Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống cây sâm cau (curculigo orchioides gaertn) bằng phương pháp in vitro

HOÀNG THỊ PHƯỢNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU Curculigo orchioides Gaertn BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN

HOÀNG THỊ PHƯỢNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên - 2015

HOÀNG THỊ PHƯỢNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH

SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên - 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành xong đề tài của mình Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình và ThS Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý

báu của Ks Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tới bạn bè và người thân đã động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn

để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Phượng

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Bảng tên hóa chất dùng trong thí nghiệm 22 Bảng 3.2: Bảng tên thiết bị dùng trong thí nghiệm 22 Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau (sau

30 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.2: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau

(sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây

Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng

nhân nhanh cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 35

Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân

nhanh chồi cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của cây Sâm

cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 Bảng 4.7: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của cây Sâm

cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 40

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Hình 2.1 Cây Sâm cau 5

Hình 2.2 Lá Sâm cau 5

Hình 2.3 Hoa Sâm cau 5

Hình 2.4 Quả và hạt Sâm cau 5

Hình 2.5: Một số hợp chất có trong dược liệu Sâm cau [37] 8

Hình 4.1: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 30

Hình 4.2: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung Kinetin ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 32

Hình 4.3: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 34

Hình 4.4: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp Kinetin ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 36

Hình 4.5: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp NAA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 38

Hình 4.6: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung IBA ở các hàm lượng khác nhau(sau 30 ngày nuôi cấy) 40

Hình 4.7: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung NAA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) 41

CV : Coeficient of Variation (Hệ số biến động)

DNA : Deoxyribonucleic Acid

Đ/C : Đối chứng

GA3 : Gibberellic Acid

IBA : β – Indol Butyric Acid

LSD : Least Singnificant Diference Test (Sai khác

trung bình có ý nghĩa giữa các công thức ở mức độ tin cậy 95%)

KIN : Kinetin

MS : Murashige & Skoog (1962)

NAA : α -Napthalene Acetic Acid

TN : Thí nghiệm

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Sâm cau 4

2.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Phân loại 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái học của Sâm cau 5

2.1.4 Giá trị dược liệu của Sâm cau 6

2.1.5 Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau 10

2.2 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào 12

2.3.1 Vật liệu nuôi cấy 12

2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 12

2.3.3 Môi trường dinh dưỡng 13

2.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 16

2.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 17

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 22

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22

3.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 22

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 23

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 23

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 23

3.3 Nội dung nghiên cứu 23

3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau 23

3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 23

3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau 23

3.4 Phương pháp nghiên cứu 24

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau 24

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 25

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau 27

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá 28

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau 29

4.1.1 Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau 29

4.1.2 Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau 31

4.2 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Sâm cau 33

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 33

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 35

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 37

4.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm loại Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau 39

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau 39

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau 39

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHAO

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Sâm cau có nhiều tên như Ngải cau, Cô nốc lan, Tiên mao, với tên khoa học

Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) [17]

Sâm cau là loại cây thân thảo mọc hoang ở những vùng núi rừng tại Việt Nam, Lào, Malysia, Thái Lan, Philippine, Ấn Độ, Trung Quốc [22], [30], [31] Ở Việt Nam Sâm cau phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi, từ Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng đến Tây Nguyên [4]

Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau có tính chất nhầy dịu, tác dụng lợi tiểu,

bổ kích dục, sử dụng chữa trĩ, vàng da, hen suyễn, tiêu chảy Theo y học cổ truyền Trung Quốc gọi tên Sâm cau với tên gọi “Xianmao” được sử dụng như thuốc bổ để điều trị suy giảm thể lực, chữa bệnh hen suyễn, còi, vàng da, tiêu chảy, đau bụng và bệnh lậu, kháng viêm, chống ung thư và tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới [21], [22], [30], [44]

Như vậy có thể nhận thấy rằng, tác dụng chính của S â m c a u là tăng cường sức khỏe và tinh thần, giảm mệt mỏi, tăng sức lực và độ dẻo dai, tăng cường chức năng sinh lý nam giới, củng cố hệ thống miễn dịch,… Trên thị trường nước ngoài đang cho phép bán các chế phẩm có nguồn gốc Sâm cau, chẳng hạn như chế phẩm

“KAMA SUTRA CAPSULE” của hãng Alma Health Care, “STRONG-NITE CAPSULE” của hãng Medimix, „POTENCY PLUS” và “BRAINCARE” của Trung Quốc, “AIPANI KAMON” của hãng Vaipani và "SHARMIOTONE SYRUP” của hãng Sharmila [22] Do giá trị dược liệu lớn vì vậy Sâm cau đã bị khai thác tới mức cạn kiệt trong tự nhiên Do đó việc tìm ra kỹ thuật nhân giống cho đối tượng này trong tự nhiên là rất quan trọng

Theo tài liệu kỹ thuật nhân giống một số loài cây thuốc quan trọng đang được thương mại, công bố ở Ấn Độ đã mô tả, Sâm cau có thể sử dụng nhân giống vô tính bằng phương pháp cắt mầm giâm hom Tuy nhiên, với sự tìm hiểu của chúng tôi chưa có quy trình nào công bố về quy trình nhân giống vô tính Sâm cau bằng

phương pháp cắt mầm giâm hom cũng như bằng hạt Do đó thực tế đang đòi hỏi phải xây dựng được quy trình nhân giống nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, hệ số nhân cao, đem lại hiệu quả kinh tế rõ rệt, để khắc phục hạn chế nhân giống loài cây này trong tự nhiên [23]

Trên thế giới, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Các nghiên cứu đã

khẳng định Sâm cau có thể nhân giống bằng phương pháp in vitro Quy trình nhân

giống đơn giản, hệ số nhân giống cao Và theo các nghiên cứu này cho thấy không

có sự thay đổi về hình thái nuôi cấy so với cây mẹ [30], [34], [41]

Ở Việt Nam, tài liệu nhân giống Sâm cau còn ít và hạn chế chính vì vậy việc

tìm ra quy trình nhân nhanh loài cây quý hiếm này bằng phương pháp in vitro là cần

thiết Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của

chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) bằng phương pháp in vitro”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến

khả năng nhân giống cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) bằng phương pháp in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định loại Cytokinin thích đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau

- Xác định được hàm lượng chất kích thích hợp đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

- Xác định được hàm lượng loại Auxin thích hợp đến khả năng ra rễ cây Sâm cau

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp cho sinh viên củng cố và hệ thống lại kiến thức đã học vào thực tiễn Đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu và công tác sau này

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một báo cáo tốt nghiệp

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xây dựng phương pháp nhân nhanh giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn thiện quy trình nhân nhanh

giống Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống Sâm cau

với số lượng lớn, chất lượng tốt, đồng đều phục vụ cho quy trình sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Sâm cau

2.1.1 Nguồn gốc

Sâu cau đã được ghi nhận trong thực vật chỉ của một số nước từ rất lâu và ở bậc phân loại loài Theo một số tài liệu, Sâm cau phân bố Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Nhật Bản, Úc, các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Thái Lan, Malaysia, v.v [22], [30], [31]

Ở Ấn Độ, Sâm cau được gọi với tên “Golden eye grass” hoặc “Black Musli” Sâm cau là loài thân thảo, thân củ, kích thước nhỏ Sâm cau có nguồn gốc ở vùng rừng chịu bóng ở Châu Á Cây sinh trưởng, phát triển tốt ở vùng đồng bằng nơi đất màu mỡ, ẩm, từ độ cao tới 2300 m so với mặt nước biển và đặc biệt trên khe đá, đất

đá ong ẩm [40], [41], [61]

2.1.2 Phân loại

Theo bảng phân loại của Chauhan và cs (2010) [29], cây Sâm cau được phân loại như sau:

Bảng 2.1: Phân loại cây Sâm sau của Chauhan và cs (2010)

Ngành (Division) Spermatophyta

2.1.3 Đặc điểm hình thái học của Sâm cau

- Đặc điểm của thân rễ

Sâm cau là cây thân thảo sống lâu năm

chiều cao khoảng 20 - 30 cm, có khi hơn Thân

rễ mập, hình trụ dài, mọc thẳng, thóp lại ở hai

đầu chiều dài 2,5 - 5 cm, đường kính 1,0 - 4,5

cm, bề mặt bên ngoài màu nâu đen mang nhiều

rễ phụ có dạng giống thân rễ, bên trong có màu

kem; vị nhầy và hơi đắng [4], [52] Hình 2.1 Cây Sâm cau

- Đặc điểm của lá

Lá mọc thành túm từ thân rễ xếp nếp và

có gân như lá cau, dài 15 - 45 cm, rộng 2,5 - 3

cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần

như cùng nhau, gân song song, bẹ lá to và dài;

cuống lá dài khoảng 10 cm [4], [52]

- Đặc điểm của quả và hạt

Quả nang, thuôn, dài 1,5 - 2 cm, rộng 8

mang 3 - 5 hoa nhỏ, màu vàng; lá bắc hình

trái xoan; đài 3 răng có lông, tràng 3 cánh

nhẵn, nhị 6 xếp thành hai dãy, chỉ nhị ngắn,

bầu hình thoi, có lông rậm [4], [52]

Hình 2.3 Đặc điểm của hoa

2.1.4 Giá trị dược liệu của Sâm cau

2.1.4.1 Giá trị làm thuốc của Sâm cau

Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau có tính chất nhầy dịu, tác dụng lợi tiểu, kích dục, sử dụng trong điều trị bệnh trĩ, vàng da, hen suyễn, tiêu chảy Sâm cau được sử dụng bằng cách giã đắp ngoài để chữa ngứa và bệnh ngoài da Bên cạnh đó Sâm cau còn được sử dụng làm thuốc tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới Trong y học cổ truyền Trung Quốc Sâm cau có tên “Xianmao” được sử dụng như thuốc bổ để điều trị suy giảm thể lực, chữa bệnh hen suyễn, còi, vàng da, tiêu chảy, đau bụng và bệnh lậu, kháng viêm, chống ung thư Nó cũng được sử dụng để làm giảm đau, lợi tiểu, thuốc bổ và tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới [21],

[22], [30], [44], [55]

Tên dược liệu Sâm cau là Rhizoma Curculiginis Theo kinh nghiệm dân gian, thân rễ (hay củ) của cây Sâm cau có vị cay, tính ấm, hơi có độc, bổ thận tráng dương, trừ tê, tráng gân cốt, chủ trị tinh lạnh, liệt dương, đái đục ở nữ, bạch đới, người già đái són, lạnh da, thần kinh suy nhược, phong thấp, lưng gối lạnh đau, vận động khó khăn Sâm cau được phối hợp với các dược liệu khác sử dụng như thuốc điều trị tiêu biểu như trị sốt xuất huyết, chữa tê thấp, đau mình mẩy, chữa cao huyết

áp (tiền mãn kinh), bồi bổ, tráng dương, trị nam tinh lạnh, liệt dương, nữ lạnh tử cung, chữa phong thấp, lưng lạnh đau, thần kinh suy nhược, bồi bổ cho người già, phụ nữ sau sinh, chữa liệt dương do rối loạn thần kinh chức năng, chữa tiêu chảy Sâm cau được thu hoạch quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa thu, bộ phận thu hoạch làm thuốc là thân, rễ mang về cạo sạch vỏ ngoài hoặc để nguyên ngâm nước

gạo để khử độc, rồi phơi hay sấy khô cất sử dụng dần [4]

Trên thị trường nước ta đang cho phép bán các chế phẩm có nguồn gốc Sâm cau, chẳng hạn như chế phẩm “OCHUKIM” sử dụng hỗ trợ điều trị suy giảm chức năng sinh lý cho nam giới, vô sinh, hiếm muộn do tinh lạnh, tinh loãng, ngăn ngừa

và chống lại những bất thường về tinh trùng, giúp bồi bổ sức khỏe, bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lực, giảm căng thẳng mệt mỏi, tăng khả năng làm việc trí óc

và chân tay của tập đoàn Tuệ Linh

2.1.4.2 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Thành phần hóa học của Sâm cau

Các nghiên cứu đã xác định được thành phần hóa học của Sâm cau gồm các chất chính là glycosids, là những chất có hoạt tính dược học chủ yếu của dược liệu Sâm cau Các chất có hoạt tính trong củ Sâm cau được xác định gồm flavones, glycosite, steroids, saponins, triterpenoids và các hợp chất khác trong cây đã được

báo cáo bởi các tác giả (Ajit 2012, Mistra et al 1990, Nagesh 2008, Neema et al

2010, Xu et al 1992) [22], [40], [41], [61] Cho đến nay đã có một số chỉ thị khác

nhau như các chất glycosides được sử dụng làm chất chuẩn góp phần nhận dạng dược liệu Sâm cau [30]

Theo Wealth of India (1950) củ Sâm cau chứa đường tự do (7.56%), mucilage (8.12%), hemicelluloses (12-15%), polysachharides (17.01%) [54] Thành phần hóa học của thân củ Sâm cau đã được công bố bởi nhiều tác giả, bao gồm các nhóm sau:

Nhóm Steroids và triterpenoids: Gồm steroids, sitosterol, stigmasterol [33]

và yuccagenin [58] Trong số 6 triterpenes được chiết tách có 1 triterpene là axit methyl-3-oxo-20-ursen-28-oic [39] và số còn lại là cycloartene như cycloartenol [33], curculigol, curculigenin [60], [61], Curculigenin B và curculigenin C [59]

31-Nhóm Glycosides và saponins: 13 saponins đã được tách chiết và đặc trưng

từ thân củ và đặt tên là các chất phenol A - M curculigosaponins [61], [62] Tiếp đó,

5 chất phenol đã được tách chiết là curculigoside glucopyranosyl benzyl-2,6-dimethoxy benzoate [36], curculigine A và orcinol glucoside [59], corchioside A [33]và flavanone glycoside - I(glycoside–5,7-dimethoxy-dihydromyricetin-3-O-α-L-xylopyranosyl (4-1)-β-D-glycopyranoside

(5-hydroxy-2-O-β-D-Nema và cs (2010) đã chiết tách và nhận biết thêm một chất glycoside mới đặt tên là D-glucopyranosyloxy-5-hydroxybenzyl-2‟,6‟-dimethoxy-3‟-ydroxybenzoate Công thức phân tử được xác định là C22H26O12 [44]

2-β-Nhóm hợp chất chứa Nitơ (Nitrogenous constituents): gồm

N-acetyl-N-hydroxy-2-carbamic acid methyl ester, 3-acetyl-5-carbomethoxy-2H-3, 4, 5,

6-tetrahydro-1, 2, 3, 5, 6-oxotetrazine, N, N, N‟, N‟-tetra methyl succimmide và Lycorine [58]

Ngoài ra, một số chất được xác định có mặt trong cây như glucose, mannose, xylose, glucoronic acid, resin, tannin, fat, tinh bột Hàm lượng tổng số của các chất

này trong củ Sâm cau khoảng 8-9% [30]

Một số phương pháp đã được sử dụng để xác định chất lượng Sâm cau như xác định hoạt chất curculigosidate bằng đo nồng độ 2,6-dimethoxybenzoic axit trong máy sắc khí lỏng cao áp (HPLC), hoặc sắc khí cột, đo mật độ quang ở bước sóng UV 283 nm

Lu và cs (2002) đã xây dựng phương pháp xác định hàm lượng curculigoside

ở Sâm cau (Curculigo orchioides) Hàm lượng curculigoside dao động trong 6 mẫu

phân tích khác nhau thu thập tại tỉnh Quảng Đông từ 0,11% to 0,35% [37]

Một số hợp chất chính có trong dược liệu Sâm cau được thể hiện trong hình 2.5

Tác dụng dược lý của Sâm cau

Hoạt tính bảo vệ gan: Rao và cs (1996) đã cho thấy hoạt tính bảo vệ gan thỏ

chống lại độc tố rifampicin, thioacetamide, galactosomine, carbon tetrachlorite của hoạt chất curculignin A và curculigol chiết tách từ Sâm cau [48] Dịch chiết methanol rễ Sâm cau cũng được phát hiện có tác dụng bảo vệ gan chuột [26]

Hoạt tính chống oxy hóa: Dịch chiết methanol rễ Sâm cau được phát hiện có

tác dụng chống oxy hóa ở chuột [57]

Hoạt tính điều hòa miễn dịch: Bafna và cs (2006) đã thử nghiệm dịch chiết

methamol Sâm cau trên chuột và nhận thấy tăng đáng kể kháng thể trong cơ thể khi

cơ thể nhiễm cyclophosphamide, phản ứng nhạy cảm ở dạng trị hoãn và các mức độ

tế bào máu trắng và phụ thuộc vào liều lượng [25]

Hoạt tính tăng cường chức năng sinh lý: Nghiên cứu đã chứng tỏ dịch chiết

từ cồn có tác dụng kích thích sinh dục đáng kể thỏ đực qua các thông số theo dõi đã

được ghi nhận Ngoài ra, tác dụng tích lũy số lượng tinh trùng in vitro tăng lên đáng

kể so với đối chứng sau 30 phút phản ứng [53] Dịch chiết đông khô của cây cũng cải thiện đáng kể hoạt động tình dục ở liều lượng 200 mg/kg trọng lượng cơ thể [54] Chauhan và Dixit (2008) đã khẳng định dịch chiết cồn ở liều lượng 100 mg/kg trọng lượng chuột trắng có tác dụng tăng cường sinh tinh trùng và tăng cường chức năng sinh lý ở chuột đực [29]

Hoạt tính kháng tiểu đường: Cả dạng dịch chiết nước và cồn đều có hoạt

tính chống tăng đường huyết đáng kể ở thỏ bị tiểu đường so với đối chứng [28]

Hoạt tính chống loãng xương: Dịch chiết Sâm cau có hoạt tính chống loãng

xương ở thỏ đồng thời không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, tăng phospho, canxi và osteoprotegerin trong huyết thanh, giảm liên kết deoxypyridinoline với creatinine, giảm hormone adrenocorticotropic và mức độ corticosterone nhưng không làm thay đổi factor-alpha, interleukin-6, alkaline phosphate ở chuột [27]

Hoạt tính chống hen: Dịch chiết Sâm cau bằng cồn đã có tác dụng chống hen

do ảnh hưởng của histamine ở dê và lợn với nồng độ 100g/ml và 25g/ml tương ứng

Tế bào leucosyte và lymphocyte tăng lên cao nhất (99%) và giảm esinophils tới 0%

ở liều lượng 375 mg/kg trọng lượng cơ thể [45]

Hoạt tính kháng vi khuẩn: Tinh dầu Sâm cau có hoạt tính kháng khuẩn đáng

kể chống lại các chủng vi khuẩn như Bacillus anthracis, B suhtilis, Salmonella

pullorum, v.v và nấm như Fusarium monili forme, F solani, v.v [35] Singh &

Gupta (2008) đã chứng minh tác dụng kháng vi sinh vật do tác dụng của chất saponin trong dịch chiết [50]

Hoạt tính chống ung thƣ: Dịch chiết Sâm cau đã được phát hiện có tác dụng

ức chế tế bào ung thư phổi dòng tế bào MCF-7 [50]

2.1.5 Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau

Cây Sâm cau được nhân giống bằng hạt và sinh trưởng chỉ diễn ra vào mùa mưa, tỷ lệ cây tạo hạt và khả năng nảy mầm rất thấp nên đã làm giảm số lượng cá thể loài trong tự nhiên Đồng thời khai thác quá mức trong thời gian qua đã dẫn đến tình trạng nguy cấp hiện nay của loài cây này ở nhiều nước như Ấn Độ, Trung Quốc v.v [24], [41]

Sâm cau được nhân giống trong tự nhiên bằng hạt hoặc bằng tách mầm Thời

vụ thích hợp nhất trồng là mùa xuân, các mùa khác trồng cây cần chăm sóc nhiều hơn Sâm cau là loài cây sống rất khỏe, lá xanh tốt quanh năm vì thế có thể trồng trong chậu làm cây cảnh Nếu trồng trong đất, có thể trồng với khoảng cách 30 x 40

cm hoặc 30 x 50 cm [4]

2.2 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ các quá trình nuôi cấy vô in vitro các bộ

phận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…[8]

Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều

do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào tạo thành Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó xây dựng lại toàn bộ cơ thể [8]

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kì (đã biệt hóa) của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh”

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein - enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” [12]

Tính toàn năng của tế bào thực vật mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở

lí luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [12]

2.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Theo PGS.TS Nguyễn Quang Thạch (2005) [11]: Cơ thể thực vật trưởng thành

là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa)

Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể

Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá

trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngược lại với phân hóa tế bào Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng biểu đồ:

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ

sở tính toàn năng của tế bào thực vật [12]

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào

2.3.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống in

vitro Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết Đối với cây Sâm

cau, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có thể là chồi đỉnh, đỉnh sinh

trưởng, hoặc đoạn thân, rễ Các vật liệu này cần được đảm bảo vô trùng trước khi

tiến hành nuôi cấy in vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay

là sử dụng các chất hóa học Đối với các thí nghiệm nuôi cấy Sâm cau in vitro, tôi

sử chồi đỉnh đã qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro

2.3.2 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô

trong quá trình nuôi cấy in vitro Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là ba điều

kiện có vai trò quan trọng nhất [12]

- Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn định ở 25 -

27oC, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin [18]

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa

Tế bào giãn

- Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12 - 18h/ngày Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 -

10000 lux [19]

- Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%

2.3.3 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết và là yếu tố quyết định đến quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [19] Hầu hết các môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau:

- Nguồn cacbon: Là yếu tố quan trọng hàng đầu đối với sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy, được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường đã hòa tan

Hiện nay, trong nuôi cấy in vitro người ta thường sử dụng đường saccarose, một số

trường hợp có thể sử dụng glucose và fructose thay thế [12]

- Muối khoáng đa lượng, vi lượng: Các nguyên tố khoáng đa lượng là một trong những thành phần thiết yếu cần cho việc cung cấp nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình Đặc biệt, nó có vai trò quan trọng tham gia vào thành phần axit nucleic, axit amin, tham gia cấu tạo màng tế bào, [12] Bên cạnh đó khoáng đa lượng, khoáng vi lượng có vai trò kích thích sự hoạt động của nhiều enzyme và xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào

Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp chủ yếu là nitơ, phospho, kali và sắt [19]

Các loại muối khoáng vi lượng: Là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng

minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme [12]

- Các vitamin: Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng Do đó, trong quá trình

nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được sung vào môi trường với thích hợp Đặc

biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 Trong đó, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật [18]

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có cao từ 500 đến 1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0oC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng [12]

- Các chất điều hòa sinh trưởng: Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy mô là các chất điều hòa sinh trưởng Đó là yếu tố quan trọng nhất trong điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh các bộ phận của mẫu cấy để trở thành cây hoàn chỉnh Hiệu quả sử dụng của chất điều tiết sinh trưởng phụ thuộc vào: sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng, mẫu nuôi cấy Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thưởng thường sử dụng 3 nhóm chất chính là: Auxin, Cytokinin, Gibberellin [18], [19]

+ Nhóm Auxin

Là chất kích thích sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sự giãn của tế bào làm tăng phân bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất hiện rễ bất định Bốn loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô là: Indolylacetic acid (IAA); Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4-Dichlorphenoxy acetic acid (2,4-D); Indol butyric acid (IBA).Trong đó IAA là auxin tự nhiên, NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân tạo Các auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh hơn, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên các auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme IAA

ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, thường dùng ở khá cao: 1,0 - 30

mg/l Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,001 - 10 mg/l Chúng có hiệu quả sinh lý ở thấp [18], [19]

+ Cytokinin

Cytokinin liên quan đến sự phân chia tế bào, sự phân hóa chồi bất định Trong môi trường nuôi cấy mô, Cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ cụm mô sẹo hoặc từ các cơ quan, tăng cường phát sinh chồi phụ Các Cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy bao gồm: Kinetin (6-furfurylaminopurine); BA (6-benzylaminopurine) [18]

Hàm lượng Cytokinin sử dụng thường dao động từ 0,5 - 5,0 mg/l Tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo [19]

Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và Cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào

và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/Cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ

lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và Cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của Cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là Cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển [1], [20]

+ Gibberellin

Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều dọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ

Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây [18]

- Aga: Đây cũng là một trong những thành phần có vai trò cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy Đặc biệt, trong nuôi cấy tĩnh aga có tác dụng làm rắn hóa môi trường nuôi cấy Aga thường dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là từ 0,4 - 0,8% [12]

- pH: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất rõ đến khả năng duy trì trao đổi các chất trong tế bào Thông thường trong môi trường nuôi cấy pH thích hợp nhất là 5,6

- 5,8 [12]

2.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo PGS.TS Ngô Xuân Bình và cs [1]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro

Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ

lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của

mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/Cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hoá

- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, Cytokinin, …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra

rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh

Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

- Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng

của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển

cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất

2.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy

mô trên thế giới và Việt Nam

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu nuôi cấy mô: Cây Sâm cau- loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng

do số lượng quần thể đang bị suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên bởi một số nguyên nhân sau:

- Có giá cao trên thị trường

- Hạt giống nảy mầm kém

- Tỷ lệ cao của bệnh do virus và vi khuẩn ảnh hưởng đến thân rễ

- Sử dụng các thân rễ như loại thức ăn của nhiều người dân tộc, bộ lạc

- Sói mòn rộng rãi của các tầng rừng, do chăn thả gia súc và lá rụng

Trong thời gian hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để phát triển các phương pháp vi nhân giống cho cây Sâm cau Nhân giống quy mô lớn thông qua các chồi hình thành trực tiếp từ cấy mẫu lá trong bình lắc là một phương pháp để khắc phục những vấn đề của sự suy giảm số lượng Sâm cau [52]

Nema và cs (2008) cho rằng Morphactin và Cytokinin thúc đẩy mạnh sự hình thành chồi từ nuôi cấy lá non của Sâm cau trong hệ thống nuôi cấy lắc [43]

Wala và Jasrai (2003) thu được nhiều chồi từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh vào môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung thêm 6-benzyladenine (BA 2,21 μmol/l) Các chồi của Sâm cau trên môi trường 1/2 MS cơ bản có bổ sung NAA (0.53 μmol/l) Sau đó, chuyển cây con sang chậu có chứa hỗn hợp của cát và đất (1: 1) cho thích nghi trong thời gian 2 - 3 tuần Sau khoảng thời gian 3 tháng đã thu được trung bình 125 cây từ mô phân sinh duy nhất [58]

Vi nhân lá của Sâm cau trên môi trường MS mà không có Cytokinin tạo ra một số lượng hạn chế cây con từ cuống gân lá BA (0,44 - 5,66 mol/l) cần thiết

để sản xuất cây con từ thân rễ mẫu cấy Nồng độ cao của BA (2,22 - 4,44 mol/l) tạo mô sẹo dạng nốt và chuyển sang môi trường không có Cytokinin hình thành chồi [24]

Francis và cs (2007) phương pháp cho hiệu quả nhân giống vô tính Sâm cau trong ống nghiệm là phương pháp thông qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh Nhiều chồi đã tạo ra từ đỉnh sinh trưởng phát triển trên môi trường MS cơ bản có bổ sung

BA 1,5 mg/l, adenine sulfate 100 mg/l và sucrose 3% Bao gồm các axit butyric (IBA) hoặc indole-3-acetic acid trong môi trường nuôi cấy nâng cao sự hình thành chồi Hệ số nhân cao nhất của nhân giống đã thu được trên môi trường MS có

indole-3-bổ sung BA 1,5 mg/l, adenine sulfate 100 mg/l, IBA 0,25 mg/l và sucrose 3% Rễ

đã đạt được khi chuyển các chồi đến môi trường 1/2 MS có chứa IBA 0,25 mg/l và sucrose 2% Cây con đã cứng trong nhà kính và thành công khi trồng trong đất [32] Thomas (2007) quan sát thấy rằng cấy trực tiếp mẩu lá trên môi trường MS có

bổ sung khác nhau của benzylaminopurine (BAP) (2 - 8 μmol/l) hoặc thidiazuron (TDZ) (2 - 8 μmol/l) hoặc kết hợp với axit naphthalenacetic (NAA) (0,5 và 1,0 μmol/l) tạo ra chồi cảm ứng thấp cả về tỷ lệ phần trăm phản ứng và số lượng chồi trên mẫu cấy Do đó, lá đã được tiền xử lý với 15, 25 hoặc 50 μmol/l TDZ trong 6,

24 hoặc 48 h với mục tiêu nâng cao chồi từ nuôi cấy Tiền xử lý mẫu cấy với 15 μmol/l TDZ trong 24h thúc đẩy lớn sự hình thành phát sinh chồi và đạt cao nhất trên môi trường MS có bổ sung TDZ 6 μmol/l [56]

Nagesh (2008) nuôi cấy Sâm cau từ đỉnh sinh trưởng và thân rễ cho hệ số nhân chồi cao trên môi trường kết hợp giữa BAP và kinetin tỉ lệ 1 mg/l Tuy nhiên nuôi cấy

từ thân, rễ cho kết quả nhân nhanh chồi tốt nhất [44]

Shende và cs (2012) hiện nay phương pháp hiệu quả để nhân giống in vitro là

sử dụng kết hợp các khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật phát sinh chồi, mô sẹo và cảm ứng rễ và cuối cùng thích nghi chuyển vào đất Thu được nhiều chồi từ thân, rễ nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP 0,25 mg/l và và KIN 0,50 mg/l Sự kết hợp của BAP 1,50 mg/l và IAA 0,25 mg/l phù hợp cho sự hình thành mô sẹo tốt nhất, trong khi phản ứng của sự kết hợp của 0,50 mg/l BAP + 1,00 mg/l NAA và 0,50 mg /l Kinetin + 1,00 mg/l NAA hình thành ít mô sẹo Rễ hình thành tốt trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/l NAA và MS có bổ sung 0,50

mg/l IAA tương ứng Cây con in vitro nuôi đã được chuyển sang chậu có chứa một

hỗn hợp cát: đất: phân theo tỉ lệ 1: 1: 1 (w/w) trong nhà lưới để thích nghi với thời gian 2 - 3 tuần Sau khi thích nghi, các cây đã được chuyển ra đất và đạt được tốc độ tăng trưởng bình thường [49]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Sâm cau là loài cây thuốc sinh trưởng và phát triển tốt ở nước ta và thường gặp ở dạng hoang dại Chỉ có nghiên cứu nhân giống loài cây này bằng nuôi cấy mô

tế bào, chưa có nghiên cứu nào đề cấp đến quy trình nhân giống bằng hạt và mầm loài cây này Vì vậy, trong những năm gần đây, khai thác dược liệu Sâm cau khá

lớn tuy nhiên chủ yếu từ tự nhiên, trong khi công tác trồng trọt chưa được quan tâm, Sâm cau đã trở nên hiếm gặp ở nước ta Căn cứ vào kết quả điều tra thực tế, từ năm

1996 đến nay loài Sâm cau được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam Loài cây này luôn được xếp vào nhóm những loài cây thuốc bị đe dọa, cần ưu tiên bảo tồn ở Việt Nam (Nguyễn Tập và CS, 2001) [9]

Khi tổng hợp thông tin từ các tài liệu đã công bố ở trong nước đã cho thấy, mặc

dù theo kinh nghiệm dân gian Sâm cau đã được dùng để làm thuốc nhưng cho đến nay ở Việt Nam còn rất ít nghiên cứu về Sâm cau Mặc dù đã có thuốc dạng thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ Sâm cau, song chưa có nghiên cứu chỉ ra cơ sở khoa học như chất chỉ thị đặc trưng nhận biết Sâm cau Việt Nam, hàm lượng hoạt chất, tác dụng sinh học cũng như vùng sinh thái trồng thích hợp cho hoạt chất cao Năm 2001, Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phương Lan đã nghiên cứu về

cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn), đã nhận dạng được loài Sâm cau mọc

hoang ở Sơn Dương- Tuyên Quang, Hà Giang và nghiên cứu về thành phần hóa học

và tác dụng antioxidant và tăng lực của rễ Sâm cau Họ đã sơ bộ kết luận rễ Sâm cau Việt Nam chứa phytosterol, đường khử, saponin, chất béo, carotene và phân lập được polyphenol Kết quả nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết polyphenol toàn phần

(5%/nước) có tác dụng chống oxy hóa in vitro tương đối cao (64,1%) và tăng lực

đối với chuột cống trắng ở liều 0,229g/kg chuột [13]

Nguyễn Thị Út và cs (2010) nghiên cứu “Ảnh hưởng của chất kích thích sinh

trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau (Curculigo Orchioides

gaertn)” Kết quả cho thấy 6-benzyladenine (BA), Kinetin (Ki), BA + Ki đến khả

năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau từ chồi đỉnh Số chồi phát sinh cao nhất

trên môi trường MS bổ sung tổ hợp 1.0 mg/l BA + Ki [17]

Võ Châu Tuấn và cs (2011), “Nhân giống in vitro cây Sâm cau (Curculigo

orchioides Gaertn)- Một loài cây thuốc quý”, nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng

chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau Tiến hành tái sinh chồi đỉnh trên môi trường MS bổ sung BA 4,0 mg/l Đỉnh sinh trưởng (dài khoảng 1 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung Kinetin, BA, Kinetin +

trường MS bổ sung IBA 1,0 mg/l + BA 2,5 mg/l Chồi được tạo rễ trên môi trường

MS bổ sung IBA hoặc IBA + BA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ

sung IBA 0,75 mg/l và NAA 0,75 mg/l với tỉ lệ 1:1 Cây in vitro đưa ra nhà lưới,

86% cây sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên [16]

Một số nghiên cứu về dược lý trên mô hình chuột nhắt trắng tại Trung tâm Sâm và dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh đã được công bố như sau:

Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm của chế phẩm “Kỷ thược địa hoàng gia vị” theo hướng tăng cường thể trạng và chức năng gan [7]

Trần Mỹ Tiên, và cộng sự (2008) đã ứng dụng kỹ thuật ELISA định lượng testosteron trong nghiên cứu tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nam của cây gai chống (Tribulus terrestris L Zygophylaceae) [14]

Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác dụng của bài thuốc dân tộc “AMA KONG‟ đến tăng cường chức năng sinh dục nam ở chuột nhắt trắng [6]

Trần Mỹ Tiên và cộng sự (2012) đã khảo sát tác dụng hướng sinh dục nam từ dịch chiết cồn của rễ Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) trên chuột nhắt trắng [15]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Cây Sâm cau thu thập từ tỉnh Bắc Giang

Vật liệu nghiên cứu: Chồi đỉnh của cây Sâm cau

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng loại Auxin thích hợp đến khả năng ra rễ cây Sâm cau

3.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

3.1.3.1 Hóa chất

Bảng 3.1: Bảng tên hóa chất dùng trong thí nghiệm

1 Hóa chất khử trùng ( cồn 70 %, HgCl2 0,1 %) Việt Nam

2 Các chất điều hòa sinh trưởng: BA (Duchefa), Kinitin (Duchefa), IAA

(Biobasic), NAA (Biobasic)

3 Môi trường MS cơ bản

5 Đường sucrose (Việt Nam)

6 Aga (Việt Nam)

3.1.3.2 Thiết bị

Bảng 3.2: Bảng tên thiết bị dùng trong thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất, nước sản xuất

Tủ cấy vô trùng cấp II Airtech, Hàn Quốc

Nồi hấp khử trùng ALP, Nhật Bản

- Ngoài ra, còn rất nhiều trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm của Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, bộ môn Công nghệ Sinh học

Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2014 đến tháng 5/2015

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau

- Thí nghiêm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin (KIN) đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau

3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến

khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau

3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ

cây Sâm cau

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra

rễ cây Sâm cau