Hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ vùng gen RPB1

B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP.HCM KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: H TR NH DANH NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN RPB1 KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HC PHÂN T GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy ThS. Lao c Thun SVTH : Hunh Tho Trân MSSV : 1053010833 Khóa : 2010-2014 Bình Dng, tháng 5 nm 2014 LI CM N u tiên cho phép em đc gi li cm n chân thành và s tri ân sâu sc ti cô Lê Huyn Ái Thúy, cô Trng Kim Phng và thy Lao c Thun. Thy, cô không ch truyn đt nhng kin thc quý báu mà còn dy em nhng bài hc trong cuc sng, giúp em hoàn thin nhân cách cng nh tri thc. c bit, thy cô đã cho em c hi tìm thy đam mê tht s và đc làm vic ht mình cho nhng điu mình yêu thích. Vi lòng bit n sâu sc nht, em xin gi đn quý thy cô  khoa Công ngh sinh hc nói chung và các thy cô trong chuyên ngành vi sinh – sinh hc phân t nói riêng đã truyn đt cho em vn kin thc quý báu. Bên cnh đó, xin gi li cm n đn các bn và các em  phòng thí nghim đã luôn giúp đ và đng viên tôi trong sut quá trình thc hin đ tài. Cui cùng, con xin gi li cm đn cha m, đã dy d, yêu thng, nuôi nng con khôn ln nh ngày hôm nay. Gia đình là ch da tinh thn giúp con vt qua nhng khó khn trong cuc sng. Em xin chúc quý thy cô di dào sc khe, gt hái nhiu thành công. Bình Dng, tháng 5 nm 2014 Hunh Tho Trân MC LC 1.1. TNG QUAN V NM CORDYCEPS 3 1.1.1. c đim chung 3 1.1.2. Phân loi khoa hc 3 1.1.3. Ngun gc tên gi 4 1.1.4. Các hp cht có trong Cordyceps 4 1.1.5. ng dng 6 1.2. NGHIÊN CU NH DANH 8 1.2.1. nh danh bng đc đim hình thái và phân tích gii phu 8 1.2.2. Tng quan v gen rpb1 8 1.3. NGHIÊN CU PHÁT SINH LOÀI 10 1.3.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài: 10 1.3.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh loài: 10 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRONG NC 14 1.5. THU THP C S D LIU 15 1.5.1.Mc đích 15 1.5.2. Khai thác và x lý thông tin 15 1.6. CÁC PHNG PHÁP SINH HC PHÂN T 16 1.6.1.K thut PCR (Polymerase Chain Reaction) 16 1.6.2. in di 17 1.6.3. Gii trình t 17 1.7. HIU CHNH TRÌNH T (proofreading): 18 2.1. VT LIU 20 2.1.1. B mu nm ký sinh côn trùng 20 2.1.2. Dng c -thit b-hóa cht 20 2.1.3. Danh mc các phn mm và trang web trc tuyn 22 2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 22 2.2.1. Kho sát in silico 22 2.2.2. Tin hành thc nghim 23 2.2.3. Hiu chnh và phân tích kt qu gii trình t 27 3.1. C S D LIU CC B VÀ KHO SÁT IN SILICO 28 3.1.1. C s d liu cc b 28 3.1.2. Kt qu đánh giá mi 31 3.2. KT QU THC NGHIM TRÊN MU NM KÝ SINH CÔN TRÙNG36 3.1.1. Tách chit DNA và ti u hóa quy trình 36 3.1.2. Phn ng khuch đi DNA và ti u hóa quy trình 37 3.1.3. Gii trình t và hiu chnh sau gii 40 3.1.4. Kt qu so sánh vi d liu Genbank 46 3.3. KT QU DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 47 4.1.KT LUN 57 4.2.  NGH 57 DANH MC BNG Bng 1.1. Các chc nng ca BLAST Bng 2.1. Các mi s dng khuch đi gen rpb1 Bng 2.2. Các thành phn trong phn ng PCR Bng 3.1. Ngun gc các trình t rpb1 dùng tham chiu Bng 3.2. Trình t và các thông s đánh giá mi ca IDT khuch đi gen rpb1 Bng 3.3. Kt qu đo OD tách chit DNA theo phng pháp Phenol:chloroform Bng 3.4. Kt qu đo OD các mu DL0038B, DL0075 Bng 3.5.Tng hp kt qu hiu ch nh trình t các mu nm ký sinh côn trùng Bng 3.6.Kt qu chiu dài trc và sau khi hiu chnh Bng 3.7. Kt qu so sánh trình t rpb1đã hiu chnh t vi các trình t trên GenBank Bng 3.8. Tng hp kt qu đnh danh mu nm t d liu phân t DANH MC HÌNH Hình 1.1. Mô t chc nng vùng CTD ca gen rpb1 Hình 1.2. Cu trúc vùng gen rpb1 Hình 2.1. Các thông s thi lp chu k nhit phn ng PCR khuch đi gen rpb1 Hình 3.1. Mô t kt qu Annhyb khuch đi vùng gen rpb1 Hình 3.2. Kt qu BLAST cp mi CRBP1/RBP1Cr Hình 3.3. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 tách chit theo phng pháp phenol:chloroform Hình 3.4. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 khuch đi gen rpb1 vi Ta=53 o C Hình 3.5. Kt qu đin di hai mu nm DL0038B và DL0075 khuch đi gen rpb1 vi Ta=46,3 o C Hình 3.6. Kt qu đin di sáu mu DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077 đc thc hin bng quy trình ti u Hình 3.7. Hiu chnh tín hiu  đu mch xuôi mu DL0038B Hình 3.8. Hiu chnh tín hiu  vùng đu trên 2 mch-vùng s 3 Hình 3.9. Hiu chnh  vùng gia hai mch rpb1 Hình 3.10. Hiu chnh vùng cui 2 mch-vùng 4 Hình 3.11. Hiu chnh trình t cui ca hai mch Hình 3.12. Kt qu BLAST trình t mch xuôi đã hi u chnh Hình 3.13. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot plot Hình 3.14. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade A dng theo phng pháp NJ - Neighbor joining Hình 3.15. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade B dng theo phng pháp ML - Maximum likelihood Hình 3.16. Cây ph h phân t thuc nhóm Clavicipitaceae clade C dng theo phng pháp NJ - Neighbor joining Hình 6.1. Kt qu BLAST trình t mu DL006 đã hiu chnh Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp NJ Hình 6.2. Kt qu BLAST trình t mu DL0015 đã hiu chnh Hình 6.3. Kt qu BLAST trình t mu DL0038B đ ã hiu chnh Hình 6.4. Kt qu BLAST trình t mu DL0069 đã hiu chnh Hình 6.5. Kt qu BLAST trình t mu DL0075 đã hiu chnh Hình 6.6. Kt qu BLAST trình t mu DL0077 đã hiu chnh Hình 6.7. Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp NJ Hình 6.8.Cây Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp ML Hình 6.9. Cây ph h đnh danh 6 mu dng bng phng pháp MP Hình 6.10. Cây ph h phân t dng bng phng pháp ML Hình 6.11. Cây ph h phân t dng bng phng pháp MP Danh mc nhng ch vit tt ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Bp : base-pair DNA : deoxyribonucleotide triphosphate LSU : large subunit ML : maximum likelihood MP : maximum parsimony NJ : neighbor-joining Nu : nucleotide rDNA : ribosomal DNA RNA : ribosomal RNA rRNA : ribosomal RNA SSU : small subunit TBE : Tris, Borate, EDTA T VN  1 Cordyceps là nm ký sinh  côn trùng nh sâu bm, côn trùng cánh cng, b xít, chun chun, ve su, kin, nhn Các loài nm thuc chi Cordyceps có nhiu ng dng trong lnh vc y dc, vì nm có cha các hot cht có kh nng điu hòa đáp ng min dch, c ch t bào ung th [35][22]; ci thin chc nng phi, thn [48]. Hin nay trên th trng các sn phm t nm có giá tr v dc tính khác nhau và mi loài li có giá tr cha tr riêng tng loi bnh. Do đó, vic xác đnh loài trong chi này là rt cn thit. Tuy nhiên, vic đnh danh loài nm Cordyceps là rt khó khn bi chúng có hình thc sinh sn hu tính (teleomorph) và hình thc sinh sn vô tính (anamorph). Ngoài ra chúng còn chu tác đng ca môi trng nên có th bin thành dng d hình thái khin các nhà phân loi nhm ln. Do đó, cùng mt ging loài có các tên khác nhau. Ví d, Metacordyceps taii là tên khác ca Metarhizium anisopliae hay Cordyecps congfragosa còn tên gi khác là Lecanicillium lecanii [42]. Hin nay, s kt hp gia sinh hc phân t và tin sinh hc đã góp phn tích cc trong vic gii quyt mt cách hu hiu nhng vn đ khó khn trên. Ngoài ra s kt hp này còn giúp xác đnh mt cách chính xác loài và h thng phát sinh loài ca nhóm nm này da vào vic xây dng cây ph h trên các trình t có tính đc trng cho các chi và các loài nm. in hình nh Sung và cs nghiên cu theo hng các gen thuc nhóm gen gi nhà (house-keeping-genes) xây dng h thng phát sinh loài [42] hay các gen đc s dng đ phân tích ph h phân t trong d án AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) [53]. Trong đó có gen rpb1 (rpb1 là vùng gen mã hóa protein RNA polymerase II). Tiu phn 1 này cha các exon có đ bo tn có ý ngha trong tin hóa và phân loi các loài nm. Xut phát t các vn đ trên đ tài: “H tr đnh danh nm ký sinh côn trùng da trên phân tích ph h vùng gen rpb1” đc thc hin.  tài nghiên cu trên c s phân tích trình t gen rpb1 vi nhng mc tiêu và phng pháp sau: (1) kho sát in silico - thu thp trình t to c s d li u cc b gen rpb1, đánh giá cp mi đ khuch đi gen rpb1 da theo các ch tiêu; (2) tin hành thc nghim xây dng quy trình tách chit DNA t h si nm, ti u hóa chu trình PCR đ khuch đi vùng gen mc tiêu, gii trình t, xây dng và so sánh các cây ph h phân t t c s d liu trình t thu thp đc. [...]... t ho i sinh ho c kí sinh) có quan h g n v i gi i n m [17] Tác gi Matheny và cs ã s d ng vùng gen rpb1; rpb1 k t h p rpb2 so sánh v i vùng gen mã hóa cho ribosome-nLSU c i thi n và m r ng phân tích cây phát sinh loài n m [31][32] Do ó vi c s d ng gen rpb1 làm c s phân t c u phát sinh loài và d ng cây ph h phân t h tr ti n hành nghiên nh danh n m ký sinh côn trùng là h p lý 1.3 NGHIÊN C U PHÁT SINH LOÀI... phiên mã Hình 1.1 Mô t ch c n ng c a vùng CTD c a gen rpb1 [16] Rpb1 có tr ng l vùng exon có ng phân t kho ng 220kDa, chi u dài kho ng 3Kbp có ch a các b o t n cao c th hi n trong hình 2 (vùng tô en là các exon) [51] Hình 1.2 C u trúc vùng gen rpb1 [52] Gen rpb1 th ng nhân th c nh th c v t, sao ch tr c s d ng trong nghiên c u phân tích ph h ng v t, n m a s gen rpb1 sinh v t các loài ch có m t b n m t... Trypanosome ch a gen paralogous [37] M t s công trình nghiên c u s d ng gen rpb1 h tr cho vi c nghiên c u phát sinh ph h : 9 Croan và cs ã s d ng gen rpb1 các loài n m Leishmania Tác gi vi c nghiên c u m i quan h hàng gi a ã so sánh trình t gen gi a DNA và RNA polymerase[12] H n th có th s d ng rpb1 phân tích phát sinh loài h n Theo Hirt và cs ã s d ng trình t gen rpb1 m c sâu ch ng minh Microsporidia (sinh v... m t th vô tính c a C subsessilis Do ó, nghiên c u v m t phân t k t h p tin sinh h c là xu h h tr nh danh chính xác h n, c th trong ph m vi ng m i giúp tài là t p trung phân tích, so sánh các trình t DNA c a các vùng gen rpb1 1.2.2 T ng quan v gen rpb1 8 Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II – ti u n v l n nh t c a RNApolymerase II) là vùng gen mã hóa cho ti u ph n l n nh t c a protein RNA polymerase... LI U VÀ PH NG PHÁP 2.1 V T LI U 2.1.1 B m u n m ký sinh côn trùng Các m u h s i n m c phân l p và làm thu n t các m u n m ký sinh côn trùng thu th p t nh ng chuy n i th c t nh Lâm a t i vùng núi Langbiang khu v c ng do H i Sinh H c Tp H Chí Minh cung c p 2.1.2 D ng c -thi t b -hóa ch t 2.1.2.1 D ng c Các d ng c thông th ng tring phòng thí nghi m sinh h c phân t Các d ng c chính g m: k p l y m u, èn... PHÁT SINH LOÀI 1.3.1 Ph h phân t trong nghiên c u phát sinh loài: Ph h phân t là nghiên c u v m i quan h ti n hóa c a t p h p các trình t gen, d a vào phân tích s khác bi t di truy n phân t (DNA, RNA, protein) K t qu phân tích phân t c th hi n qua m t cây ph h D ng cây ph h phân t là m t quá trình ph c t p b i th c t là không th xây d ng m t cây úng nh t T p h p d li u phát sinh loài có th bao g m hàng... thu pháp nh m h tr c tài s cung c p thêm m t ph ng nh danh n m ký sinh côn trùng 2 PH N 1 T NG QUAN 1.1 T NG QUAN V N M CORDYCEPS 1.1.1 c i m chung Cordyceps (thu c h Clavicipitaceae) là n m ký sinh côn trùng và i di n là n m Cordyceps sinensis gây nhi m trên sâu Hepialus armoricanus Vi t Nam và Trung Qu c, C.sinensis c g i v i tên thông th ng là ông trùng h th o C.sinensis có g c g n v i quân c u, u... thiên th gi i và c xem nh là các it ch ph bi n c a các loài chân kh p trên kh p ng ki m soát sinh h c [14][40] Nhóm n m này có s phân b r ng, tính a d ng các loài n m côn trùng tùy thu c vào i u ki n môi tr ng, tính a d ng c a các loài côn trùng và tình tr ng c a ký ch [23] Nhi u loài n m côn trùng ã c ng d ng r ng rãi trong u tranh sinh h c ki m soát d ch h i, trong ó ph bi n là các loài Beauveria bassiana,... hành i u tra nhóm n m ký sinh côn trùng t i v gia Cúc Ph ng Nghiên c u s d ng ph n qu c ng pháp so sánh hình thái gi i ph u phân lo i K t qu công b có các loài Cordyceps sp., C nutans, C pruinosa, C specocephala và Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces sp.[15] N m 2006, nhóm các nhà nghiên c u n m ký sinh côn trùng c a BIOTEC, Thái Lan ã k t h p v i Vi n Sinh h c Nhi t v i kh... thành công trong vi c s d ng n m côn trùng phòng tr các lo i côn trùng và sâu h i cây tr ng, Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana ã sâu h i ut ng và Tr n m c ng d ng trong phòng tr , u xanh [7], r y m m và các loài sâu h i lúa [4] 1.2 NGHIÊN C U 1.2.1 i n hình nh NH DANH nh danh b ng c ây, vi c c i m hình thái và phân tích gi i ph u nh danh và xây d ng h th ng h c các loài n m này ch y u d a trên . NGHIP Tên đ tài: H TR NH DANH NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN RPB1 KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HC PHÂN T GVHD: PGS trên đ tài: “H tr đnh danh nm ký sinh côn trùng da trên phân tích ph h vùng gen rpb1 đc thc hin.  tài nghiên cu trên c s phân tích trình t gen rpb1 vi nhng mc tiêu và. rng phân tích cây phát sinh loài  nm [31][32]. Do đó vic s dng gen rpb1 làm c s phân t đ tin hành nghiên cu phát sinh loài và dng cây ph h phân t đ h tr đnh danh nm ký sinh