Nghiên cứu khả năng nhân giống cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - PHẠM THỊ HIỆNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học Giảng viên hƣớng dẫn : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 : PGS.TS Ngô Xuân Bình ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên – năm 2015 ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm toàn thể thầy cô giáo khoa tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian thực đề tài Qua thời gian làm việc phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm đến em hoàn thành đề tài Để đạt kết ngày hôm em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Thị Tình, PGS.TS Ngô Xuân Bình tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đóng góp hướng dẫn quý báu KS Lã Văn Hiền trình thực hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Phạm Thị Hiệng iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine Cs : Cộng CT : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IBA : β - Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA :  - Naphlene axetic acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 25 Bảng 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS, 1/2MS 26 Bảng 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin đến khả cảm ứng chồi Giảo cổ lam 27 Bảng 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam 28 Bảng 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với hàm lượng NAA đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam Error! Bookmark not defined Bảng 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng IBA 30 Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam (sau 10 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với BA để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả rễ 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hóa học Flavononit Saponin Hình 4.1: Chồi Giảo cổ lam tái sinh môi trường MS ½ MS 34 Hình 4.2: Chồi Giảo cổ lam môi trường MS có bổ sung hàm lượng Kinetin giai đoạn tái sinh 36 Hình 4.3: Chồi Giảo cổ lam môi trường MS có bổ sung hàm lượng Kinetin BA giai đoạn nhân nhanh 38 Hình 4.4: Chồi Giảo cổ lam môi trường MS có bổ sung hàm lượng Kinetin NAA giai đoạn nhân nhanh 40 Hình 4.5: Rễ Giảo cổ lam môi trường MS có bổ sung 0,1mg/l IBA 42 vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài .2 1.4 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát Giảo cổ lam .3 2.1.1 Nguồn gốc phân bố cấy Giảo cổ lam .3 2.1.2 Phân loại .3 2.1.3 Đặc điểm thực vật học Giảo cổ lam .3 2.1.4 Điều kiện sinh thái Giảo cổ lam .4 2.1.5 Vị trí Giảo cổ lam hệ thống thực vật học dược liệu 2.1.6 Nghiên cứu giá trị y học Giảo cổ lam 2.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.2.2 Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.3 Các phương pháp nhân giống trồng 15 2.3.1 Nhân giống hưu tính (bằng hạt) .16 2.3.2 Nhân giống vô tính 16 2.3.3 Nhân giống vô tính in vitro 17 2.4 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam giới nước 18 2.4.1 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam giới 18 2.4.1 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam nước 20 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 vii 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .23 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu .23 3.1.3 Hóa chất thiết bị 23 3.2 Điều kiện nuôi cấy 24 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 24 3.4 Nội dung nghiên cứu phương pháp nghiên cứu .24 3.4.1 Nội dung nghiên cứu .24 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24 3.5.1 Thu thập số liệu .30 3.5.2 Các tiêu theo dõi 30 3.5.3 Phương pháp xử lý số liệu 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam .32 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 33 4.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam 35 4.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với hàm lượng BA thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam 37 4.5 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh giống Giảo cổ lam .39 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận .43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO viii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nghiên cứu công trình nghiên cứu khác tham khảo trích dẫn tài liệu tham khảo đầy đủ Thái Nguyên, ngày XÁC NHẬN CỦA GVHD tháng năm 2015 NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN Đồng ý cho bảo vệ kết trước hội đồng khoa học! GVHD1 GVHD2 Sinh Viên XÁC NHẬN CỦA GV CHẤM PHẢN BIỆN Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên sửa chữa sai sót sau Hội đồng chấm yêu cầu! (Ký, họ tên) PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc họ Cucurbitaceae Còn gọi Thất diệp đởm, trà vạn, trường sinh, cỏ thần kỳ Đây dược liệu quý ghi sách cổ “Nông toàn thư hạch chú” Từ xưa sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe, kéo dài tuổi thọ làm đẹp Giảo cổ lam phân bố số quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Triều Tiên, Việt Nam… Ở nước ta Giảo cổ lam phát tỉnh trung du miền núi phía Bắc Lào Cai, Cao Bằng, Bắc Kạn,…và số địa phương khác (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14] Theo nghiên cứu GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam chứa 100 loại Saponin có nhiều cấu trúc giống Saponin nhân sâm tam thất Ngoài Giảo cổ lam chứa Flavonoid Đây chất có khả chống lão hóa mạnh, tăng cường sức khỏe, giúp ổn định huyết áp, làm tan huyết khối, ngăn ngừa xơ vữa mạch, phòng chống tai biến tim, mạch, não, chống lão hóa, ngăn ngừa stress, ngừa ung thư não, tử cung, da, … (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6] Với tác dụng nên có sản phẩm thuốc, trà thực phẩm chức sử dụng Giảo cổ lam làm nguyên liệu, nguồn Giảo cổ lam tự nhiên bị khai thác mức bị tuyệt chủng Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam xếp thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d (Bộ môn Thực vật, 2004) [5] Vì việc nghiên cứu nhân giống Giảo cổ lam phục vụ cho công tác sản xuất cần thiết Việc nhân giống Giảo cổ lam tiến hành thông qua đoạn thân hay hạt Tuy nhiên để tạo lượng giống lớn, đồng bệnh thời gian ngắn để phục vụ cho sản xuất bảo tồn nuôi cấy mô tế bào phương pháp tối ưu Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, thực đề tài: “Nghiên cứu khả nhân giống Giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum phương pháp in vitro’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu - Tìm quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam phương pháp in vitro 1.3 Yêu cầu đề tài Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến khả tái sinh: - Xác định ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam - Xác định ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS đến khả tái sinh chồi Giảo cổ lam - Xác định ảnh hưởng hàm lượng số chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam - Xác định ảnh hưởng hàm lượng auxin đến khả rễ Giảo cổ lam 1.4 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học + Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức học nghiên cứu khoa học + Biết phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày báo khoa học - Ý nghĩa thực tiễn Xác định yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho nghiên cứu 42 Tuy kết nghiên cứu đạt có khác biệt so với nghiên cứu trước đây, khẳng định giảo cổ lam có khả rễ trình nuôi cấy in vitro để phục vụ cho nhân giống loài Như với số rễ/cây tốt đạt 4,16 rễ môi trường MS có bổ sung IBA 0,1mg/l nghiên cứu lựa chọn cho nghiên cứu rễ a b d c e Hình 4.5: Rễ Giảo cổ lam môi trƣờng MS có bổ sung 0,1mg/l IBA a, Đối chứng rễ nhỏ, ngắn b, IBA 0,1mg/l rễ khỏe, dài c, IBA 0,2mg/l rễ khỏe, dài d, IBA 0,3mg/l rễ khỏe, dài e, IBA 0,4mg/l rễ nhỏ, ngắn 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau nghiên cứu thời gian khử trùng, khả tái sinh, nhân nhanh Giảo cổ lam môi trường MS, ½MS chất kích thích BA, Kinetin, NAA, IBA đưa kết luận sau: - Khử trùng Giảo cổ lam HgCl2 0,1% phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu sống 86,67% - Môi trường thích hợp cho tái sinh chồi Giảo cổ lam: MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 86,67% - Môi trường thích hợp cho cảm ứng chồi Giảo cổ lam: MS + đường 30g/l + agar 5g/l bổ sung Kinetin với hàm lượng 0,5 mg/l, pH: 5,6-5,8, với tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 100% - Môi trường nhân nhanh: + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l bổ sung Kinetin với hàm lượng 0,5mg/l kết hợp với BA hàm lượng 0,5mg/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi đạt 4,36 lần với chất lượng chồi nhỏ, xanh + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l + Kinetin 0,5 mg/l kết hợp với NAA hàm lượng 0,2mg/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi cao 3,33 lần, chất lượng chồi nhỏ, xanh - Môi trường rễ: MS + đường 30g/l + agar 5g/l bổ sung IBA với hàm lượng 0,1 mg/l, pH: 5,6-5,8 khả rễ tốt với số rễ/cây 4,16 rễ 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khác chất khử trùng đến hiệu tạo vật liệu - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu (khoai tây, cà dốt, nước dừa) đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thị Thuý Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Hà Thanh Bình, Nguyễn Tất Cảnh, Phùng Đăng Chinh, Nguyễn Ích Tân (2002), Trồng trọt đại cương, NXB Nông Nghiệp Bộ Khoa Học Công Nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu tập I, 126 – 143, 259 – 289 Bộ môn Thực vật (2004), Thực vật Dược phân loại thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Bô ̣ Y Tế , Hội nghị tổng kết 20 năm bảo tồn gen dược liệu Tam Đảo, Bộ Y tế 06/5/2009 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 308, 309 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 1322, 1323 Lê Văn Cường (1998), Góp phần nghiên cứu Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makinio Cucurbitaceae,Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học – trường Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Ngiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Trường Đại học Dược hà Nội 11 Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, Nxb giáo dục 12 Dược điển Việt Nam IV, 2009 xuất lần thứ tư Phụ lục 5.4 Hà Nội 13 Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học - Trường Đại học Dược Hà Nội 14 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, I, 563, 567 15 Nguyễn Thị Hòa, Nguyễn Bá Hoạt (2001), Công trình NCKH 1987 2000 Viện dược liệu, NXBKH & KT 16 Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội 17 Phạm Thanh Kỳ chủ biên (2006), Thực tập dược liệu hóa học, trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội in 18 Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2007), Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch dược liêu Giảo cổ lam (cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makinio,Tạp chí thông tin Y Dược số 24 19 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB y học 20 Ngô Quốc Luật, Vũ Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Bình (2010), Biện pháp nhân giống vô tính chất lượng hạt giống dền toòng Tạp chí dược liệu, tập 15, số 1/2010, trang 21 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân giống in vitro Sa Nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4A), 689-698 22 Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Kim Thanh (2007), Giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng, NXBNN, Hà Nội 23 Phạm Anh Thắng (2001), Một số biện pháp chống thối mầm giống xuyên khung bảo quản thời vụ thích hợp để sản xuất dược liệu Tam Đảo, Công trình NCKH 1987 – 2000, Viện Dược liệu, NXB KH&KT 24 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 25 Trần Đức Thiện, La Quang Độ Trần Quốc Hưng (2010), “Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học số loài Giảo cổ lam (Gynostemma spp) vườn quốc gia Ba Bể, Bắc Kạn”, Tạp chí Nông nghiệp Phái triển nông thôn(Hà Nội), tháng 11/2010, trang 52 26 Hoàng Ngọc Thuận (2000), Nhân giống vô tính ăn (chiết, ghép, giâm cành, tách chồi nuôi cấy in vitro, Nxb Nông nghiệp, Huế 27 Viện Dược Liệu (1993) Tài nguyên thuốc NXB Khoa Học kỹ thuật Hà Nội 28 Viện Dược Liệu (1996), Cây thuốc Việt Nam NXB Khoa Học kỹ thuật Hà Nội 29 Viện Dược Liệu (1998), Điều tra đánh giá dược liệu số vùng trọng điểm tỉnh Lào Cai (Tài liệu nội bộ) 30 Viện Dược liệu (2010), Phương pháp nghiên cứu thuốc từ thảo dược NXB khoa học kỹ thuật hà Nội 31 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục Tài liệu tiếng anh 32 Akihisa, Toshihiro, Tamura (1990), “4α- methyl sterol isolated from Gynostemma pentaphyllum”, phytocchemistry, 29 (5), 1647 - 1651 33 Anchalee Jala and Wassamon Patchpoonporn, (2012) “Effect of BA NAA and 2,4D on Micropropagation of Tiaogulan (Gynostemma pentaphy llum Makino), International Transaction Journal of Engineering, Management 34 Ankang Pharmaceutical Intitution of Beijing Medcal University Promotional meterial, 1999 35 Arichi S, Takemoto T & Uchida Y (1986) Prevention of glucocorticoid side effects by saponin of Gynostemma pentaphyllum, Paten - Japan Kokai Tokyo Koho - 60 105 625 36 Carlson R.F (1964), Dwarf fruit trees, Mich Arg Ext Serv.Bull, pp 432 37 Chen J.C et al (2000), “Therapeutic effect Gypenoside on chronic liver injury and fibrosis by CCl4 in rats”.Am J Chin Med, 28 (2), 175 - 185 38 Cui J., Eneroth., Bruhl J.G (1999), Gynostemma pentaphyllum : “indentification of major sapogenins and differentation from Panax species”, Eur J Pharm Sci, (3), 187 - 191 39 Murashige T and Skoog F (1962), “ A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15(3), p 473-497 40 Vander Zaag D.E Plantes de pomme de terre Sources d’approvisionnement et traitement Brochure de vulgaristion VIVAA 41 Zhang ZH, et al.Propagation of Gynostemma pentaphyllum by tissue culture China J Chinese Materia Medica (1989) 14(6) PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số hình ảnh trình thí nghiệm Đối tượng Tái sinh môi trường Kinetin (sau 20 ngày nuôi cấy) Nhân nhanh (sau 30 ngày) Vật liệu Tái sinh môi trường MS (sau 20 ngày nuôi cấy) Ra rễ (sau 30 ngày) Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu Bảng 4.1: Kết ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1 % đến khả tạo vật liệu vô trùng BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach VARIATE V003 TLMN LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ========================================================================= ==== CT$ 20457.8 6819.25 921.08 0.000 * RESIDUAL 59.2286 7.40358 -* TOTAL (CORRECTED) 11 20517.0 1865.18 -BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMKN FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach VARIATE V004 TLMKN LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ========================================================================= CT$ 13067.9 4355.96 ****** 0.000 * RESIDUAL 29.6581 3.70726 -* TOTAL (CORRECTED) 11 13097.5 1190.68 -BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach VARIATE V005 TLMC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 11984.4 3994.80 539.57 0.000 * RESIDUAL 59.2294 7.40367 -* TOTAL (CORRECTED) 11 12043.6 1094.87 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS 3 3 TLMN 100.000 6.67000 71.1100 4.44667 TLMKN 0.000000 86.6700 20.0000 17.7767 TLMC 0.000000 6.67000 8.89000 77.7767 SE(N= 3) 1.57094 1.11164 1.57095 5%LSD 8DF 5.12268 3.62496 5.12271 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLMN TLMKN TLMC GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 45.557 12 31.112 12 23.334 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 43.188 2.7210 6.0 0.0000 34.506 1.9254 6.2 0.0000 33.089 2.7210 11.7 0.0000 | | | | Bảng 4.2: Kết ảnh hƣởng môi trƣờng MS, 1/2MS đến khả tái sinh Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha nang tai sinh VARIATE V003 TLTS LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ========================================================================= CT$ 416.667 416.667 25.00 0.009 * RESIDUAL 66.6667 16.6667 -* TOTAL (CORRECTED) 483.333 96.6667 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha nang tai sinh MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TLTS 86.6667 70.0000 SE(N= 3) 2.35702 5%LSD 4DF 9.23903 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha nang tai sinh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLTS GRAND MEAN (N= 6) NO OBS 78.333 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 9.8319 4.0825 5.2 0.0088 | | | | Bảng 4.3: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin đến khả cảm ứng chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE anh huong cua nong kinetin den kha nang tai sinh VARIATE V003 TLBC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ========================================================================= CT$ 893.333 223.333 11.17 0.001 * RESIDUAL 10 200.000 20.0000 -* TOTAL (CORRECTED) 14 1093.33 78.0952 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE anh huong cua nong kinetin den kha nang tai sinh MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TLBC 76.6667 83.3333 3 86.6667 100.000 90.0000 SE(N= 3) 2.58199 5%LSD 10DF 8.13594 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE anh huong cua nong kinetin den kha nang tai sinh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLBC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 87.333 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.8372 4.4721 5.1 0.0012 | | | | Bảng 4.4: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin tốt kết hợp với hàm lƣợng BA thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha VARIATE V003 HSNC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 21.2133 5.30333 284.11 0.000 * RESIDUAL 10 186668 186668E-01 -* TOTAL (CORRECTED) 14 21.4000 1.52857 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS HSNC 1.06667 2.20000 3 2.93333 4.36667 3.93333 SE(N= 3) 0.788813E-01 5%LSD 10DF 0.248558 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.9000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.2364 0.13663 4.7 0.0000 | | | | Bảng 4.5: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin tốt kết hợp với hàm lƣợng NAA thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh VARIATE V003 HSNC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 9.41067 2.35267 271.46 0.000 * RESIDUAL 10 866664E-01 866664E-02 -* TOTAL (CORRECTED) 14 9.49733 678381 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS HSNC 1.06667 1.86667 3 2.26667 3.33333 2.90000 SE(N= 3) 0.537483E-01 5%LSD 10DF 0.169363 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.2867 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.82364 0.93095E-01 4.1 0.0000 | | | | Bảng 4.6: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng IBA đến khả rêc Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re VARIATE V003 SRTB LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ========================================================================= CT$ 18.1293 4.53233 283.27 0.000 * RESIDUAL 10 160003 160003E-01 -* TOTAL (CORRECTED) 14 18.2893 1.30638 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS SRTB 1.10000 4.16667 3 3.86667 3.70000 3.13333 SE(N= 3) 0.730304E-01 5%LSD 10DF 0.230121 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SRTB GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 3.1933 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.1430 0.12649 4.0 0.0000 | | | | Phụ lục 3: Môi trƣờng Table 1: Preparation of modified Murashige AND Skoog’s MS medium Bottle I II III Component NH4NO3 KNO3 MgSO4 7H2O MgSO4 4H2O ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O CaCl2.2H2O KI CoCl2.6H2O IV KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O V FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O 82,5 95 37,0 2,23 1,058 0,0025 44,0 0,083 0,0025 17,0 0,62 0,025 2,784 3,724 mg/100ml 100 100 100 100 Amount to take preparation (ml) 20 10 10 Final concentratic (mg/ l) 1.650,0 1.900,0 370,0 22,3 10,6 0,025 440,0 0,83 0,025 10 170,0 6,2 0,25 10 27,85 37,25 Inositol 0,5 2,0 0,1 0,5 100,0 Sucrose 30.000,0 Agar 8.000,0 Vitamin PH Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl Stock Solution (g/l) 5,8 0,5 2,0 0,1 0,5 [...]... dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ cây Giảo cổ lam 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng... Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 3 lá: Gynostemma laxum (Wall.) Cogn - Loài Giảo cổ lam 5 lá: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 7 lá: Gynostemma pubescens (Gagnep) C.Y.Wu - Loài Giảo cổ lam 9 lá: Gynostemma sp Trong hệ thống cây dược liệu Giảo cổ lam với tên Việt Nam chính là Dền toong, tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino Cây có nhiều... chồi Giảo cổ lam được xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo 3.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam - Phương pháp nhân nhanh in vitro Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với hàm lượng BA thích hợp đến khả năng nhân. .. sạch virus và có khả năng nhân nhanh giống sạch bệnh virus Chủ động điều chỉnh được các tác nhân, khả năng tái sinh của cây 18 Tuy nhiên, dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện dạng cây không mong muốn Cây nhân giống in vitro được cung cấp nguồn hydrocacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ kém Đồng thời, cây giống in vitro được nuôi... và phương pháp vô tính hay còn gọi là phương pháp dinh dưỡng – dựa vào khả năng 16 tái sinh của một bộ phận nào đó của cây như lá, thân, rễ, mô hoặc tế bào (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [31] 2.3.1 Nhân giống hữu tính (bằng hạt) Phương pháp nhân giống này cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển Tuy nhiên, một số cây trồng, nếu nhân giống bằng hạt có thể cho những cá thể con không hoàn toàn giống. .. từ Giảo cổ lam được thị trường chấp nhận Tại Hà Nội cũng đã sản xuất dạng trà nhúng Giảo cổ lam Giảo cổ lam là cây thuốc mà nhiều năm trước đây được thu hái tự nhiên nên cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về quy trình trồng để đạt dược liệu Giảo cổ lam có năng suất cao, chất lượng tốt Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu cho thấy: Giảo cổ lam là cây sống lâu năm nhưng nếu trồng để có hiệu quả kinh tế cao... nghiệp 2.3.2 Nhân giống vô tính Phương pháp này sử dụng khả năng tái sinh của các cơ quan dinh dưỡng khác nhau như thân, rễ, lá, mô hay tế bào Nhân giống vô tính bao gồm nhân giống vô tính truyền thống (chiết, ghép, giâm) và nhân giống vô tính in vitro 17 Như vậy, giá trị lớn nhất của phương pháp nhân giống vô tính là duy trì được những tính trạng quý hiếm qua các thế hệ và vì vậy tạo ra khả năng sản... 1997) [7] 2.2.2.2 Cytokinin Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA) Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng... trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con Nhân giống in vitro là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ Phương pháp có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1-10mm Được tiến hành trong môi trường vô trùng nên cây giống tạo... việc nghiên cứu đồng bộ các biện pháp kỹ thuật như về chế độ tưới, phân bón lá, mật độ, che sáng để sản xuất dược liệu Giảo cổ lam có năng suất cao, chất lượng tốt, an toàn vẫn đang là mảng trống trong thực tế hiện nay 23 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu là giống Giảo cổ lam 5 lá (Gynostemma