Nghiên khả năng nhân giống cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro.

28 Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy.. 29 Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhan

BÙI KHÁNH LY

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI

(Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI KHÁNH LY

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI

(Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VTRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016

em trong suốt thời gian thực tập

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, ThS Nguyễn Thị Tình và ThS Ma Thị Hoàn đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể

và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn bè đã giúp

đỡ em trong thời gian vừa qua

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn

để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Bùi Khánh Ly

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2] 4

Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 25 Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến khả

năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro sau 7 ngày 27

Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi sau 20 ngày theo dõi 28 Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với GA3 đến khả năng tái sinh chồi của cây Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 28 Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy 29 Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy 29 Bảng 3.7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả năng

ra rễ cây Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy 30 Bảng 3.8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả năng

ra rễ cây Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy 30 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ và thời gian sử dụng chất khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro (sau 7 ngày)

32 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 35 Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với

Bảng 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Bình vôi sau 30 ngày nuôi cấy 39 Bảng 4.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi Bình vôi sau 30 ngày muôi cấy 41

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) 5 Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống invitro cây Bình Vôi 26 Biểu đồ 4.1: Biểu diễn ảnh hưởng nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả

năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro (sau 7 ngày) 34

Biểu đồ 2: Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 36 Hình 4.1: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung nồng độ BA kết hợp với các nồng

độ GA3 khác nhau sau 20 ngày nuôi cấy 38 Hình 4.2: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung tổ hợp BA với các nồng độ khác nhau đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy 40 Hình 4.3: Chồi cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung nồng độ Kinetine khác nhau đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy 42 Hình 4.4: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy 44 Hình 4.5: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và IBA ở các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy 46

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA : 6-Benzylaminopurine

GA3 : Gibberellic Acid IBA : Indole butyric acid

MS : Murashige & Skoog (1962)

CS : Cộng sự

CT : Công thức

CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng

LSD : Least Singnificant Difference Test

MS : Murashige & Skoog (1962)

MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid WHO : World Health Organization

MỤC LỤC

Trang

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu đề tài 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học: 3

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn: 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về chi Bình vôi 4

2.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Phân loại Chi 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái và phân bố 4

2.2 Giá trị của cây Bình Vôi 6

2.2.1 Giá trị về kinh tế 6

2.2.2 Giá trị về dược liệu 6

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 9

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 10

2.4 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật 11

2.4.1 Khái niệm 11

2.4.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật 12

2.5 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro 12

2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 12

2.5.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 13

2.5.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 13

2.5.4 Tạo cây hoàn chỉnh 14

2.5.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 14

2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

2.6.1 Vật liệu nuôi cấy 15

2.6.2 Điều kiện nuôi cấy 15

2.6.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 16

2.7 Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình Vôi 22

2.7.1 Nhân giống bằng phương pháp hữu tính 23

2.7.2 Phương pháp nhân giống vô tính 23

2.7.3 Phương pháp nhân giống in vitro 23

2.7.4 Phương pháp chế biến và sử dụng 24

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 25

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 25

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy invitro 26

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.3 Nội dung nghiên cứu 27

3.5.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

3.6 Xử lí số liệu 31

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ và thời gian sử dụng chất khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro 32

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinine và Gibbererllin đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi 34

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAđến khả năng tái sinh chồi

cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ 34

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với GA3 đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ 36

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số cytokinine đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi 39

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi 39

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi 41

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng một số Auxin đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi 43

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây Bình Vôi 43

4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ cây Bình Vôi 45

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

PGS, TS Lê Xuân Cảnh (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) cho biết: năm 1992, trung tâm giám sát bảo tồn thế giới xếp Việt Nam là một trong 16 quốc gia có đa dạng sinh học cao nhất thế giới Theo số liệu báo cáo quốc gia về đa dạng sinh học (năm 2011) cho thấy, tại Việt Nam ghi nhận được khoảng hơn 49 nghìn loài sinh vật, bao gồm: khoảng 7.500 loài/chủng vi sinh vật; 20 nghìn loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; hơn 11 nghìn sinh vật biển [44] Nguồn dược liệu của Việt Nam cũng rất phong phú, đa dạng và được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa trị nhiều bệnh khác nhau Theo kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 của Viện dược liệu (2006) cho biết Việt Nam có khoảng 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc [45] Một trong số cây thuốc được sử dụng nhiều là cây Bình Vôi

Trong củ Bình Vôi có chứa alkaloid bao gồm L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Ngoài ra còn có tinh bột, đường khử oxygen, acid malic, men oxydase [22] Trong đó quan trọng nhất là L- tetrahydropalmatin (rotundin) và roemerin và cepharanthin Rotundin có tác dụng

giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp và điều hòa tốt đối với tim mạch [12] Hàm lượng hoạt chất này có trong củ Bình Vôi tươi khoảng 0,12 –

0,3% Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp Cepharanthin được coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm

nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thư Ngoài ra, Bun Sok-Siya và cs (2009) đã chiết xuất cepharanthin có tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan [40] Mặt khác, còn ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình Vôi còn dùng làm vật trang trí đẹp và được nhiều người ưa chuộng [5]

Ở Việt Nam củ Bình Vôi được tìm thấy ở những vùng có núi đá như: Hà Giang, Tuyên Quang, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nam, Hải Phòng, Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thanh Hóa Tuy nhiên giá trị dược liệu của củ Bình vôi lại phụ thuộc rất nhiều vào vùng phân bố và điều kiện sinh thái

Hiện nay, nguồn củ Bình vôi chủ yếu được khai thác từ tự nhiên mà ít có các nghiên cứu về trồng trọt và nhân giống Bình vôi nhân giống bằng hạt được tạo ra từ quá trình thụ phấn giữa hoa đực và hoa cái [5] Tuy nhiên cây cho hoa đực và cây cho hoa cái nằm khác gốc vì vậy việc thụ phấn gặp nhiều khó khăn [46] Với phương pháp cắt phần củ thành từng mảnh đem trồng không đem lại hiệu quả cao

do điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa nhiều của nước ta, vi sinh vật hoạt động mạnh dẫn đến thối củ Vì vậy hiện nay củ Bình vôi đang rất khan hiếm trong tự nhiên và

đã được đưa vào danh mục cần bảo tồn Theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày

30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy cấp, quý

hiếm” thì các loài Bình vôi (Stephania sp.) được xếp trong nhóm IIA (Thực vật

rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại) [5]

Phương pháp nhân giống in vitro với những ưu điểm là tạo ra những giống

cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn

Nhận thức được việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý tiềm năng, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

phương pháp in vitro

1.2.2 Yêu cầu đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến

khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro

năng ra rễ cây Bình Vôi

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học:

+ Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá được ảnh hưởng của một số chất kích

thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ từ đoạn thân mang chồi ngủ của cây Bình Vôi

+ Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn:

Góp phần nhân nhanh tạo số lượng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn loài dược liệu quý theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, đảm bảo nguồn nguyên liệu chất lượng cung cấp cho ngành y dược

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về chi Bình vôi

2.1.1 Nguồn gốc

Chi Bình vôi (Stephania) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có nguồn gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia [16] Ở Việt Nam, cây mọc hoang tại nhiều vùng rừng núi

2.1.2 Phân loại Chi

Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2]

Chi Bình Vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê) Một số loài công bố ở Việt Nam: Stephania glabra (Roxb) Miers, S kuinanensis, S Pierrei Diels, S Sinica Diels, S.rotunda Lour,…[42] Trên thế giới, chi Bình vôi có hơn 40 loài Ở Việt Nam,

chi Bình vôi có 13 loài với 4 loài đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam” [20]

2.1.3 Đặc điểm hình thái và phân bố

Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi

Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae) Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác

nhƣ là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,…

Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour)

Bình vôi là cây mọc hoang dại, thích hợp ở nhiệt độ trung běnh năm 21-230C, lượng mưa 2000 – 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5-7

Các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: dây leo, thân nhẵn hơi xoắn vặn, thường xanh, sống lâu năm Rễ củ đa dạng, có thể rất to và nặng tới gần 20kg, vỏ ngoài xù

xì màu nâu - nâu đen Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3; phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ

lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thường là 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng Quả hạch hơi dẹt, mọng nước màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang 4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa

có lỗ thủng hoặc không Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [11],[26]

Đặc điểm hình thái của một số loài Bình vôi [26], [43]:

Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một

nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm Lá hình khiên, mọc cách Phổ biến ở các rừng thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…

Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng Lá có kích

thước nhỏ hơn tất cả các loài khác Hoa đực không có cánh hoa

S hainanensis H.S Lo et Y Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu

trắng hoặc vàng nhạt

S cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác

S dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau

có màu tím hay tím hồng

S excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ

lệch một bên

S cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ

S sinica Diels: Giá noãn không có lỗ

Stepphania viridiflavens H.S.Lo et Yang: Lá có phiến hình tam giác, cuống

lá bằng hoặc dài hơn phiến lá

Các loại Bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc, Trung, Nam Thường tập trung ở vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học

2.2 Giá trị của cây Bình Vôi

2.2.1 Giá trị về kinh tế

Cây Bình Vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của nước ta, là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam Nó có thể phát triển tốt khi được trồng trong đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước mà không cần tốn công chăm sóc hay kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng

Cây Bình Vôi được coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao Bên cạnh đó, cây Bình Vôi còn là cây có tiềm năng lớn trong y học, là nguồn nguyên liệu cho ngành dược

Tuy nhiên, trước việc khai thác ồ ạt của người dân thì loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên

2.2.2 Giá trị về dược liệu

Cây Bình Vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu Cây bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc hoạt chất được các nhà khoa học quan tâm và chiết suất nhiều từ cây bình vôi là rotundin - một hoạt chất rất cần trong y học Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột cống trắng cho thấy Bình Vôi có tác dụng an thần, gây ngủ

Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình Vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,… Liều dùng: 3 - 6 g/ngày Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình Vôi (1 phần) với rượu 40° (5 phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml, có thể thêm đường cho dễ uống Để tránh bị ngộ độc, chỉ nên sử dụng với liều nhỏ: Người lớn ngày uống 3 – 6g Trẻ nhỏ dùng với liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [28]… Trong y học hiện đại, rotundin được dùng làm thuốc an thần, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm thần [10] Liều dùng: 0,05 - 0,10g/ngày, dưới dạng viên L - tetrahydropalmatin clorhydrat, mỗi viên 0,05g [28], [41]

Trong củ bình vôi chứa một lượng chất alkaloid bao gồm tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này

L-được sử dụng nhiều để điều chế thuốc, đặc biệt là thuốc an thần Chất quan trọng nhất là rotundin

Các công trình khẳng định vai trò của Rotundin trong củ Bình vôi đã được công bố như sau:

Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với GS.TS Đỗ Tất Lợi, Bonnet và Bùi Đình Sang đã chiết xuất từ củ bình vôi Stephania Rotunda một hợp chất thuộc nhóm alcaloid và đặt tên là rotundin Năm 1965, chất này được xác định là L tetrahydropalmatin Đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết xuất được rotundin

Năm 1962, Fakhrutdinov Sf xác định roemerin gây tê niêm mạc và phong bế Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương Roemerin đối kháng với tác

dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine Đối với hệ thần kinh trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến

tử vong Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp [37]

Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka và cs (1984), Cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, tăng cường sinh sản kháng thể nên

có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổi khi dùng cepharanthin Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện [31]

Năm 1999, tác giả Nguyễn Tiến Vững đã tổng kết các loài trong chi Stephania trên thế giới gồm 164 hợp chất thuộc 8 nhóm hóa học khác nhau (benzylisoquinolin, bis - benzylisoquinolin, protoberberin, aporphin, proaporphin, hasubanan, morphinan, dibenzazonin) [41]

Năm 1999, theo Ngô Đại Quang tác đụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một

số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và

an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp,

sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [16]

Phạm Thị Kim và cs bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn của chế phẩm cao Rotundin ít độc, khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg),

dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v [28], [41]

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị bệnh trên thế giới ngày càng tăng Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số thế giới dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó chủ yếu là thuốc từ cây cỏ Thế giới hiện nay có hơn 35000 loài thực vật dùng làm thuốc, trong đó có khoảng 2500 cây thuốc được buôn bán trên thế giới Ở Châu Âu, có

ít nhất 2000 cây thuốc được sử dụng Ở Châu Á, có khoảng 5000 loài ở Trung Quốc,

1700 loài ở Ấn Độ, trong đó có đến 90% thảo dược thu hái hoang dại [1]

Năm 1944, Kondo (Nhật) đưa ra công thức khai triển của rotudin với công thức thô là C13H19(OCH3)3CH3N

Năm 1950 và 1952 Qiaudry G R và Siddiqui (Ấn Độ) đã nghiên cứu và

chiết từ củ cây Stephania Glabra (Roxb) Miers nhiều alkaloit và đặt tên là

hyndarin C23H25O4N, Stefarin C18H9O3N và cyckanin C38H42O6N trong đó hyndarin chiếm thành phần chủ yếu (chừng 30% hyndarin, 15-18% stefarin và rất ít cyckanin) Nghiên cứu cấu tạo hyndarin người ta thấy rằng hyndarin thực ra cũng chỉ là một alkaloit đã biết có tên là tetrahydropanmatin [11]

Trước năm 1965, người ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloit khác nhau vì chiết từ hai cây khác nhau, mọc tại hai nước khác nhau Nhưng đến năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn liên bang Xô Viết cũ (VILAR) có dịp so sánh hai cây, một di thực từ Ấn Độ, một di thực từ Việt Nam, thấy rằng hai cây chỉ là một loài nên đã kiểm tra lại tính chất của rotundin và đã xác định rotundin và hyndarin chỉ là một chất và có cấu tạo của tetrahydropanmatin

Năm 1965 tại Liên Xô cũ, Phan Quốc Kính và cs cũng chiết từ củ Bình vôi mang từ Việt Nam sang một số alkaloit và đặt tên là alkaloit A, alkaloit C và D với

tỷ lệ 0,08% mỗi thứ (Hoá học các hợp chất thiên nhiên, 6-1965) [11]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi mọc ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử oxy, axít malic, men oxydaza và một alkaloit với tỉ lệ 1,2-1,5% (tính trên củ tươi), được Bùi Đình Sang đặt tên là rotudin [11]

Năm 1964, tại Bộ môn dược liệu (Trường Đại học Dược khoa, Hà Nội) Ngô Văn Thu còn chiết từ củ Bình vôi Việt Nam một ancaloit mới là roemerin Từ rễ củ

loài S.pierei Diels thu hái ở vùng ven biển Bình Định, Ngô Thị Tâm đã phân lập

Năm 1997 Phạm Thanh Kỳ chiết từ rễ củ của loài S.brachyandra có:

isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%) ,sinomenin (0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin (0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%) và N-metyllaurotetanin (0,006%) Trong rễ

củ loài S.kwangsiensis có: tetrahydropalmatin, capaurin, isocorydin, roemerin,

dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin và palmatin [10]

Trong rễ củ loài S.sinica có alkaloid chính là Rotundin (1,2-1,5%).Từ rễ củ loài S.cepharantha đã phân lập được alkaloid chính là cepharanthin và những alkaloid phụ

khác: isotetrandin, berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin, o-nornuciferin,

stesakin, palmatin, cepharamin.Trong rễ củ loài S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin

(0,2%), stephanin(0,2%), tetrahydropalmatin (0,1%) và dehydrostephanin

Năm 2003, Nguyễn Viết Thân , hàm lượng alcaloid toàn phần thu được trong dược liệu ít nhất là 2% tính theo dược liệu khô [22]

Theo Bùi Thị Bằng (2006), hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% ở loài

S.brachyandra Diels (thu ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài S.sinica Diels (thu ở Hà Nam Ninh), 1,30% ở loài S.kwangsiensis H.S.Lo (thu được ở Quảng Ninh), 0,72%

ở loài S.hainanensis H.S.Lo et Y.TSoong (thu ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài

S.cambodia Gagnep (thu ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài S.cepharantha (thu ở Hà Sơn Bình), 0,21% ở loài S.peirrei Diels (thu được ở Tây Nguyên) [4]

Năm 2007, Thủ tướng chính phủ ra quyết định phê duyệt "Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá dược đến năm 2020" nhiệm vụ đề ra trong Lĩnh vực 1: Kế thừa và phát huy các kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ trước đây để sản xuất các hoạt chất thiên nhiên

từ thanh hao hoa vàng, hoa hoè, chè xanh, gấc, Chiết tách, bán tổng hợp một số hoạt chất chính sau đây để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, có đề cập tới Nội dung :

Sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat từ củ Bình Vôi (stephania rotunda) và

D,L-rotundin sulfat từ palmatin hydrochlorid chiết xuất từ cây hoằng đằng

(Fibraurea tinctoria) [29]

Năm 2010, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh đã tiến hành nghiên cứu

nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) [15]

Nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây dược liệu tạo ra các sản phẩm hàng hóa có sức cạnh tranh trên thị trường Phát triển các giống cây đẳng sâm, hoàng

đằng, thạch hộc, kê huyết đằng, cẩu tích, sa nhân, thiên niên kiện, thổ phục linh, lan kim tuyến, trà hoa vàng, cây mật nhân, Sâm Cau, Bình Vôi, Gấc [3]

2.4 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật

2.4.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [14]

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc

ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ [14]

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và

nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức

nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [15]

2.4.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật

2.4.2.1 Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [21]

2.4.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sang tế bào chuyên hoá

để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh

để thực hiện chức năng phân chia

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng

2.5 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro

Trịnh Đình Đạt (2007) [6]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:

2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro Mục

đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Có thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: NaOCl, CaOCl2, HgCl2,…[6]

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…

Sharma G.J (2005) [36] đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15

phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu Dương Tấn Nhựt và cs (2011) [33] tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong 30 giây và HgCl2trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao

2.5.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mô được đưa vào nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy Nayak S và cs (2011) [32]

nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3

mg/l đến khả năng bật chồi thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất Behera K.K và cs (2010) [30] sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng Bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hoá

2.5.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Để tăng hệ số nhân chồi người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều h ̣a sinh trưởng

(auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính Theo Jala A và cs (2012) [38] nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp

BA 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau

80 ngày nuôi cấy

2.5.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường

ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-

D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi Nguyễn Thị Liễu

và cs (2011) [13] đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trường MS bổ sung sucrose 50 mg/l

2.5.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng

dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Là giai đoạn

chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất Sen A và cs (2010) [34] khi

chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây

vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên

Shahinozzaman M (2013) [35] chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa

có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi Kết

quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao

Theo Goer (1993) để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.6.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [24]

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [24]

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:

Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [24]

2.6.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp lọc vi sinh vật, có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc [24]

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định

về ánh sáng và nhiệt độ [24]

2.6.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự

phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.6.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo điều

kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô

trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [23]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật

in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng

trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí

nghiệm nuôi cấy mô cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt

độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [21]

- pH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [24],25

2.6.4.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, các vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, ) và một

số chất có thành phần không xác định như nước dừa,dịch chiết khoai tây, cao nấm men…

a) Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật Giống như cây trồng ngoài tự

nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [21]:

- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S)

- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo)

Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [21]

b) Dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…[24]

- Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid [24]

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [24]

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…[24]

c) Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Đại

đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các vitamin thường

được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [24]

- Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [24]

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [24]

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon [24]

d) Nước

Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [21]

e) Đường

Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối) Các mô có màu xanh

cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro Mặt khác, quá trình quang hợp

cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy Trên thực tế việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém

Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp và

vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy [21]

f) Agar

Agar là một loại polysacharit của tảo Agar là chất keo đông thường được

sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy Ở

800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [21]

g) Chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [21]

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

Auxin: Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có

tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp, trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy

Cytokinin: Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết

định sự phân hóa chồi Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng

thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì

có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin làmột loại cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ

Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà

khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [14]

h) Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất

phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường tạo môi trường tối

2.7 Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình Vôi

Theo Trung tâm Tài nguyên và Môi trường - Đại học Quốc gia Hà Nội (2000)

đã thống kê nước ta có 3.800 loài thực vật có giá trị dược liệu Việc sử dụng thảo dược làm thuốc chữa bệnh đã có từ xa xưa, song chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian Trong những năm gần đây, nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm tăng mạnh, việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc một cách bừa bãi làm cho các loài cây có giá trị dược liệu bị suy giảm nghiêm trọng, một số loài đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng, phải đưa vào danh mục thực vật rừng nguy cấp, quý, hiếm, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm

2006 của Chính phủ) Trước thực trạng đó, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số 81/2009/QĐ-TTg về việc phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành công nghiệp hóa dược đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 Trong đó, ưu tiên đầu tư sản xuất nguyên liệu hóa dược để phục vụ sản xuất thuốc thiết yếu, thuốc có thế mạnh xuất khẩu, thuốc từ dược liệu để thay thế thuốc nhập khẩu Ưu tiên việc tạo dựng nguồn nguyên liệu ổn định về số lượng và chất lượng để cung cấp cho các nhà máy chiết xuất Theo quy hoạch, sẽ có 22 vùng nguyên liệu sản xuất thuốc được củng cố, mở rộng nhằm phát triển các giống cây thuốc quý của Việt Nam và thế giới Chi Bình Vôi (Stephania) gồm nhiều loài cây thuốc quý có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dạ dày, chữa mất ngủ, chúng còn được sử dụng để chữa bệnh ung thư một trong những căn bệnh của thế kỷ Hiện nay các tài liệu mô tả về các đặc điểm sinh vật học, sinh thái học

của các loài Bình 2 vôi rất hạn chế Trong đó loài Bình Vôi (Stephania rotunda Lour.)

đang bị suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên Do vậy việc tìm kiếm phương pháp

nhân giống loài cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen và phát triển cây thuốc quý hiếm [44]

2.7.1 Nhân giống bằng phương pháp hữu tính

Vơi phương pháp này Bình Vôi Tím được trồng bằng hạt Thu hái quả chín vào khoảng tháng 8-10, đãi vỏ lấy hạt Bảo quản hạt trong cát ẩm Gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3), tỉ lệ mọc sẽ cao Gieo hạt tươi, tỷ lệ mọc đạt 70-80% Hạt để cách năm có tỉ lệ mọc thấp Chọn đất nhiều mùn, tiện tưới và thoát nước làm vườn ươm Ở Việt Nam vào tháng 2-3, khi cây hồi xuân, có thể tìm kiếm cây con ở rừng đem về trồng

2.7.2 Phương pháp nhân giống vô tính

Trong phương pháp này phần đầu của củ được cắt để làm giống Mỗi đầu có thể

xẻ làm 4 mảnh Thời vụ trồng vô tính này cũng vào tháng 2-3 Đất trồng cao thoáng

nước Ngoài ra, có thể nhân giống bằng hom thân Bình Vôi trồng ở Việt Nam có hiện

tượng sâu xanh hại lá từ tháng 4-10 và củ thối do bị úng nước Thu hoạch cây trồng sau 2-3 năm, thời gian càng lâu năng suất càng cao Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng từ mầm củ thu hoạch vào mùa đông tháng 11-12 khi cây tàn lụi Khi đào tránh làm sây xát củ Năng suất trung bình 1 tấn củ khô/ha [26]

2.7.3 Phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nuôi cấy in vitro được xem như là phương pháp đạt hiệu quả

cao trong nhân giống và cải thiện các loài thực vật, trong đó bao gồm cả cây

Bình Vôi Trong nhân giống in vitro đối với đối tượng này đã có những công

trình nghiên cứu khoa học được công bố cụ thể như sau:

Handique PJ và Sharma Deboja (2010) trên cây Bình vôi (Stephania japonica), ông cho rằng khi kết hợp các chất kích thích sinh trưởng với nhau thì

sẽ cho kết quả tạo chồi tốt hơn, cụ thể môi trường MS + 4 mg/l BA + 0,1 mg/l Kinetin là tối ưu cho việc tạo chồi

Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh (2011) [15]: Sử dụng môi trường MS

bổ sung 2,4-D 5mg/l, BA 0,2mg/l tạo mô sẹo từ khúc cắt đoạn thân Môi trường MS

bổ sung BA 1mg/l, NAA 0,2mg/l, kích thích quá trình tái sinh chồi từ chồi ngủ

Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2014) [5 Sử dụng HgCl2 0,1% ngâm mẫu trong thời gian 25 phút cho tỷ lệ mẫu vô trùng đạt 89,44% Môi trường tái sinh mầm ngủ thích hợp là BA 0,5 (mg/l) + NAA 0,5 (mg/l) Bổ sung BA 2 (mg/l) kích thích nhân nhanh chồi tốt ở cây Bình Vôi

2.7.4 Phương pháp chế biến và sử dụng

Hiện nay, nước ta thu hái củ Bình Vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại Khi thu về cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô được sử dụng làm thuốc uống hoặc đem chiết rotundin Từ củ Bình Vôi ta có thể chế biến ra chất rotudin thô hay tinh khiết như sau: Thái hay xát củ Bình Vôi, ép lấy nước, bã còn lại thêm nước vào khuấy đều rồi lại ép nữa Làm như vậy cho tới khi bã hết đắng (alkaloid ra hết) Nước ép để lắng, thêm nước vôi trong hoặc dung dịch Cacbonat kiềm sẽ cho tủa rotudin thô Lọc hay gạn lấy phơi hoặc sấy khô Như vậy ta sẽ thu được rotudin thô vừa gọn, vừa dễ bảo quản và dễ vận chuyển Từ rotudin thô ta có thể chiết rotudin tinh khiết bằng cách dùng cồn hay dung dịch axit sunfuric nóng 5 hay 10%, lọc rồi kết tinh Làm đi làm lại nhiều lần, theo nguyên tắc chung của kết tủa alkaloid, ta sẽ thu được rotudin tinh khiết

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) khỏe

mạnh, sạch bệnh được trồng tại vườn Lan Khoa CNSH & CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn thân non, bánh tẻ cây Bình Vôi

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến

khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi, ra rễ của cây Bình Vôi

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Khoa CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

CNSH Thời gian: 11/2015 – 5/2016

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nhóm Cytokinine (BA,NAA,…) Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Nhóm Gibbererllin (GA3)

Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, petri) Đường Sacharose

Box cấy vô trùng Giấy thấm Than hoạt tính