thực hành kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐÀ NẴNG KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG BÀI GIẢNG THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM AN TOÀN LƢƠNG THỰC THỰC PHẨM Biên soạn: ThS Nguyễn Thị Bích Hằng ĐÀ NẴNG, NĂM 2017 MỞ ĐẦU Mục tiêu: Qua phần thực hành, sinh viên nắm số thao tác, kỹ phân tích định tính định lượng chất độc hại có thực phẩm Nội dung giảng Bài giảng “Thực hành Kiểm nghiệm an toàn lương thực thực phẩm” dành cho sinh viên năm thứ ba khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Với thời lượng 30 – 60 tiết tuỳ thuộc điều kiện, sở vật chất phòng thí nghiệm cho phép, bao gồm thực hành với nội dung học phần lý thuyết kiểm nghiệm an toàn lương thực – thực phẩm Đánh giá cảm quan thực phẩm Đánh giá kim loại nặng thực phẩm Phát nhanh phẩm màu độc không độc Định tính định lượng hàn the thực phẩm Xác định nitrit nitrat rau phương pháp so màu Xác định hàm lượng metanol đồ uống có cồn Kiểm nghiệm vi sinh vật gây hại thực phẩm Yêu cầu: - Nghiêm túc thực nội quy phòng thí nghiệm - Đọc kỹ tài liệu trước thực tập phòng thí nghiệm - Làm theo hướng dẫn CBGD - Pha số hoá chất đơn giản, không độc hại BÀI 1: ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHO ĐIỂM, PHÉP THỬ 2-3 VÀ PHÉP THỬ TAM GIÁC Mục đích - Củng cố lại kiến thức học thực hành cảm đánh giá cảm quan - Xây dựng, bố trí thí nghiệm đánh giá cảm quan - Đánh giá xử lý số liệu thu từ đưa nhận xét kết thu từ đánh giá - Củng cố lại kiến thức thống kê Dụng cụ mẫu thí nghiệm 2.1 Dụng cụ - Cốc nhựa - Phiếu đánh giá - Tem đánh số mẫu 2.2 Mẫu - Thí nghiệm 1: mẫu lại coffee mã hóa (539, 235, 416) - Thí nghiệm 2: mẫu nước mã hóa (237, 234, mẫu kiểm chứng R) - Thí nghiệm 3: mẫu sữa (so sánh độ ngọt) mã hóa (237, 234) Thực hành thí nghiệm 3.1 THÍ NGHIỆM 1: Đánh giá thị hiếu ba mẫu coffee phép thử cho điểm 3.1.1 Nguyên tắc - Người thử sử dụng thang điểm để đánh giá cường độ cảm giác Thang đoạn thẳng giới hạn hai đầu mút từ khóa : “rất yếu” “rất mạnh” Người thử phải thể cảm nhận họ cách vạch vào vị trí thang (thang không cấu trúc) Ngoài loại thang này, sử dụng loại thang cấu tạo thành từ dãy số (thang có cấu trúc) điểm Cường độ cảm nhận thấp tương ứng với giá trị bé thang, ngược lại chúng có cường độ mạnh 3.1.2 Quy trình thực Mẫu chuẩn bị mã hóa theo số ký hiệu (539, 235, 416) - B1: Hiểu nguyên tắc phép thử B2: Mỗi sinh viên nhận mẫu thực phẩm gắn mã số gồm chữ số (539, 235, 416) B3: Nếm thử đánh giá mức độ ưu thích mẫu vào phiếu đánh giá PHIẾU ĐÁNH GIÁ PHÉP THỬ CHO ĐIỂM THỊ HIẾU Họ tên người thử: Ngày thử: - Mức độ ưa thích anh/chị mẫu có mã số là: - Mức độ ưa thích anh/chị mẫu có mã số là: - Mức độ ưa thích anh/chị mẫu có mã số 1 Trong : Rất ghét Hơi thích Ghét Thích Hơi ghét Rất thích Không thích không ghét B4: Thu nhập kết xử lý số liệu B4: Thu nhập kết xử lý số liệu B5: Đánh giá báo cáo kết 3.2 THÍ NGHIỆM 2: So sánh hai mẫu với mẫu đối chứng thứ ba phép thử 2-3 3.2.1 Nguyên tắc - Là phép thử gồm mẫu có mẫu giống Một mẫu giống mẫu kiểm chứng Người thử mời xác định xem hai mẫu lại, mẫu giống mẫu kiểm chứng 3.2.2 Cách tiến hành B1: Hiểu cách thực phép thử 2-3 B2: Thử mẫu R B3: Thử mẫu lại (mẫu 237 234) đánh giá mẫu giống mẫu R vào phiếu trả lời PHIẾU TRẢ LỜI PHÉP THỬ 2-3 Họ tên người thử……………………………………………Ngày thử: 12/04/2016 Bạn nhận mẫu thực phẩm kí hiệu R mẫu khác, mẫu có mẫu giống với mẫu R Trước tiên nếm mẫu R sau nếm mẫu lại theo thứ tự từ trái qua phải ghi lại mã số mẫu mà bạn cho giống với mẫu R Chú ý sử dụng nước sau lần thử Trả lời: Tôi nhận thấy: ……………………………………………………………… Lần thử Mẫu giống với mẫu kiểm chứng 1, ,3 Nhận xét: ……………………………………… B4: Tổng hợp kết B5: Xử lý kết báo cáo 3.3 THÍ NGHIỆM 3: So sánh hai mẫu 237 273 mẫu phép thử so cặp 3.3.1 Nguyên tắc - Là phép thử gồm mẫu, người thử mời trả lời, liệu có khác hai mẫu A B tính chất cảm quan không? Nếu có, mẫu (ngọt, chua, thơm…) ? 3.3.2 Cách tiến hành B1: Hiểu cách thực phép so sánh cặp đôi B2: Thử mẫu mã hóa (237 234) đánh giá vào phiếu đánh giá PHIẾU TRẢ LỜI PHÉP THỬ SO CẶP Họ tên người thử……………………………………………Ngày thử: 12/04/2016 Bạn nhận mẫu cafe có kí hiệu 234 237 Bạn nếm từ trái qua phải xem mẫu đắng hơn? Chú ý sử dụng nước sau lần thử Trả lời: Tôi nhận thấy: ……………………………………………………………… Không nhận thấy Nhận thấy Rõ ràng Nhận xét: ………………………………………… B4: Tổng hợp kết B5: Xử lý kết báo cáo BÀI 2: ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG KIM LOẠI NẶNG TRONG THỰC PHẦM BẰNG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (AAS) Mục đích - Biết phương pháp đánh giá kim loại nặng thực phẩm - Thực hành đánh giá kim loại nặng phương pháp hấp thụ nguyên tử - Sử dụng máy công phá mẫu máy hấp phụ nguyên tử - Khảo sát đường chuẩn kim loại nặng (pb Cd) đồng thời tính hàm lượng kim loại nặng mẫu thực phẩm Phương pháp hấp phụ nguyên tử Atomic Absorption Spectrometry (AAS) 2.1 - Định nghĩa Phổ hấp thu nguyên tử (AAS) trình phân tích phổ để phát định tính xác định định lượng nguyên tố gây hấp thu xạ từ hệ thống quang nguyên tử trạng thái khí 2.2 - Nguyên lý Dựa hấp thu nguyên tử Người ta cho chiếu vào đám nguyên tử lượng xạ đặc trưng riêng nguyên tử Sau đo cường độ lại xạ đặc trưng sau bị đám nguyên tử hấp thụ, tính nồng độ nguyên tố có mẫu đem phân tích 2.3 Cấu tạo máy AAS Hình 2.1 Máy AAS - Nguồn phát tia xạ cộng hưởng nguyên tố cần phân tích: thường đèn sau  Đèn cathod rỗng HCL (Hollow Cathode Lamp) Hình 2.2 Sơ đồ đèn cathod  Ưu điểm: Rẻ tiền, nguồn điện bao gồm máy  Nhược điểm: Giới hạn cường độ số nguyên tố  Đèn phóng điện không cực EDL (Electronic Discharge Lamp) Hình 2.3 Đèn EDL Cường độ tốt cho nguyên tố As, Se, P …  Cải thiện giới hạn phát  Đòi hỏi nguồn cấp đặc biệt  Cần 30p để làm ấm  Đèn catot cường độ cao super lamp (S-HCL) Đèn Super lamps đèn catot sử dụng dòng điện bổ sung để tăng cường độ đèn Ưu điểm  Độ khuếch đai thấp  Độ hấp thu cao  Độ nhạy tốt  Thời gian sử dụng lâu  Cường độ sáng cao Nhược điểm  Đòi hỏi thời gian làm ấm  Có thể yêu cầu nguồn riêng - Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích, có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu:  Kỹ thuật nguyên tử hóa lửa, sử dụng khí C2H2 không khí nén oxit nitơ (N2O), gọi Flame AAS  Kỹ thuật nguyên tử hóa không lửa, sử dụng lò đố điện, gọi ETA-AAS (Electro -Thermal-Atomization AAS)  Quá trình nguyên tử hóa lửa Hình 2.4 Quy trình nguyên tử hóa lửa Quá trình nguyên tử hóa lửa gồm hai bước B1: chuyển dung dịch mẫu phân tích thành thể hạt nhỏ sương mù trộn với khí mang khí cháy Quá trình gọi trình aerosol hóa hay nebulize hóa B2: dẫn hỗn hợp aerosol hỗn hợp khí đốt vào đèn để nguyên tử hóa Hệ thống gọi Nebulizer system, gồm hai phần chính:  Đèn để nguyên tử hóa mẫu (burner head)  Buồng aerosol (Aerosol hóa mẫu theo kỹ thuật pneumatic-mao dẫn: Kỹ thuật người ta dung hệ thống Nebulize khí mang để tạo thể sol khí mẫu phân tích nhờ tượng mao dẫn Trước hết nhờ ống mao dẫn S dòng khí mang K mà dung dịch mẫu dẫn vào buồng aerosol hóa Trong buồng này, dung dịch mẫu đánh tung thành thể bụi nhờ bi E cánh quạt Q, trộn với hỗn hợp khí đốt dẫn lên đèn nguyên tử hóa) - Bộ đơn sắc có nhiệm tách bước sóng chọn từ bước sóng phát xạ khác từ dãy phát xạ rộng nguyên tủ hóa  Nguyên tắc làm việc Khi đèn làm việc, catot nung đỏ, catot anot xảy phóng điện liên tục Do phóng điện mà số phân tử khí bị ion hóa Các ion vừa sinh công vào catot làm bề mặt catot nóng đỏ số nguyên tử kim loại bề mặt catot bị hóa trở thành nguyên tử kim loại tự Khi tác dụng nhiệt độ đèn HCl đốt nóng đỏ, nguyên tử kim loại bị kích thích phát phổ phát xạ Đó phổ vạch kim loại làm catot rỗng Nhưng điều kiện làm việc đặc biệt môi trường khí trơ có áp suất thấp, nên phổ phát xạ bao gồm vạch nhạy kim loại 2.4 - Hệ điện tử/ máy tính để điều khiển xử lý số liệu Ưu nhược điểm Ưu điểm  Độ xác máy AAS cao: RSD < 2%  Độ lặp lại tốt: RSD < 1%  Độ nhạy: nhạy, đo dược hàm lượng tới ppb (microgam/ kg)  Chi phí đầu tư thấp so với máy ICP-OES  Phân tích nhiều nguyên tố thời gian phân tích nhanh - Nhược điểm  Giá thành đắt đỏ  Thiết bị bảo dưỡng khó khăn  Thời gian khởi động lau  Hóa chất thực phải tính khiết  Không xử lý mẫu nồng độ ngưỡng 2.5 Ứng dụng - Nông nghiệp  Xác đinh kim loại phân bón, thức ăn, trồng, nước, đất  Cu, Zn, Mn thức ăn chăn nuôi  Ni Cd phân bón  Fe nguyên liệu cho phân bón  Na, K, Ca Mg thức ăn động vật - Công nghiệp A: Số mg acid boric 10ml dung dịch ống chuẩn có màu ống thử 5: Lượng mẫu thực phẩm tương ứng với 10ml dịch chiết dùng cho thử nghiệm BÀI 5: TCVN 8742:2011 CÂY TRỒNG– XÁC ĐỊNH NITRAT VÀ NITRIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO MÀU - Plant – Determination of nitrate and nitrite by colorimetric method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng nitrat nitrit tổng số mẫu thực vật tươi phương pháp quang phổ Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696 - 1987), Nước dùng cho phân tích phòng thí nghiệm- Yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử TCVN 8551:2010, Cây trồng - Nguyên tắc chung lấy mẫu chuẩn bị mẫu để xác định số nguyên tố Nguyên tắc Hòa tan (chiết xuất) nhanh NO3- NO2- mẫu trồng tươi môi trường nước lượng vi sóng Đo mầu vàng đặc trưng dung dịch có độ hấp thụ quang cực đại bước sóng 410 nm, hình thành dung dịch NO3- tác dụng với thuốc thử axit phenoldisulfonic tạo thành nitrophenoldisulfonic môi trường kiềm Đo mầu hồng dung dịch có độ hấp thụ quang cực đại bước sóng 520 nm, hình thành dung dịch NO2- tác dụng với thuốc thử axit sulfanilic αnaphtylamin môi trường axit H a chất v thuốc thử Hoá chất sử dụng để pha chất chuẩn đạt loại tinh khiết hoá học, hoá chất sử dụng để phân tích đạt loại tinh khiết phân tích 4.1 Hóa chất 4.1.1 Nƣớc cất, TCVN 4851:1989 4.1.2 Phenol (C6H5OH) 4.1.3 Axit sunfuric (H2SO4) d= 1,84 4.1.4 Axit axetic (CH3COOH), 10 % theo thể tích (V:V), hòa tan nước cất 4.1.5 Axit sulfanilic (C6H7NO3S) 4.1.6 α Naphthynlamin (C10H7N2.NH2) 4.1.7 Sulfanilamit (C6H8N2O2S) 4.1.8 N (1-naphthyl) etylen diamin dihydroclorua (NED) C12H14N2.2HCl 4.1.9 Amoni hydroxit (NH4OH) 4.1.10 Natri Hydroxit (NaOH) 4.2 Thuốc thử 4.2.1 Dung dịch axit phenoldisulfonic (C6H6O7S2): Hoà tan 25 g phenol tinh khiết vào 150 ml H2SO4 đặc (d= 1,84), thêm 75 ml axit H2SO4 bốc khói Đun nóng h nước sôi, bảo quản lọ mẫu tối 4.2.2 Dung dịch thuốc thử Griss: 4.2.2.1 Dung dịch thuốc thử Griss kiểu cũ, gồm dung dịch: - Dung dịch axit sulfanilic: Hòa tan 0,5 g axit sulfanilic 150 ml axit axetic 10 % - Dung dịch α naphthynlamin: Hòa tan 0,1 g α- naphthynlamin vào 20 ml nước cất, khuấy đều, đun sôi dung dịch, để lắng trong, lọc lấy phần thêm vào 150 ml axit axetic 10 %, lắc đều, bảo quản lọ mầu tối 4.2.2.2 Thuốc thử Griss cải tiến, gồm dung dịch: - Dung dịch sulfanilamit: Cân g sulfanilamit hòa tan bình định mức 500 ml nước cất, lắc kỹ Dung dịch ổn định đến tháng - Dung dịch N (1-naphtyl) etylen diamin dihydroclorua (NED): cân 0,5 g NED hòa tan 500 ml nước cất, bảo quản bình tối mầu Dung dịch không bền, thay hàng tháng thay dung dịch chuyển sang mầu nâu 4.2.3 Dung dịch tiêu chuẩn nitrat, nồng độ 10 mg/l - Cân xác 0,1631 g KNO3 khô tinh khiết, hòa tan nước thêm nước đến 1000 ml bình định mức Trộn dung dịch, thu dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ 100 mg/l, hòa loãng tiếp 10 lần có dung dịch tiêu chuẩn nồng độ 10 mg/l 4.2.4 Dung dịch tiêu chuẩn nitrit, nồng độ mg/l Cân xác 0,375 g NaNO2 khô tinh khiết, hòa tan nước cất thành lít dung dịch, thu dung dịch tiêu chuẩn nồng độ 250 mg NO2-/l Pha loãng 50 lần để có dung dịch tiêu chuẩn mg NO2-/l 4.2.5 Dung dịch NH4OH, pha nước cất tỷ lệ 1:1 tính theo thể tích 4.2.6 Dung dịch NaOH, pha nước cất tỷ lệ 10 % tính theo khối lượng thể tích Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm thiết bị, dụng cụ sau: 5.1 Máy quang phổ 5.2 Máy nghiền mẫu thực vật tƣơi 5.3 Cân phân tích, độ xác 0,0002 g 5.4 Lò vi sóng, công suất 850 W, tần số 2450 MHz 5.5 Nồi cách thủy, nhiệt độ 100 0C 5.6 Cốc chịu nhiệt, dung tích 250 ml 5.7 Bình định mức, dung tích 50; 100; 200; 250; 500; 1000 ml 5.8 Pipet, dung tích từ ml đến ml Cách tiến hành 6.1 Lấy mẫu chuẩn bị mẫu: Phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu đề xác định NO3- NO2- theo TCVN 8551:2010 6.2 Phƣơng pháp chiết nitrat nitrit lò vi sóng: NO3- NO2- mẫu trồng hòa tan lò vi sóng Phương pháp chiết loại trừ hầu hết ảnh hưởng xấu tới kết phân tích nitrat nitrit Cách làm sau: 6.2.1 Thái nhỏ, trộn mẫu, cân khoảng 10 g mẫu với độ xác 0,2 mg, nghiền nhỏ máy nghiền thực vật tươi cho vào cốc 250 ml, thêm nước cất đến khoảng 200 ml 6.2.2 Cho cốc vào lò vi sóng tiến hành đun vi sóng mức lượng cao 100 % thời gian (cũng đun mức lượng 70 % thời gian 12 min) 6.2.3 Lấy để nguội, lọc bỏ bã định mức dịch lọc nước cất đến 200 ml Lấy 10 ml để xác định NO3- 10 ml để xác định NO2- 6.3 Xác định nitrat 6.3.1 Xây dựng đồ thị chuẩn NO3-, dãy tiêu chuẩn mg NO3-/l đến mg NO3-/l 6.3.1.1 Chuẩn bị dãy cốc 250 ml, thêm vào cốc lượng dung dịch nitrat tiêu chuẩn 10 mg/l theo thứ tự 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ml 6.3.1.2 Đun cách thủy cho bay đến cạn (không để cháy) để nguội GHI CHÚ 1: Có thể cô cạn lò vi sóng mức lượng thấp 30 % công suất, thời gian khoảng đến 10 6.3.1.3 Thêm vào cốc ml dung dịch axit phenoldisulfonic lắc mạnh cho phản ứng xẩy nhanh chóng 6.3.1.4 Để yên 10 min, sau thêm cốc khoảng 20 ml nước cất 6.3.1.5 Cẩn thận thêm vào cốc ml dung dịch NH4OH tỷ lệ 1:1 theo thể tích để pH nằm khoảng từ 10 đến 11 GHI CHÚ 2: Có thể trung hòa dung dịch cách nhỏ giọt dung dịch NaOH 10 %, thử quì tím, dung dịch chuyển màu vàng (dư NaOH không ảnh hưởng đến màu dung dịch) 6.3.1.6 Chuyển dung dịch cốc vào bình định mức dung tích 50 ml, định mức nước cất đến vạch lắc kỹ 6.3.1.7 Sau 20 min, đo độ hấp thụ quang bước sóng 410 nm Sau biểu diễn lên đồ thị ta đường chuẩn có nồng độ NO3- từ mg/l đến mg/l 6.3.2 Đo mẫu 6.3.2.1 Chuẩn bị dãy cốc 250 ml, lấy vào cốc 10 ml dịch chiết lò vi sóng 6.3.2.2 Tiếp tục bước từ 6.3.1.2 đến 6.3.1.6 6.3.2.3 Đo độ hấp thụ quang dung dịch mẫu bước sóng 410 nm 6.3.2.4 Đồng thời tiến hành mẫu trắng với 10 ml nước với dung dịch mẫu 6.3.2.5 Đo dung dịch mẫu đồng điều kiện đo dung dịch tiêu chuẩn 6.3.2.6 Căn vào đồ thị chuẩn số đo mẫu máy xác định nồng độ mg NO3-/l dung dịch đo, từ suy hàm lượng NO3- mẫu 6.3.3 Tính kết Hàm lượng nitrat tính theo miligam/kg mẫu tươi (mg NO3-/kg mẫu tươi) tính theo công thức: mg NO3-/kg mẫu tươi = a x V x 1000 V’ x m Trong đó: a Hàm lượng NO3- tính miligam thể tích trích (mg); V Thể tích dung dịch mẫu sau chiết tính mililit (ml); V’ Thể tích dung dịch chích để xác định tính mililit (ml); m Khối lượng mẫu tươi tính gam (g); 1000 Hệ số qui đổi từ gam (g) sang kilogam (kg) 6.4 Xác định nitrit 6.4.1 Xây dựng đồ thị chuẩn NO2-, dãy tiêu chuẩn từ mg NO2-/l đến 0,5 mg NO2-/l, sử dụng thuốc thử Griss kiểu cũ 6.4.1.1 Chuẩn bị dãy bình định mức dung tích 50 ml, thêm vào cốc lượng dung dịch nitrit tiêu chuẩn mg/l theo thứ tự 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ml 6.4.1.2 Thêm vào bình ml thuốc thử dung dịch sulfanilic ml thuốc thử α- naphthinlamin (5.5.1) 6.4.1.3 Lên định mức nước cất đến vạch lắc kỹ 6.4.1.4 Sau 20 min, đo độ hấp thụ quang dung dịch bước sóng 520 nm, thời gian đo không h kể từ phản ứng mầu Sau biểu diễn đồ thị ta đường chuẩn có nồng độ NO2- dung dịch từ mg/l đến 0,5 mg/l GHI CHÚ 4: Có thể dùng thuốc thử Griss cải tiến (5.6.2) cách cho vào bình định mức ml thuốc thử Sulfanillamit ml thuốc thử N (1-naphtyl) etylen diamin dihydroclorua (NED) bước 7.4.1.2 Các bước 6.4.1.3 6.4.1.4 6.4.2 Đo mẫu 6.4.2.1 Chuẩn bị dãy bình định mức dung tích 50 ml, lấy vào bình 10 ml dịch mẫu chiết lò vi sóng 6.4.2.2 Tiếp tục bước từ 6.4.1.2 đến 6.4.1.3 6.4.2.3 Đo độ hấp thụ quang dung dịch mẫu bước sóng 520 nm - Đồng thời tiến hành mẫu trắng với 10 ml nước với dung dịch mẫu - Đo dung dịch mẫu đồng đồng điều kiện đo dung dịch tiêu chuẩn - Căn vào đồ thị chuẩn số đo mẫu máy xác định nồng độ mg NO2-/l dung dịch đo, từ suy hàm lượng NO2- mẫu 6.4.3 Tính kết Hàm lượng nitrit tính theo miligam/kg mẫu tươi (mg NO2-/kg mẫu tươi) tính theo công thức: mg NO2-/kg mẫu tươi= a x V x 1000 V’ x m Trong đó: - a Hàm lượng NO2- tính miligam thể tích trích (mg); - V Thể tích dung dịch mẫu sau chiết tính mililit (ml); - V’ Thể tích dung dịch chích để xác định tính mililit (ml); - m Khối lượng mẫu tươi tính gam (g); - 1000 Hệ số qui đổi từ gam (g) sang kilogam (kg) Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm cần bao gồm thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn này; - b) Đặc điểm nhận dạng mẫu; - c) Kết xác định nitrat nitrit; d) Những chi tiết không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy chọn yếu tố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm BÀI 6: TIÊU CHUẨN QUỐC GIA- TCVN 8010 : 2009 - RƯỢU CHƯNG CẤT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METANOL - Distilled liquors - Determination of methanol content Lời n i đầu - TCVN 8010:2009 xây dựng sở AOAC 972.11 Methanol in Distilled Liquors Gas Chromatographic Method; - TCVN 8010:2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố RƢỢU CHƢNG CẤT - XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG METANOL Distilled liquors - Determination of methanol content Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng metanol rượu chưng cất sắc ký khí phương pháp so màu Phƣơng pháp sắc ký khí 2.1 Thuốc thử Các thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích, trừ có qui định khác 2.1.1 Etanol, 40%, không chứa metanol 2.1.2 Dung dịch gốc metanol Pha loãng 10 ml metanol 99,9 mol % etanol 40% (2.1.1) đến 100 ml 2.1.3 Dung dịch gốc chuẩn nội n-butanol Pha loãng 10 ml n-butanol 99,9 mol % etanol 40% (2.1.1) đến 100 ml 2.1.4 Dung dịch chuẩn metanol Dung dịch metanol 0,050% với dung dịch chuẩn nội n-butanol 0,030% Đổ khoảng 99 ml etanol 40% (2.1.1) vào bình định mức 100 ml dùng xyranh bổ sung vào 500 l dung dịch gốc metanol (2.1.2) 300 l dung dịch gốc n-butanol (2.1.3) Trộn pha loãng etanol 40% (2.1.1) đến 100 ml Trộn lại 2.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 2.2.1 Máy sắc ký khí, trang bị detector ion hóa lửa 2.2.1.1 Cột 23% Carbowax 1500 (khối lượng) silica gel sắc kí W (từ 60 mesh đến 80 mesh, rửa axit) 2.2.1.2 Các thông số: - Nhiệt độ cột 700C (đẳng nhiệt); - Nhiệt độ detector ống nối 1500C; - Tốc độ dòng khí mang heli 150 ml/min Các điều kiện vận hành tối ưu thay đổi theo cột thiết bị cần xác định cách sử dụng dung dịch chuẩn Chỉnh thông số để có độ sắc nét tối đa tách rõ tối ưu pic Với chất chuẩn mức cao, n-propanol cần phải tách đường hoàn toàn khỏi etanol 2.2.2 Xyranh, dung tích 10 l 2.3 Cách tiến hành Dùng xyranh (2.2.2) bơm 10 l hỗn hợp dung dịch chuẩn (2.1.4) Chỉnh thông số vận hành giảm dần để thu chiều cao pic đo (khoảng 1/2 độ uốn toàn thang đo) Xác định thời gian lưu metanol n-butanol (khoảng 12 tương ứng) Bơm 10 l phần mẫu thử để ước đoán lượng metanol, pha loãng cần để kiểm tra mặt n-butanol Tùy thuộc vào có mặt hay mặt n-butanol phần mẫu thử, xác định hàm lượng metanol từ đường chuẩn chuẩn bị theo 2.3.1 2.3.2 2.3.1 Khi mặt n-butanol Trên sở ước đoán metanol, chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn (4 5) dải nồng độ bao trùm nồng độ metanol mẫu thử Bổ sung chất chuẩn nội vào phần mẫu thử lẫn dung dịch chuẩn có nồng độ tương tự với nồng độ metanol phần mẫu thử Tính tỷ số chiều cao pic metanol: n-butanol, sử dụng trung bình lần bơm lặp lại dựng đồ thị tỷ lệ dựa vào nồng độ metanol 2.3.2 Khi có mặt n-butanol Chuẩn bị dãy chất chuẩn metanol 2.3.1, không bổ sung n-butanol vào phần mẫu thử dung dịch chuẩn Dựng đồ thị chiều cao pic thực tế dựa theo nồng độ metanol Từ đồ thị suy nồng độ metanol mẫu thử Phƣơng pháp so màu 3.1 Nguyên tắc Cho phần mẫu thử tác dụng với thuốc thử fucsin sulfit sau oxi hóa metanol thành aldehyd focmic So màu dung dịch thu với màu dung dịch chuẩn 3.2 Thuốc thử 3.2.1 Kali pemanganat, dung dịch 1% Bảo quản dung dịch chai màu nâu, giữ lạnh Sử dụng sau chuẩn bị 24 h loại bỏ sau ngày Dung dịch phải có màu hồng 3.2.2 Axit sulfuric đậm đặc, d = 1,84 3.2.3 Axit sulfuric, pha loãng 1:1 3.2.4 Axit oxalic bão hòa 3.2.5 Dung dịch chuẩn metanol, ví dụ 0,06% Rót etanol 450 rượu tạp aldehyd vào bình định mức 1000 ml (3.3.2) đến hai phần ba thể tích giữ 200C Dùng microburet (3.3.3) lấy 0,27 ml metanol cho vào bình định mức lắc Thêm tiếp etanol 450 (có nhiệt độ 200C) không chứa rượu tạp aldehyd đến vạch lắc Dung dịch thu chứa 0,06% metanol 3.2.6 Dung dịch fucsin sulfit Hòa tan 0,1 g fucsin bazơ parafucsin 70 ml nước cất 700C đến 800C Rót dung dịch vào bình định mức dung tích 100 ml (3.3.2), để nguội đến 200C thêm nước cất 200C đến vạch lắc Rót hết 100 ml fucsin vừa pha vào bình thủy tinh có nút mài 200 ml (3.3.2), thêm 2,5 ml dung dịch natri hydrosulfit (3.2.7) pha, lắc Sau khoảng từ h đến 4h thêm tiếp vào bình 0,48 ml axit sulfuric đậm đặc (3.2.2) Dung dịch giữ bình thủy tinh màu nâu bảo quản lạnh Khi sử dụng, dung dịch phải có màu đặc trưng lưu huỳnh dioxit Khi trộn với thể tích etanol 450 rượu tạp aldehyd không màu 3.2.7 Natri hydrosulfit, d = 1,262 3.3 Dụng cụ 3.3.1 Ống nghiệm so màu, dung tích 25 ml, đáy 3.3.2 Bình định mức, dung tích 100 ml, 200 ml 1000 ml có nút mài 3.3.3 Microburet 3.4 Cách tiến hành Cho vào hai ống nghiệm so màu (3.3.1) Ống thứ 0,2 ml mẫu thử nghiệm ống thứ hai 0,2 ml dung dịch metanol chuẩn Thêm vào ống ml dung dịch kali pemaganat (3.2.1) 0,4 ml axit sulfuric pha loãng (3.2.3) Đậy nút ống nghiệm lắc Sau thêm vào ống ml axit oxalic bão hòa (3.2.4) Khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt cho thêm ml axit sulfuric đậm đặc (3.2.2) để dung dịch màu hoàn toàn Thêm ml thuốc thử fucsin sulfit (3.2.6) lắc Để yên hai ống nghiệm 35 min, sau so màu hai dung dịch Màu rượu thử không đậm màu dung dịch rượu chuẩn Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; kết thử nghiệm thu Bài KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY ĐỘC TRONG THỰC PHẨM I Mục tiêu - Nắm phương pháp kiểm nghiệm tổng số vi sinh vật hiếu khí nấm men, nấm sợi thực phẩm - Rèn luyện kĩ thao tác nuôi cấy vi sinh vật, đếm khuẩn lạc - Đánh giá độ an toàn số loại thực phẩm Cơ sở lý thuyết  Định lượng vi sinh vật phương pháp đếm số khuẩn lạc môi trường đặc - Đối với vi sinh vật đơn bào, ta xem khuẩn lạc kết phát II triển từ tế bào ban đầu - Ưu điểm phương pháp: định lượng tế bào sống - Nhược điểm: tốn nhiều thời gian, nhân lực - Quy trình Mẫu Môi trư Pha loãng Chuẩn bị Gieo cấy (đổ đĩa petri, cấy chan với thể tích mẫu từ 0,1-1ml) Nuôi cấy (370C, 48 Đếm khuẩn lạc, tính kết III Tiến hành thí nghiệm A XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Nguyên tắc - Tổng số vi sinh vật hiếu khí xác định phương pháp đếm khuẩn lạc cách đổ đĩa thạch, nuôi cấy mẫu ủ điều kiện hiếu khí 300C/72h ± 6h 370C/48h ± 6h Dụng cụ v môi trƣờng 2.1 Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Tủ ấm 300C - Que chan, đèn cồn - Cối sứ, chày 2.2 Môi trƣờng - Môi trường pha loãng mẫu: dung dịch muối pepton với thành phần sau: + Pepton từ casein + NaCl + Nước cất : 10g : 8g : đủ 1L Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng, pH ± 0,2 250C, cần - Môi trường nuôi cấy: môi trường Plate Count Agar (PCA) với thành phần sau: + Peptone : 5g + Cao nấm men : 2,5g + Glucose : 1g + Agar : 15-20g + Nước cất : đủ 1L pH cuối : 7,0 ± 0,2 Tiệt trùng môi trường 1210C/15 phút Cách tiến hành 3.1 Xử lý mẫu - Cân 1g mẫu cho vào cối sứ nghiền nhuyễn Cho tiếp vào cối 9mL dung dịch muối peptone Ta thu dd huyền phù có độ pha loãng 101 Sử dụng dung dịch muối peptone để tiếp tục pha loãng mẫu với hệ số pha loãng 10-8 3.2 Cấy mẫu - Mẫu thực phẩm sau xử lý bước 3.1 nuôi cấy đĩa petri môi trường PCA với lượng mẫu cấy vào đĩa 100µl 3.3 Nuôi cấy - Mẫu giữ điều kiện hiếu khí nhiệt độ 370C vòng 48h, sau đếm khuẩn lạc 3.4 Tính kết - Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật để tính Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí 1g mẫu tính sau: Công thức tính: Trong đó: A- số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) 1g mẫu N- tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n- số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f- độ pha loãng tương ứng B XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM SỢI - Tương tự phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Nhưng môi trường nuôi cấy phương pháp sử dụng môi trường Yeast And Mould Agar (YAMA) với thành phần sau: + Cao nấm men : 3g + Chất chiết malt : 3g + Peptone : 5g + D- glucose : 10g + Agar : 20g + Nước cất : đủ 1L pH cuối : 6,2 ± 0,2 Tiệt trùng môi trường 1210C thời gian 15 phút TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 8742:2011 TCVN 9637-5:2013 TCVN 8010 : 2009 Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phú, Trần Thanh Đại, Phân tích thực phẩm, NXB Lao động, 2010 Trần Thị Bích Lam, Thí nghiệm phân tích thực phẩm, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM, 2006 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2002 Hà Duyên Tư, Phân tích hóa học thực phẩm, NXB khoa học kỹ thuật, 2010 Hà Duyên Tư, Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, NXB khoa học kỹ thuật, 2010 ... lý thuyết kiểm nghiệm an toàn lương thực – thực phẩm Đánh giá cảm quan thực phẩm Đánh giá kim loại nặng thực phẩm Phát nhanh phẩm màu độc không độc Định tính định lượng hàn the thực phẩm Xác định... phần thực hành, sinh viên nắm số thao tác, kỹ phân tích định tính định lượng chất độc hại có thực phẩm Nội dung giảng Bài giảng Thực hành Kiểm nghiệm an toàn lương thực thực phẩm dành cho sinh. .. tới kết quả; kết thử nghiệm thu Bài KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY ĐỘC TRONG THỰC PHẨM I Mục tiêu - Nắm phương pháp kiểm nghiệm tổng số vi sinh vật hiếu khí nấm men, nấm sợi thực phẩm - Rèn luyện kĩ