Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong sản phẩm gà thịt

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Viện CNSH & CNTP - - Báo cáo môn học Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Đề tài: Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol sản phẩm gà thịt Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hợi 20131697 Đinh Thị Nga 20132728 Dương Thị Thanh 20133465 TS Nguyễn Thị Thảo ThS Hoàng Quốc Tuấn Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2017 Mục lục Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi 1.1 Thuốc kháng sinh phép sử dụng 1.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh chăn nuôi 2 Nguyên nhân hậu việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi gà 2.1 Nguyên nhân sử dụng kháng sinh 2.2 Hậu sử dụng kháng sinh tràn lan Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol gà thịt 3.1 Các phương pháp kiểm định 3.2 Phương pháp săc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS 3.3 Quy trình phân tích Kết luận kiến nghị 13 4.1 Kết luận 13 4.2 Kiến nghị 13 Tài liệu tham khảo 14 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 1 Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi 1.1 Thuốc kháng sinh phép sử dụng Các loại thuốc kháng sinh sử dụng chăn nuôi với liều lượng thời gian cách ly cho phép theo QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT Thời gian ngừng sử STT Tên kháng sinh, Hàm luơng tối đa cho dụng thức ăn có kháng hóa dược phép(mg/kg) Amprolium Axit arsanilic BMD(bacitracin methylence-disalicylate ) Gà thịt Gà trứng sinh, hóa dược trước giết mổ(ngày) 50 90 50 25 0 10 11 12 13 14 15 16 Bacitracin zinc 50 25 Chlotertracyline 50 Clopidol 250 Decoquinate 30 Lasalocid sodium 113 Lincomysin Monensin 110 Narasin/nicarbazin 72 Nitarsone 187 Oxytetracyline 50 Roxarsone 50 Salinomycin 60 Sulfadimethoxin and 113 ormetoprim 5:3 17 Tylosin phosphate 50 18 Virginiamycin 19 zoalene 113.5 Bảng 1: Các loại thuốc kháng sinh sử dụng chăn nuôi 1.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh chăn nuôi Trong năm 2015, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn triển khai dự án điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi tỉnh: Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Thái Bình Nam Định Kết triển khai cho thấy 100% sở chăn nuôi có sử dụng kháng sinh phòng điều trị bệnh cho động vật; 68% sở có sử dụng thức ăn chăn nuôi chứa kháng sinh để Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page phòng bệnh kích thích tăng trưởng; 24,4% sở tự trộn kháng sinh vào thức ăn chăn nuôi để phòng bệnh kích thích tăng trưởng, 1,23% số hộ trộn kháng sinh dạng nguyên liệu Theo báo cáo Bộ Y tế, chăn nuôi gà công nghiệp có tượng lạm dụng nhiều loại kháng sinh tổng hợp, số hộ sử dụng thuốc kháng sinh có từ - hoạt chất chiếm 10% trang trại nuôi gà, vịt Tuy nhiên, đến việc sử dụng kháng sinh trồng trọt, chăn nuôi gần bỏ ngỏ; phần từ quản lý lỏng lẻo nhà quản lý, phần từ ý thức người chăn nuôi Thuốc kháng sinh sở chăn nuôi sử dụng có dạng: dạng bột hòa tan( pha với nước cho uống tiêm trực tiếp vào gà) bột không hòa tan( trộn với thức ăn) Các loại kháng sinh sử dụng phổ biến tồn dư gồm chloramphenicol (15,35%), tylosin (15,00%), colistin (13,24%), norfloxacin (10,00%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracyclin (7,95%), ampicillin (7,24%) Mức tồn dư cao so với qui định từ 2,5 lần đến 1.100 lần Trong thương mại: Có nhiều vụ bê bối nhập gà kháng sinh, gà thải loại với giá rẻ (50006000đồng/1kg) bán lại với giá cao (50000-60000 đồng/1kg) , thấp giá gà nuôi nên nhiều người mua sử dụng mà tác hại Gà thải loại để đẻ trứng, vòng đời gà đẻ loại thải thường phải tiêm chích nhiều kháng sinh có đủ sức đề kháng, gà đẻ loại thải tính từ giống phải chích năm loại vắcxin Thời gian để vắcxin hết hiệu lực thể gà đẻ vòng tuần Nếu sớm nguy tồn dư kháng sinh lớn Khi ăn phải gây tác hại hớn đến sức khỏe người tiêu dùng Nguyên nhân hậu việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi gà 2.1 Nguyên nhân sử dụng kháng sinh Do hiệu việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi đem lại: - Điều trị bệnh; - Phòng bệnh mãn tính ngăn chặn xảy dịch bệnh vi trùng; - Dùng chất kích thích sinh trưởng tăng khả hấp thụ thức ăn kìm hãm phát triển vi sinh vật đường ruột; - Nâng cao chất lượng sản phẩm tăng tỷ lệ lạc, giảm mỡ, thịt nở, mềm hơn,… Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 2.2 Hậu sử dụng kháng sinh tràn lan - Sử dụng kháng sinh thường xuyên, sức khỏe vật nuôi giảm dần phụ thuộc nhiều hơn, loại vi khuẩn gây bệnh cho vật nuôi chống chọi lại thuốc làm thuốc tác dụng - Ngày tăng số lượng vi khuẩn , siêu vi khuẩn có khả kháng kháng sinh, gây bệnh, phát sinh dịch bệnh.( phổ biến nhóm vi khuẩn gram âm đường ruột E.Coli) - Nếu thuốc kháng sinh dùng cho vật nuôi chưa đủ thời gian cách ly, dùng nhiều đưa vào sử dụng có tượng tồn dư nguyên liệu thịt, vào thể người tiêu dùng dẫn đến nguy kháng thuốc kháng sinh người, làm giảm hiệu quả, tang thời gian điều trị bênh người Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol gà thịt 3.1 Các phương pháp kiểm định Trong chăn nuôi người nuôi sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh để tăng sức khỏe chất lượng cảm quan gà Do có phổ kháng khuẩn rộng khả phân bố tốt vào mô thể nên nhóm phenicol dùng phổ biến Tuy nhiên, từ phát độc tính chloramphenicol (CAP) lên quan tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi suy tủy, gây tử vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu cấm sử dụng CAP thú y (EU, 1990; Bộ NN&PTNT, 2009a) Có nhiều phương pháp sử dụng để phát dư lượng chất kháng sinh vật nuôi như: - Phương pháp miễn dịch enzyme (ELISA) - Phương pháp vi sinh vật, - Phương pháp sắc lý lỏng cao áp HPLC - Phương pháp sắc ký khối phổ - Phương pháp sắc ký miễn dịch,… Phương pháp ELISA, vi sinh vật thích hợp để sàng lọc Do ưu điểm kiểm tra tương đối nhạy nhanh, đơn giản, phổ phát rộng(pp vi sinh vật), nhiên phương pháp elisa có tính đặc hiệu cao với nhóm kháng sinh nên nhiều gây bất lợi, không phát chất cấm, phương pháp vi sinh vật đơn giản, rẻ tiến hành thời gian dài, phụ thuộc vào chủng vi sinh vật sử dụng, số chất không phát Các phương pháp lý hóa phù hợp để nhận diện rõ ràng, định lượng, thích hợp cho khẳng định ưu điểm khả phát chất có dư lượng nhỏ, Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page nhạy phức tạp, thiết bị đắt tiền, kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao Phương pháp có độ nhạy với giới hạn phát thấp chất cấm, có độ tin cậy cao, kết dương tính giả âm tính giả Phương pháp ý nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS có khả phân biệt, nhận diện chất cao, thiết bị đại nên giảm nguy sai sót tiềm tàng 3.2 Phương pháp săc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ kỹ thuật phân tích kết hợp sắc ký khối phổ Sau chất tách khỏi nhờ sắc ký lỏng phân tích khối phổ để có thêm thông tin khối lượng cấu trúc phân tử hợp chất Cơ sở lý thuyết phương pháp: Hình 1: Mô hình hệ thống LC-MS/MS Sắc ký trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn pha động chất lỏng Mẫu phân tích chuyển lên cột tách dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, chất phân tích phân bố liên tục pha động pha tĩnh Trong hỗn hợp chất phân tích, cấu trúc phân tử tính chất lí hoá chất khác nhau, nên khả tương tác chúng với pha tĩnh pha động khác Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi Khối phổ thiết bị phân tích dựa sở xác định khối lượng phân tử hợp chất hóa học việc phân tách ion phân tử theo tỉ số khối lượng điện tích (m/z) chúng Các ion tạo cách thêm hay bớt điện tích chúng loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành tách theo tỉ số m/z phát Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page Sơ đồ cấu trúc máy khối phổ MS Tránh ion phân tích va chạm với ion không khí Nguồn ion Phân tích khối Phổ khối Detector Xử lý lưu liệu Hình 2: Sơ đồ cấu trúc phân tích khối - Nguồn ion: Chất phân tích sau khỏi cột tách dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng ion hóa nguyên tử; - Bộ phận phân tích khối: Có nhiệm vụ phân tách ion có trị số m/z khác thành phần riệng biệt; - Bộ phận phát hiện: Sau khỏi thiết bị phân tích khối lượng, ion đưa tới phần cuối thiết bị khối phổ phận phát ion, tạo tín hiệu ion tương ứng từ electron thứ cấp khuếch đại tạo dòng điện tích di chuyển Hệ thống thu nhận tín hiệu đưa kết phân tích(nhờ dòng electoron dòng photon tạo ra) 3.3 Quy trình phân tích Quy trình phân tích: Chọn điều kiện thực nghiệm: cần tìm điều kiện thực nghiệm cho xử lý, phân tích mẫu phù hợp tiến hành quy trình phân tích - Điều kiện phân tích CAP, FF, TAP máy LC-MS/MS Khảo sát tìm ion mẹ, ion định tính định lượng chất; tìm điều kiện tối ưu MS: +) Lựa chọn kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm(dựa theo nghiên cứu khác (Nguyễn Minh Đức, 2006; Nguyễn Văn Ri, 2009; Zhao and Carol, 2004) chất có khối lượng phân tử trung bình), Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page +) Dùng xilanh 500µl bơm chuẩn CAP, FF, TAP 10ng/ml vào detector để khảo sát +) Chọn chế độ khảo sát tự động đới với chất, tối ưu hóa ion mẹ  Kết quả: Điều kiện chạy nguồn ESI tối ưu để chạy khối phổ: Chú thích: DP: phân nhóm, CE: lượng va chạm, CXP: điện sau va chạm Các thông số tối ưu: Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page - Điều kiện xử lý mẫu: Căn vào độ phân cực số đặc điểm hóa học nhóm phenicol, hợp chất lựa chọn làm dung môi chiết ban đầu etylaxetat, axeton, axetonitril  Kết quả: Etylaxetat tách chiết hiệu cho độ thu hồi cao nhất( có độ phân cực trung bình, có độ chọn lọc với dung môi hòa tan cao axeton axetonitril) Tuy nhiên chiết chất có độ phân cực tương đượng chất màu, lipit,… nên tiếp tục tiến hành hòa tan cặn CH3COONH4 4% loại bỏ chất béo n-hexan Tách làm giàu chất cần phân tích: chọn khảo sát loại cột chiết cột C18(không phân cực) cột floresil(độ phân cực thấp)  Kết quả: Cột C18 làm tinh khiết làm chất cần phân tích vượt trội hơn, thể tích methanol dung cho bước rửa giải tối ưu 3ml - Điều kiện sắc ký: Các chất nhóm phenicol có độ phân cực trung bình, hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị dung môi phân cực phân cực vừa methanol, axetolnitril, nước, axit formic, amoniaxetat, … lựa chọn cột phân tách Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page pha đảo Sử dụng cột Symestry Shield C18 Water (150mm x 4,6mm x 5mm) tiền cột Symestry C18 Water (20mm x 3,9mm x 5mm) Thực khảo sát điều kiện tối ưu: Pha động: Hệ pha động kênh A axit axetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% nước, nước; kênh B methanol axetonitril Tỉ lệ pha động khảo sát theo hai chế độ: cố định tỉ lệ hai kênh pha động chế độ gradient quét từ 10% đến 100% kênh A thể tích theo thời gian  Kết quả: Hình ảnh pic sắc đồ ổn định, tách rõ ràng, pic nhọn cho tín hiệu tốt với hệ pha động kênh A CH3COOH 0.1%, kênh B methanol Chương trình gradient tối ưu: Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page QUY TRÌNH PHÂN TÍCH (1) Lấy mẫu: - Đối tượng mẫu: mẫu gà thịt muốn phân tích - Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên - Khối lượng mẫu lấy: 100 – 500 g/mẫu - Bảo quản: nhiệt độ thường - Mẫu đảm bảo độ đồng theo yêu cầu: Dùng máy đồng mẫu để đồng khoảng 500g mẫu tới cỡ hạt khoảng 1-2 mm (2), (3) Xử lý phân tích mẫu: Sau mẫu đồng lựa chọn dung môi khảo sát, tiến hành cân 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml, chất chuẩn, sau thêm 20ml dung môi, vortex lắc khoảng phút Tiếp theo đem ly tâm 6.000v/phút phút, gạn thu dịch chiết sang ống ly tâm khác Chiết lặp lại lần với 10ml dung môi Gộp dịch chiết hai lần cho vào bình cô quay 100ml, cô quay tới cạn 40°C Do đối tượng mẫu khảo sát thường có hàm lượng chất màu, lipit sau bước làm giàu sơ cao nên trước nạp mẫu qua cột chiết pha rắn ta tiến hành hòa tan cặn lại dung dịch CH3COONH4 4%, chất béo chiết 10ml n-hexan, lặp lại hai lần với dung dịch thu Quá trình chiết pha rắn tiến hành cột chiết C18 với dung môi hoạt hóa rửa giải H2O methanol Sau mẫu đưa vào phân tích hệ thống LC-MS/MS để máy tự động phân tích ghi nhận kết từ đồ thị thu sau máy phân tích Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 10 (4)Kết quả: kết thu ghi tín hiệu hệ thống LC-MS/MS dạng đồ thị khối phổ Dựa vào sắc ký đồ ta định tính định lượng hàm lượng kháng sinh mẫu Định tính chất xuất pic đồ thị, hàm lượng chất đo diện tích pic Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 11 *Nhận xét hiệu phương pháp LC-MS/MS: - Khoảng tuyến tính khả phát phương pháp: CAP FF TAP Khoảng tuyến tính 0.5-3 ng/g 5-300 ng/g 2-200ng/g Hệ số tuyến tính 0.9994 0.9973 0.953 Giới hạn phát 0.009ng/g 0.003ng/g 0.2ng/g Giới hạn định lượng 0.03ng/g 0.1ng/g 0.3ng/g => Khoảng tuyến tính rõ rệt giới hạn phát thấp - Độ lặp lại hiệu suất thu hồi phương pháp: Hiệu suất thu hồi >83% Độ lệch chuẩn