VÀ  NGH 4.1. KT LUN 60 4.1.1. V lý thuyt 60 4.1.2. V thc nghim 60 4.2.  NGH 61 5. TÀI LIU THAM KHO 62 Danh mc nhng ch vit tt ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Bp : base-pair DNA : deoxyribonucleotide triphosphate ETS : external transcribed spacer IGS : intergenic spacer ITS : internal transcribed spacer LSU : large subunit ML : maximum likelihood MP : maximum parsimony NJ : neighbor-joining Nu : nucleotide rDNA : ribosomal DNA rRNA : ribosomal RNA OTUs : operational taxanomic unit Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014 SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 1 T VN  Cordyceps sinensis Cordyceps sinensis có hot tính chng phát trin t bào khi u, chng oxi hóa và kích thích s đáp ng min dch ca c th, nh đó cha tr đc nhiu bnh liên quan đn thn, huyt áp, tim mch, min dch, ni tit t, ung th… Gn đơy, nhiu nghiên cu cho thy không ch có Cordyceps sinensis mà nhiu loài khác trong chi Cordyceps và các chi h hƠng (Isaria, Metarcordyceps) cng mang li nhng tim nng ng dng cao trong y dc. Trc đơy, vic đnh danh và xây dng h th c các loài nm này ch yu da trên phân tích hình thái gii ph  phát trin mnh ca sinh hc phân t đƣ cho phép công tác đnh danh chính xác hn da vào vic xây dng cây ph h trên các trình t có tính đc trng cho các chi vƠ các loài nm. Mt trong các trình t đc s dng rt ph bin trong đnh danh nm là vùng trình t nrLSU (trình t DNA mã hoá tiu phn ln ribosome), đơy lƠ vùng trình t thuc rDNA, có nhiu bn sao trong b gen, d dàng khuch đi bng các mi ph quát nên thng đc s dng đ thit lp mi quan h v ngun gc ca nm. Trong gii hn ca đ tài chúng tôi s xây dng quy trình h tr đnh danh các loài nm ký sinh côn trùng da trên phân tích vùng gen nrLSU bng phng pháp sinh hc phân t kt hp vi sinh tin hc. [...]... (Ophiocordyceps variabilis c chi n m ký sinh côn trùng có kh u ki ir n u tính (d ng qu th ng mycelium) c i s phát tri a sinh h c phân t các loài c 1.2.2 nh danh phân t i sinh v t nh danh phân t m phân t d a trên so sánh trình t nucleotide và axit amin c a các phân t DNA, RNA, protein Trong nghiên c nh danh phân t , vi c l a ch n vùng trình t DNA, RNA, protein kh o sát gi a các loài là m t n cao trong cùng... ng ki m soát côn trùng Ngoài ti ng d d ng trong ki m soát sinh h c ng m ký sinh trên côn trùng, Cordyceps tr ch c a các loài côn trùng gây h i Vì v y nhi r u tranh sinh h c ki m soát d ch b c s d ng bi n là các loài Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi Theo McCoy (1990) [31], các tiêu chí quan tr tr sâu sinh h c bao g m kh SVTH: Nguy n Th H i Ng c các loài n m côn trùng có th... t nghi c 2013-2014 1.1 N M KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1.1 c i m chung và thành ph n loài Cordyceps là m t chi n m ký sinh trên côn trùng thu c h Clavicipitaceae, b Hypocreales, l p Pyrenomycetes, ngành n m túi Ascomycota [21] Chi Cordyceps xu t phát t ti m hình d ng trong t nhiên c a n m có hình gi u có d ng m n i b t c a n m ký sinh côn trùng là nh ng giá tr Loài n m ký sinh côn trùng có giá tr c quý hi m... D1, D2 là nh ng domain khác nhau n m trên vùng gen LSU có kh nh ng loài có m i liên quan r t g tin di truy n, có tính bi khu i quy t vi nh danh i nhau b i các domain này ch a nhi u thông ng 1.3 Vi t Nam, các nghiên c u v thành ph n loài n m ký sinh côn trùng v c quan tâm Do v t công b nào v thành ph n các loài n m ký sinh côn trùng S thi u thông tin v thành ph n loài làm cho kh c ng d ng trong nghiên... s ho t ch t sinh h u Vi nh th 1.4 Hi n nay, nghiên c u ph h phân t nh m xây d ng h th ng phân lo danh các loài n m ký sinh côn nghiên c u, n i b c c nhi u nhà khoa h c nh kh khu v Hàn Qu c, Trung Qu c, Nh t B n, M , Thái Lan Do v y, trong nh n công trình nghiên c u v h th ng phân t c a n m ký sinh côn trùng ngày c tính, s và s ng nghiên c ng các loài trong m i nghiên c Hi n nay, nhi u công trình nghiên... t m t s loài n G c d a vào vùng gen nrLSU [27] u ph h d a trên nhi 2007, Sung và c ng s ng m p x p l i h th ng phân lo i nhóm n m cordyceps và clavicipitacea, chia các loài trong nhóm n m này thành 3 h là Clavicipitaceae s.s., Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae d a trên phân tích ph h phân t 7 vùng gen nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, tef1, tub, atp6 v i b d li u 162 loài n m k t h p v i nh danh b ng... ng l n gi danh m t s loài thì vùng gen gi nhà (house- m b o tính b o iv nh c s d ng ph bi n trong nhi SVTH: Nguy n Th H i Ng c 7 Khoá lu n t t nghi c 2013-2014 nh danh phân t h thành ngành khoa n trong phân lo i h c, b sung trong phân lo i h c truy n th ng nh ng um 1.2.3 DNA ribosome và trình t nrLSU trong nh danh phân t n m nh danh phân t là m i sinh v t, s d ng d li u là các trình t phân tích Trong... u ph h phân t nrLSU làm gen m c tiêu trong nghiên c d ng vùng gen Trung Qu c, Jeewon nghiên c u m i quan h ph h phân t c a các loài n m thu c h Amphisphaeriaceae d a vào d li M n hành nghiên c u xây d ng h th ng phân lo i các loài n m thu c h Clavariaceae d a vào vùng SVTH: Nguy n Th H i Ng c 11 Khoá lu n t t nghi gen nrLSU c 2013-2014 Hàn Qu c, Ji Seon Lee nghiên c u nh m phát tri n nh danh phân t... so sánh các c p phân lo i t cao xu nc c bi t, vùng DNA D1/D2 mã hóa cho ti u ph n l n c a ribosome g c xem là r t h u ích cho vi c phân lo i ph n l n các loài n m có giá tr c [15] [26] SVTH: Nguy n Th H i Ng c 9 Khoá lu n t t nghi Hình 1.4 c 2013-2014 v trí các vùng domain thu c trình t nrLSU [50] Các nghiên c u ph h phân t iv in mt d ng vùng gen mã hóa RNA c a ribosom (nrSSU, nrLSU) làm vùng gen m c... không ch có Cordyceps sinensis mà nhi u loài khác trong chi Cordyceps và các chi h mang l i nh ng ti ng d c[20] Trong t nhiên, Cordyceps sinh sôi n y n t t trong các khu r nhi i i và u trùng và c trên cá th thành c a nhi u loài côn trùng khác nhau Sau khi xâm nh ng côn trùng, bào t n m s n y m m và phát tri n thành h s i n m H s i n m s xâm chi m và thay th các mô v t ch và s hình thành qu th khi g . s xây dng quy trình h tr đnh danh các loài nm ký sinh côn trùng da trên phân tích vùng gen nrLSU bng phng pháp sinh hc phân t kt hp vi sinh tin hc. 1. CHNG. ca nm ký sinh côn trùng là nhng giá tr y dc quý him. Loài nm ký sinh côn trùng có giá tr y dc đc bit đn đu tiên là Cordyceps sinensis, sng ký sinh trên u trùng ca các loài sâu. MINH KHOA CÔNG NGH SINH HC BÁO CÁO KHOÁ LUN TT NGHIP H TR  A TRÊN PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN nrLSU. KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: