2.2.2.1. Tách chi t DNA
Nguyên t c
Ph ng pháp phenol/chloroform khơng và b sung -mercaptoethanol đ
tách chi t DNA. Trong đĩ, màng t bào và màng nhân đ c bi n tính b ng ch t t y m nh. Sau đĩ protein s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform và b lo i b , DNA s đ c t a v i ethanol l nh.
Các b c ti n hành
- Ly gi i t bào v i lysis buffer khơng b sung -mercaptoethanol
Dùng que c y vịng (vơ trùng) ti n hành l y m t ph n h s i n m (kho ng 1.5g) hịa tan trong ng eppendorf ch a s n 700µl dung d ch lysis buffer (70µl Tris-HCl pH 1M, 14µl EDTA 0.5M, 140 µl SDS 10%, 140 µl NaCl 0.5M, 266 µl dd H2O, 70 µl Proteinase K 1mg/ml), đ o ng đ u. qua đêm nhi t đ 65oC
- Ly gi i t bào v i lysis buffer cĩ s d ng -mercaptoethanol
Dùng que c y vịng (vơ trùng) ti n hành l y m t ph n h s i n m (kho ng 1.5g) hịa tan trong ng eppendorf ch a s n 700µl dung d ch lysis buffer (70µl Tris-HCl pH 1M, 14µl EDTA 0.5M, 140 µl SDS 10%, 140 µl NaCl 0.5M, 7 µl - mercaptoethanol 99.9%, 259 µl dd H2O, 70 µl Proteinase K 1mg/ml), đ o ng
24 - Tách chi t DNA
L y d ch qua đêm ti n hành ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Lo i b ph n c n, thu d ch n i, b sung 700µl dung d ch PCI (phenol/chloroform/isoamylalcohol v i t l 25:24:1), l c đ u ng và ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Thu d ch n i, b sung 1V chloroform, l c đ u. Ly tâm 13000 vịng/phút. Ti n hành thu d ch n i và b sung 1/10V dung d ch NaOAc 3M, l c đ u, b sung thêm 1V isopropanol, l c đ u và nhi t đ 4oC trong vịng 2 gi . Sau đĩ đem 13000 vịng/phút trong 20 phút, lo i b d ch n i, thu t a. Ti p đ n b sung 1ml ethanol 70o, ly tâm 13000 vịng/ phút trong 10 phút 4oC, lo i d ch n i, lo i b ethanol và làm khơ c n t i 50oC.B o qu n m u trong 50µl TE 1X.
2.2.2.2. Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n
Nguyên t c ph ng pháp đo quang ph
Hàm l ng DNA cĩ th xác đ nh đ c nh s h p thu m nh ánh sáng b c sĩng 260 nm. Giá tr m t đ quang OD260 (Optical Density 260 nm) c a các m u DNA cho phép xác đnh n ng đ DNA trong dung d ch (v i A260 = OD = 50 µg/ml DNA s i đơi). tinh s ch c a DNA đ c đánh giá qua t l A260/A280. Cĩ th xem DNA thu nh n đã tinh s ch khi giá tr này dao đ ng t 1,8- 2.
Các b c ti n hành
DNA sau khi tách chi t đ c pha lỗng 6 l n b ng n c c t vơ trùng. Sau
đĩ chuy n t t c dung d ch vào cuvette và đo n ng đ DNA b c sĩng 260 nm. tinh s ch c a dung d ch đ c xác đnh b ng OD260/OD280.
25 2.2.2.3. Ph n ng PCR
Nguyên t c
Sau khi xác đ nh n ng đ DNA b ng OD nh trên, ti n hành khu ch đ i DNA b ng ph n ng PCR v i c p m i đ c hi u khu ch đ i vùng gen rpb1 [9]
B ng 2.1. Các m i s d ng khu ch đ i gen rpb1. Tên Trình t (5’-3’) Chi u dài Tham kh o M i xuơi CRPB1 CCWGGYTTYATCAAGAARGT 20 [9] M i ng c RPB1Cr CCNGCDATNTCRTTRTCCATRTA 23 [55] ( W: A ho c T; Y: C ho c T; R: A ho c G; D: A, T ho c G; N: A, T, G ho c C.) N u k t qu cho ra v ch s n ph m nh mong đ i ch ng t trong d ch chi t thu đ c cĩ ch a DNA b gen và cĩ th s d ng DNA thu nh n này cho các b c th c nghi m ti p theo.
Các b c ti n hành
Ph n ng PCR đ c ti n hành trong th tích 15 l v i m i CRPB1/RPB1Cr v i thành ph n và chu k nhi t th hi n trong b ng 2.2 và hình 2.1
B ng 2.2. Các thành ph n trong ph n ng PCR Thành ph n Th tích (µl) Master mix 7,5 M i xuơi (10 M) 0,5 M i ng c (10 M) 0,5 DNA (ng/l) 1 H2O 5,5 T ng 15
26
Hình 2.1. Các thơng s thi t l p chu k nhi t cho ph n ng PCR khu ch đ i gen rpb1.
X là nhi t đ m i b t c p lên m ch khuơn
X1=53oC, X2= 46,3oC (X1, X2 l nl t là nhi t đ tr c và sau khi t i u) 2.2.2.4. Ph ng pháp đi n di
Nguyên t c
Các acid nucleic là các đ i phân t tích đi n âm, trong đi n tr ng các phân t DNA s di chuy n v phía c c d ng c a đi n tr ng. T c đ di chuy n ph thu c vào kh i l ng và c u trúc c a phân t DNA. Các acid nucleic trong gel agarose s đ c ghi l i d i tia t ngo i (UV) nh ethidium bromide. Ch t này cĩ kh n ng g n xen vào gi a các baz c a acid nucleic và phát quang d i tác d ng c a tia t ngo i ( =300 nm). Kích th c c a các acid nucleic s đ c xác
đnh khi so sánh v i kích th c đã bi t tr c c a thang chu n.
Các b c ti n hành
Hút kho ng 5 l s n ph m PCR ho c l ng DNA b gen v a đ sau tách chi t và ch y đi n di v i gel agarose 1,5 %, dung d ch TBE hi u đi n th 70 V trong 50 phút.
27