Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ phân tử vùng gen nrSSU

B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP.HCM   BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: H TR NH DANH CÁC LOÀI NM THUC CHI NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN PHÂN TÍCH PH H PHÂN T VÙNG GEN nrSSU KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy ThS. Lao c Thun SVTH: Trng Th Bch Vân MSSV: 1053010938 Khóa: 2010 - 2014 Tp. H Chí Minh, tháng 05, nm 2014 i LI CM N Li đu tiên, tôi xin gi li cám n chơn thƠnh nht đn nhng ngi thy, nhng ngi bn đƣ luôn  bên, truyn cho tôi nim đam mê nghiên cu khoa hc và cho tôi nhng li khuyên b ích đ tôi có th vng bc hn trên con đng mà mình đang bc đi. Tôi xin gi li tri ân sâu sc đn cô PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy và ThS. Lao c Thun đƣ tn tình hng dn, giúp đ, truyn đt kinh nghim và kin thc quý báu trong sut thi gian ph vic ti phòng thí nghim Sinh hc phân t đ hoàn thành tt khóa lun tt nghip này. Cm n các bn ph vic trong phòng thí nghim Sinh hc phân t trng H M Tp.HCM đƣ nhit tình giúp đ, đng viên tôi nhng lúc khó khn trong thi gian thc hin khóa lun tt nghip. Tôi cng xin gi li cám n đn quý thy cô tham gia ging dy khóa 2010 khoa Công ngh sinh hc đƣ giúp em trau di kin thc, to nn tng vng chc đ em thc hin đ tƠi cng nh kinh nghim làm vic sau này. Và trên ht, con xin gi li cm n đn cha m, nhng ngi đƣ có công sinh thƠnh, dng dc con, luôn to mi điu kin tt nht, luôn yêu thng vƠ ng h con trên con đng mình đƣ chn. Bình Dng, ngƠy 22 tháng 05 nm 2014 Trng Th Bch Vân ii DANH MC BNG Bng 2.1. Trình t các mi s dng trong phn ng PCR B nrSSU Bng 3.1 vùng gen nrSSU Bng 3.2. Thông tin 62 trình t tham chiu dùng đ xây dng d liu vùng trình t nrSSU Bng 3.3. Kt qu kim tra DNA bng quang ph k kho sát trên 3 mu nm ký sinh côn trùng đc tách chit theo phng pháp Phenol:Chloroform Bng 3.4. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph các mu nm tách chit có b sung -mercaptoethanol Bng 3.5. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph k các mu nm tách chit có b sung -mercaptoethanol B t lp chu k nhit PCR khuch đi các vùng gen nrSSU ca các mu nm ký sinh côn trùng Bng 3.7. Bng hiu chnh các nucleotide ti các v trí (i) đn (xi) Bng 3.8. Tng hp kt qu hiu chnh trình t các mu nm ký sinh côn trùng Bng 3.9. Kt qu chiu dài các trình t trc và sau hiu chnh Bng 3.10. Kt qu so sánh trình t nrSSU đƣ hiu chnh vi các trình t trên GenBank B iii DANH MC HÌNH Hình 1.1. Cordyceps sinensis Hình 1.2. Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA nrSSU Hình 3.1. Kt qu Annhyb cp mi NS1/NS4 vi trình t gen nrSSU Hình 3.2. Kt qu BLAST cp mi NS1/NS4 khuch đi vùng gen nrSSU Hình 3.3. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Neighbor Joining vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) Hình 3.4. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum Parsimony vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) Hình 3.5. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum Likelihood vi b d liu 62 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) Hình 3.6. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4 tách chit theo phng pháp Phenol:Chloroform Hình 3.7. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4 tách chit theo phng pháp Phenol:Chloroform b sung -mercaptoethanol Hình 3.8. Kt qu đin di sn phm cp mi NS1/NS4, có b sung -mercaptoethanol, và ti u hóa nhit đ Hình 3.9. Vùng tín hiu nhiu  đu hai mch ca SSU iv Hình 3.10. Hiu chnh vùng tín hiu b nhiu  mt mch ca SSU Hình 3.11. Hiu chnh  vùng gia trên hai mch SSU Hình 3.12. V trí sai lch ca hai kt qu gii trình t  đu mch xuôi ca nrSSU Hình 3.13. Hình kt qu BLAST trình t nrSSU mch xuôi đƣ hiu chnh Hình 3.14. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot Plot Hình 3.15. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Neighbor Joining vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) Hình 3.16. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum Parsimony vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) Hình 3.17. Cây ph h phân t đc xây dng bng phng pháp Maximum Likelihood vi b d liu 68 trình t (Các con s hin th trên cây là giá tr bootstrap ca 1000 ln lp li) v MC LC T VN  ……………………………………………………………… 1 PHN I - TNG QUAN TÀI LIU 1.1. 3 1.1.1. 3 1.1.2. 5 1.2. 8 1.2.1. 8 1.2.2. 9 1.2.3. Nhóm gen gi nhà (house-keeping gene) trong đnh danh phân t m 10 1.3. 13 1.4. 14 1.4.1. 14 1.4.2. Nhng b 14 1.5. 19 1.5.1. 19 1.5.2.  20 PHN 2 - VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CÚU 2.1. 21 2.2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 21 2.2.1. 21 2.2.2. D ậ ậ 21 2.2.3. 23 2.2.4. Tin trình nghiên cu 24 2.2.5. Hiu chnh trình t 27 2.2.6. 28 2.2.7.  28 2.2.8. 28 vi 2.2.9. 29 PHN 3 - KT QU VÀ THO LUN 3.1. KT QU ÁNH GIÁ MI 30 3.1.1. ánh giá mi trên IDT 30 3.1.2. Kt qu kim tra Annhyb cp mi NS1/NS4 trên trình t gen nrSSU31 3.1.3. ánh giá mi bng BLAST trên NCBI 31 3.2. C S D LIU CC B TRÌNH T nrSSU NHÓM NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 32 3.3. nrSSU U N 42 3.4. KT QU HIU CHNH TRÌNH T 47 3.5. KT QU SO SÁNH VI C S D LIU GENBANK 53 3.6. KT QU XÂY DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 54 PHN 4 - KT LUN VÀ  NGH 4.1. KT LUN 61 4.1.1. V lý thuyt 61 4.1.2. V thc nghim 61 4.2.  NGH 61 TÀI LIU THAM KHO………………………………………………… 62 Khóa lun tt nghip SVTH: Trng Th Bch Vân 1 T VN  ông trùng h tho (Cordyceps sinensis) lƠ mt loƠi nm ký sinh trên côn trùng, t lơu đƣ đc s dng trong các bƠi thuc c truyn ca nhiu quc gia chơu Á bao gm Vit Nam. Gn đơy, nhiu nghiên cu cho thy không ch Cordyceps sinensis mà còn nhiu loƠi khác trong nhóm nm nƠy có tim nng ng dng trong y dc rt ln, bao gm các chi nm Cordyceps, Isaria, Paecilomyces… Nhng nghiên cu v các hot cht ca nhóm nm nƠy cho thy chúng có kh nng cha tr hiu qu nhiu bnh khác nhau, đin hình nh kh nng điu hoƠ đáp ng min dch ca C. sinensis, C. cicadae (Weng et al., 2002) hay c ch các t bào khi u ca C. sinensis, C. cicadae (Weng et al., 2002), C. ophioglossoides n nay, hn 400 loƠi Cordyceps đƣ đc phát hin và xp vào h Clavicipitaceae, da trên cu trúc th sinh sn, bào t và qu th Tuy nhiên, hiu bit v thành phn loài ca chi nm này còn rt hn ch bi nhiu nguyên nhơn trong đó phi k đn lƠ các khó khn gp phi trong công tác phân loi, đnh danh. Vì vy, mc dù các nhà nm hc đƣ mt nhiu nm nghiên cu, tuy nhiên nhng công b v thành phn loài chi nm này vn cha tht s hp lý và còn nhiu mâu thun, đc bit khi xem xét nhng bin đi di truyn nh hng bi nhng vùng đa lý khác nhau hay mi liên h gia th vô tính (anamorph) và th hu tính (teleomorph) ca chúng. Nguyên nhân dn đn nhng khó khn nƠy lƠ do kh nng bin đi rt cao ca các loài nm bi nh hng ca điu kin môi trng. Trong nhng nm gn đơy, các nghi ng trên đƣ đc gii quyt hiu qu nh s đóng góp tích cc ca sinh hc phân t. Vi hng tip cn này, trình t nrSSU (nuclear ribosomal small subunit ậ tiu đn v nh ca ribosome) thuc vùng bo tn 18S rRNA, đc s dng đ phân tích s phát sinh loài và s đa dng di truyn ca sinh vt. Nghiên cu phát sinh loài gn đơy da trên nhiu locus đc lp cung cp mt mc đ tin cy ln hn giúp xác đnh danh pháp các loài nm kí sinh côn trùng.  Vit Nam, hiu bit v thƠnh phn loƠi ca Cordyceps còn rt hn ch, các nghiên cu vn cha đc quan tơm nhiu vƠ gn nh cha có mt b su tp hoƠn Khóa lun tt nghip SVTH: Trng Th Bch Vân 2 chnh nƠo đc công b v chi nm nƠy trong nc. Bên cnh đó, nhiu sn phm t Cordyceps đc bán trên th trng có ngun gc không rõ rƠng, ch yu đc nhp t nc ngoƠi. Vi mt chi nm có nhiu ng dng rng rƣi trong y dc, vic su tp vƠ phơn lp các ging thun, khai thác thông tin khoa hc v các loƠi nm nƠy lƠ mt vic lƠm cn thit. Khi có đc nhng hiu bit đy đ v thƠnh phn loƠi, s to điu kin cho vic khai thác vƠ nuôi trng ni đa ngun dc liu quý nƠy, góp phn lƠm gim giá thƠnh, hn ch s nhp ngoi các sn phm Cordyceps không rõ ngun gc. Hn na, vic có đc nhng thông tin khoa hc đy đ v các loƠi nm nƠy s lƠ c s cho các nghiên cu ng dng Cordyceps  Vit Nam. Trong gii hn đ tƠi, tôi tin hƠnh tip cn vùng gen nrSSU vƠ xơy dng c s d liu vùng gen nrSSU, tip đn tin hƠnh thc nghim xơy dng quy trình tách chit DNA t h si nm, ti u hóa quy trình PCR đ khuch đi vùng gen mc tiêu nrSSU, gii trình t, xơy dng vƠ so sánh các cơy ph h phơn t t c s d liu trình t thu thp đc. 1 PHN 1 ậ TNG QUAN TÀI LIU [...]... [31] n trùng Ngoài ti trong ki m soát sinh h ng d c ng d ng m ký sinh trên côn trùng, Cordyceps tr thành ch c a các loài côn trùng gây h i Vì v y nhi c s d ng r ng rãi 7 tron u tranh sinh h c ki m soát d ch b bi n là các loài Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi Theo McCoy (1990) [29], các tiêu chí quan tr các loài n m côn trùng có th sinh h c bao g m kh r ng, có tính c cho ký. .. 20 [47] s d li u trình t nrSSU nhóm n m ký sinh côn trùng Các trình t cs d phân tích cây phát sinh loài bao g m 62 trình t tham kh o trên GenBank v i mã s truy c p trình t l y t công trình nghiên c u c a Sung et al.,2007 [37] M u d dàng nh n ra là t t c các trình t làm tham chi u u có ngu n g c rõ ràng: bài báo công b , v i mã s truy c p trình t trên GenBank và nh t là tên loài c a m c cung c p r c... i) c qu th i s phát tri a sinh h c phân t c 1.2.2 nh danh phân t i sinh v t m phân t d a trên so sánh trình t nucleotide và axit amin c a các phân t DNA, RNA, protein Trong nghiên c nh danh phân t , vi c l a ch n vùng trình t DNA, RNA, protein 9 kh o sát gi a các loài là m t n cao trong cùng m c quan tr ng, trình t này c m b o tính b o ng l n gi iv danh m t s loài thì vùng gen gi nhà (house- nh c s... n trong nhi nh danh phân t h thành ngành khoa n trong phân lo i h c, b sung trong phân lo i h c truy n th ng nh ng um hd 1.2.3 Nhóm gen gi nhà (house-keeping gene) trong nh danh phân t n m - nh danh phân t n - ng vùng trình t b ot i v i nhóm Cordyceps, vùng gen (SSU nrDNA, LSU bi nghiên c u phát sinh loài trong nh c s d ng ph [34] Tuy nhiên, c xây d ng d a trên d li u c a nh ng vùng gen mã hóa rRNA... song l i r phân lo i [17] 1.2.3.2 nrSSU [56] 12 Gen nrSSU ng trong vi hình thành ti u ph n nh c nrSSU nrSSU là vùng trình t có tính b o t n cao v n có các vùng bi sánh trình t c thu nh n trình t c n phân tích, vùng nrSSU có th m i nà ng nh cho phép các nhà khoa h c so c trình t b ng m t c p m i ph quát (universal primer) Các c p c thi t k d a trên các trình t nucleotide b o t [47] 1.3 Vi t Nam, các nghiên... Cordyceps là m t chi n m ký sinh trên côn trùng thu c h Clavicipitaceae, b Hypocreales, l p Pyrenomycetes, ngành n m túi Ascomycota [20] Chi Cordyceps xu t phát t ti m hình d ng trong t nhiên c a n m có hình gi u có d ng m n i b t c a n m ký sinh côn trùng là nh ng giá tr quý hi m, s ng ký sinh trên u trùng c a các loài sâu thu c bi t là Thitarodes armoricanus; Thitarodes baimaensis) có tên g Trùng H Th... soát châu ch u nghiên c c s d ng n m ký sinh côn trùng phòng tr các lo i côn trùng và sâu h i cây tr Beauveria bassiana Châu Phi T i Vi t Nam, nhi u m Metarhizium anisopliae và c ng d ng trong phòng tr m i nhà [2], sâu khoang h i c i xanh [8], sâu h u xanh [5], r y m m và các loài sâu h i lúa [6][3] 1.2 danh 1.2.1 ng h th ng h c các loài n m này ch y u d a trên phân tích hình thái gi i ph bao g m: th túi... Cordyceps vùng gene mã hoá cho RNA ribosome (DNA ribosome, c s d ng ph bi nghiên c u trong nhi ây rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa rRNA c a ribosome, có nhi u b n sao và không mã hóa cho b t k tìm ra s ot ng và các khác bi t c a các sinh v t cùng loài hay khác lo ng trong các nghiên c u quá trình ti n hóa, phát sinh loài, phân lo i n ng di truy n c a sinh v do vi c phân lo i n m d lo m m sinh hóa... Clavicipitaceae nh túi dày và các bào t túi d ng s r i thành nhi u bào t th c ng có th ng t x lý các thông tin t vi c phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài thu c v các chi lân c nh lo Cordyceps sensu lato 8 Cordyceps militaris Metarcordyceps youngmunensis (Metarcordyceps taii Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordyceps variabilis c chi n m ký sinh côn trùng có kh u ki ir u tính (d... hóa là c nhìn th ch n cây có t ng chi u dài nh nh t ng cách chính là kho ng cách ti n hóa gi a các c c so sánh V nguyên t ng ng cách c tìm ra m t cây thích h p d a vào ma tr n kho ng cách gen c a các c p trình t Khi t t c các kho ng cách gi a các c p trình t c tính toán và thi t l a hình h c m t c a c xây d ng nh d t bi n Tuy nhiên, t ng cách không ch ng 17 c kho a các gen b i vì m t s v trí nucleotide . H TR NH DANH CÁC LOÀI NM THUC CHI NM KÝ SINH CÔN TRÙNG DA TRÊN PHÂN TÍCH PH H PHÂN T VÙNG GEN nrSSU KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T . quang ph k các mu nm tách chi t có b sung -mercaptoethanol B t lp chu k nhit PCR khuch đi các vùng gen nrSSU ca các mu nm ký sinh côn trùng Bng 3.7. Bng hiu chnh các nucleotide. dng hình chùy. im ni bt ca nm ký sinh côn trùng là nhng giá tr y dc đc đáo vƠ quý him, sng ký sinh trên u trùng ca các loài sâu thuc chi Thitarodes (đc bit là Thitarodes