nguồn thu nhận protein

Nguồn thu nhận protease Trường đại học bán công Tôn Đức Thắng Khoa khoa học ứng dụng Ngành công nghệ sinh học -o0o - Siminar: NGUỒN THU NHẬN PROTEASE GV hướng dẫn: Nguyễn Thò Thu Sang Nhóm thực hiện: Nguyễn Duy Hà Ngô Thò Minh Huệ Nguyễn Thò Thu Hà Năm 20 Nguồn thu nhận protease Lời giới thiệu Protease chất xúc tác thủy phân protein tạo thành phân tử thấp amino acid Chúng ý nghóa cho trình sinh trưởng, sinh sản sinh vật mà đóng vai trò quan trọng công nghệ chế biến thực phẩm, y học, công nghệ gen bảo vệ môi trường Nghiên cứu, sản xuất enzym ứng dụng enzym phát triển mạnh từ đầu kỷ 20 đến Ở nước ta công nghiệp enzym chưa thực phát triển có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzym Có nhiều loại enzym sản xuất sản xuất nhiều enzym protease Cuốn tài liệu giới thiệu với bạn nguồn thu nhận enzym protease công nghệ sản xuất enzym Nó dựa kiến thức liệu từ sách Công nghệ enzym Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzym Nguyễn Trọng Cẩn internet Do tài liệu hạn hẹp nên trình bày sách không đầy đủ lắm, mong bạn thông cảm góp ý để đầy đủ Nhóm thực Nguồn thu nhận protease MỤC LỤC A Tổng quan enzym protease .2 I Đặc điểm chung protease II Phân loại protease III Quy trình chung thu nhận protease B Thu nhận protease từ nguồn thực vật I Thu nhận bromelin từ dứa Sơ lược enzym bromelin Nguồn nguyên liệu .4 Phương pháp thu nhận bromelin II Thu nhận papain từ đu đủ Sơ lược enzym papain Nguồn nguyên liệu .10 Phương pháp thu nhận papain 10 III Thu nhận ficin từ sung .17 Sơ lược ficin 17 Nguồn nguyên liệu .17 Phương pháp thu nhận ficin 17 C Thu nhận protease từ nguồn động vật .21 I Một số tính chất protease 21 Pepsin 21 Rennin 26 Pancreatin 28 Trypsin 28 Chymotrypsin 30 II Nguồn nguyên liệu 31 Pepsin 31 Rennin 32 Trypsin Chymotrypsin 33 III Phương pháp thu nhận protease .33 Pepsin 33 Rennin 38 Pancreatin 40 Chymotrypsin 42 D Thu nhận protease từ nguồn vi sinh vật .43 I Đặc tính protease vi sinh vật .43 II Nguồn vi sinh vật .45 III Nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy .46 IV Phương pháp thu nhận protease .47 E Kết luận Nguồn thu nhận protease A TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE [1] I ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA PROTEASE Protease nhóm enzym xúc tác thủy phân liên kết peptide, Là liên kết chủ yếu phân tử protein peptide Cơ chế thủy phân sau: Thường protease thể tồn dạng không hoạt động (zymogen) trở thành hoạt động protease tương ứng tác động cắt đứt hay số liên kết peptide phân tử nó, thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động Cấu trúc bậc bốn phân tử protein ảnh hưởng đến trình phân giải chất tác dụng protease Dạng monomer dimer chất dễ phân giải dạng tetramer II PHÂN LOẠI Với enzym protease có nhiều cách phân loại ta dựa vào hai đặt điểm sau để phân lọai chúng: Dựa vào vò trí tác dụng protease lên peptide phân tử protein, người ta chia protease làm nhóm chính: -Endopeptdase (proteinase): chủ yếu phân giải liên kết peptide nằm phân tử protein tạo thành đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton…) -Exopeptidáe (polypeptidase): chủ yếu phân cắt peptide hai đầu mạch Ví dụ: nhóm carboxypeptidase amimopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu mạch polypeptide có nhóm carboxyl amine tự Ngoài có dipeptidase phân giải dipeptide thành animo acid tự Dựa vào thành phần amimo acid vùng pH tối ưu protease, người ta chia làm nhóm: -Protease acid: pepsin, rinin, … hoạt động vùng pH acid -Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động vùng pH kiềm -Protease trung tính: papain, … hoạt động vùng pH trung tính III QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEASE Trong sản xuất chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu Protease thô tinh protease Thu chế phẩm protease thô: Tùy theo nguồn thu nhận mà ta áp dụng kỹ thuật khác để thu nhận protease thô Với nguồn động vật thực vật ta nghiền , trích ly ly tâm Còn với nguồn vi sinh vật ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào đem ly tâm Trong chế phẩm protease thô chứa nhiều vật chất protease như: nước, protein protease, sinh khối tế bào, thành phần môi trường chưa đồng hóa hết, sản phẩm trình đồng hóa tế bào… - Tinh protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần thành phần proteasera khỏi thành phần protease Sản phẩm cuối protease tinh khiết Nguồn thu nhận protease Cơ quan, tế bào ĐV Cơ quan, tế bào thực vật Vi sinh vật Nghiền Nuôi cấy (lên men) Trích ly Enzym nội bào Enzym ngoại bào Phá vỡ tế bào Lọc ly tâm Cô đặc Tinh chế Sấy Sản phẩm protease Quy trình chung thu nhận protease B THU PROTEASE TỪ NGUỒN THỰC VẬT Một số protease phổ biến thu từ nguồn thực vật: bromelin, papain, ficin … I THU BROMELIN TỪ CÂY DỨA Sơ lược enzym bromelin [1] a- Cấu tạo Bromelin protease, khác với papain, ficin chỗ glycoprotein, phân tử có glycan gồm maltose, glucosamine, xylose fructose Thành phần amino acid thay đổi khoảng 321 – 144 amino acid Bromelin có trung tâm hoạt động chứa cysteine hai sợi polypeptide liên kết với cầu nối -S-S- Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu hoạt tính xúc tác phân tử có tất cầu nối disulfite b- Hoạt tính Hoạt tính bromelin nhóm sulfhydryl trung tâm hoạt động đònh Bromelin có hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase esterase Nguồn thu nhận protease Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin: chất, nồng độ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết … - nh hưởng chất: loại chất khác nhau, bromelin có hoạt tính khác - nh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ phản ứng xúc tác chòu ảnh hưởng nhiều yếu tố: thời gian tác dụng dài nhiệt độ có thay đổi;àm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, nồng độ enzym, nồng độ chất, dạng tồn enzym - nh hưởng pH: pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác bromelin pH tối thích bromelin không ổn đònh mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, chất nồng độ chơ chất, độ tinh enzym, chất dung dich đệm, diện chất tăng hoạt - nh hưởng ion kim loại: ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym chúng thường gắn vào trung tâm hoạt động enzym Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzym bromelin mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối Nguồn nguyên liệu [4] Enzym bromelin thu từ nguồn nguyên liệu dứa ( Ananas comusus ) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromelinaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, nước ta loại dứa trồng nhiều Ananas comusa sử dụng làm nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, dược, mỹ phẩm nguồn thu nhận enzym bromelin Bromelin có nhiều thân dứa Thòt dứa có hoạt tính enzym bromelin kể từ ba tháng trước chín, hoạt tính bromelin cao khoảng 20 ngày trước chín, thu hoạch trái dứa vào khoảng thời gian cho suất enzym cao Bromelin thân thu từ dòch rút từ thân dứa, trung bình thu 3,6kg bromelin từ 378 lít nước rút từ thân dứa Phương pháp thu nhận enzym bromelin [1] Việc thu nhận tinh bromelin thực theo sơ đồ sau: Bã Thân /quả dứa Xay nhuyễn Dòch lọc Lytâm Dòch ly tâm Kết tủa Enzym tinh khiết Tinh Sấy khô Chế phẩm bromelin thô Quy trình tổng quát thu nhận tinh enzym bromelin Nguồn thu nhận protease 3.1 Thu dòch enzym thô Quả hay thân dứa xay nhuyễn, vắt kó, lọc bỏ bã thu dòch lọc, ly tâm dòch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ chất xơ thu dòch chiết có chứa bromelin Tuy nhiên sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh enzym bromelin hợp chất pectin dòch chiết làm tăng độ nhớt dòch chiết làm trở ngại cho trình lọc Các nhà khoa học S.Sathivel, K.Niranjan W.Prinyawiwatkul tìm phương pháp đồng hóa nguyên liệu điều kiện áp suất cao phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt dòch chiết, phóng thích enzym nội bào mà không làm chúng biến tính, làm tăng sản lượng hoạt tính enzym bromelin 3.2 Các phương pháp tách bromelin PHẾ LIỆU CỦA THỊT QUẢ DỨA Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức Mô ly tâm , làm lạnh 0-40C DUNH DỊCH NƯỚC DỨA PHƯƠNG PHÁP TỦA Aceton lạnh (4:1) PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ aceton lạnh (20% 1:1) (NH4)2SO4 (70% bão hoà) Dòch cô đặc khuấy 30 phút Làm lạnh hỗn hợp trong4-5 Làm lạnh hỗn hợp PHƯƠNG PHÁP SIÊU LỌC Dòch thấm qua (làm siro,rượu thu citric acid) Để hỗn hợp nhiệt độ phòng 30 phút Cô nóng Ly tâm bỏ tủa Aceton lạnh Aceton lạnh (2:1) (2:1) Làm lạnh Ly tâm thu tủa Sấy khô Ly tâm thu tủa Sấy khô Ly tâm Dung dòch thu tủa nước chứa Ly tâm thu tủa Rửa tủa với aceton lạnh Ly tâm thu tủa Sấy khô Sấy khô Sấy khô Nguồn thu nhận protease BRO-EtOH BRO-A BRO-N BRO-K Các trình thu nhận bromelin BRO-SL(1) BRO-SL(1) a- Phương pháp kết tủa Nguyên tắc: Điểm đẳng điện đa số protein thấp pH =7, điều kiện sinh lí, phân tử protein có tích điện âm thừa điện tích âm thừa kết hợp với đầu mang điện tích dương cuẩ phân tử nước ion dương Sự kết hợp với nước tạo lớp áo nước bao quanh protein cản trở kết tủa chúng Do đó, để kết tủa enzym, ta phải phá vỡ lớp áo nước cách bổ sung vào dung dòch enzym dung môi hay hoá chất ưa nước có lực với nước mạnh protein để kéo nước khỏi phân tử protein, giúp protein kết tủa Dung môi thường dùng để kết tủa bromelin acetone, ethanol muối amonium sulfate Cách làm: - Tủa muối amonium sulfate: chuẩn bò lít nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào khuấy ( dung dòch đạt độ bão hoà ammniun sulfate 70% ) Để yên nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút để thu nhận tủa - Tủa ethanol: làm lạnh dung dòch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96 ( làm lạnh ) theo tỉ lệ 4:1 ( nước dứa, ethanol ), trộn đều, để nhiệt độ 00Ctrong – Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút phút Rửa tủa acetone thu nhận tủa - Tủa acetone: thêm thể tích acetone lạnh 20% acetone lạnh vào thể tích nước dứa sau ly tâm Để yên nhiệt độ – 0C Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút phút , lọai bỏ tủa thêm hai thể tích acetone lạnh vào , để – 40C, ly tâm thu tủa rửa tủa acetone lạnh b- Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất sử dụng để làm chất hấp phụ enzym, phổ biến kaolin betonite Trình tự thực tương tự Cấu tạo kaolin: kaolin khoáng vật sét có khả hấp phụ tốt Kaolin có cấu tạo thành lớp, lớp có tứ diện SiO 4- bát diện Al(OH)6-3, đỉnh chung tứ diện quay bát diện vò trí chung ion OH - bát diện thay ion O 2- tứ diện vò trí hai lớp sát cạnh nhau, ion O2- bề mặt lớp nằm gần ion OH - bề mặt lớp làm xuất liên kết hidrogen giữ ion trái dấu làm cho lớp kaolin dính sát lại gần (khoảng cách hai lớp 7,1A0) Kaolin có cấu tạo thành lớp có độ phân tán cao, chúng có tính dẻo đặc biệt có khả tạo hình kết dính Một tính chất quan trọng kaolin có độ phân tán cao nên có ảnh hưởng đến hấp phụ chất Kaolin chất có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ 1µm diện tích tiếp xúc hạt kaolin chất bò hấp phụ tăng lên nhiều Một lý khác dẫn đến khả hấp phụ vật chất kaolin cao bề mặt kaolin có nhiều ion OH- O2-, ion có khả liên kết tương đối bền vững với chất bò hấp phụ Nguồn thu nhận protease Cách làm: cho kaolin khô (hoặc ngâm cho trương nở) vào dung dòch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dòch nước dứa Khuấy máy khuấy từ, sau ly tâm để thu tủa Tủa gọi bromelin-kaolin c- Phương pháp siêu lọc Siêu lọc trình dung dòch lỏng chảy qua màng lọc áp suất để tách phân đoạn thành phần chất lỏng Sự phân chia phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ màng trọng lượng phân tử chất thấm qua Tuỳ theo kích thước lỗ màng mà sau thực trình siêu lọc thu nước chất có phân tử nhỏ, phân tử lớn bò giữ lại màng Dung dòch enzym sau thu từ nguyên liệu thực vật có chứa tạp chất có trọng lượng phân tử khác Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại bỏ chất bẩn Sau chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc loại chất có trọng lượng phân tử thấp protein enzymvà đồng thời cô đặc enzym Phương pháp siêu lọc sử dụng ngành công nghệ thực phẩm trình sản xuất sinh học để tách chất dễ bò biến tính nhiệt lọc ổn đònh rượu vang, lọc nước ép trái cây, cô đặc sữa làm phômai, làm bơ, cô đặc lòng trắng trứng, cô đặc huyết động vật, cô đặc tinh chất pectin, gum, gelatin …cô đặc tinh enzym, kháng thể, polysaccharide, polypeptide, vaccine, …thu hồi protein carbonhydrate từ nước thải sản phẩm phụ … Màng siêu lọc:được cấu tạo sợi rỗng Trong sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song gắn chặt với lớp tạo lỗ để chất thấm qua Các sợi chế tạo từ loại polymer bền fluoro polymer (fs), cellulose acetate (ca), polysulphone (gr) Các yếu tố ảnh hưởng đến trình siêu lọc: - Nhiệt độ: phải thích hợp với sản phẩm loại màng sử dụng Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả kết tủa protein tăng nhiệt độ trình siêu lọc yếu tố làm bít màng - p suất: thường tốc độ dòng chảy tăng với gia tăng áp suất đạt đến giá trò cực đại Nếu áp suất tăng tốc độ dòng chảy giảm Do tốc độ dòng chảy nên chỉnh từ – lít/phút Những thuận lợi phương pháp siêu lọc: - Có thể chọn lựa màng thích hợp với mục đích cụ thể - Enzym cô đặc 25 lần mà không bò hoạt tính - Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh enzym Trong trình thực thêm nước vào độ tinh cao - Nhiệt độ cao làm hoạt tính enzym, nhiệt độ 10 – 20 0Cđược xem khoảng nhiệt độ thích hợp cho suất mà không làm hoạt tính enzym Cách làm: - Sử dụng màng FS 50pp diện tích 336cm2 - Dòch nước dứa sau ly tâm cho qua siêu lọc, trình thêm nước cất vào để tinh thu dung dòch cô đặc Thu nhận tủa cách sử dụng acetone sấy thăng hoa dung dòch cô đặc d- Phương pháp tách CMC (carboxyl methyl cellulose) Nguồn thu nhận protease 10 Phương pháp cho phép thu bromelin dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh đơn giản phương pháp khác Cách làm: - CMC vải thấm ướt dung dòch đệm phosphate 0,005m, pH 6,1 - Cho dòch chiết dứa vào khuấy trộn Sau lấy vắt kiệt, vẩy chất bẩn bám vào CMC Rửa protein đệm phosphate 0,05m, pH 6,5 - Tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dòch phản ứng hấp phụ đệm phosphate 0,05m, pH 7,1 NaCl 0,5m khuấy trộn – lần Sau lấy vắt kiệt thu dung dòch đậm đặc chứa bromelin - Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai lần thứ Sau đó, gộp dòch chiết lại tủa acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym 3.3 Phương pháp tinh enzym bromelin a- Tinh phương pháp thẩm tích Cân 1g bromelin thô, pha 10ml dung dòch đệm Sodium Phosphate 0,03m có pH 7,2 Sau tất enzym hòa tan, cho hỗn hợp vào túi cellophane đặt túi vào cốc chứa lít dung dòch đệm Sodium Phosphate 0,03m, ph 7,2 Túi Cellophane chuẩn bò cách trước dùng tráng đầy dung dòch đệm tương tự Tiến hành thẩm tích thay dung dòch đệm bên lần Dung dòch đệm bên túi khuấy liên tục mọt máy khuấy từ Trong trình thẩm tích, thay đổi nhiệt độ giới hạn đònh vận tốc khuếch tán tăng theo dự gia tăng nhiệt độ Nhưng gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép bromelin bò biến tính Chính vậy, để giảm biến tính bromelim nhiệt, người ta thường tiến hành tinh bromelin nhiệt độ thấp b- Tinh cách lọc qua sephadex - Tinh cách lọc qua sephadex G-50 Sephadex G-50 đun cách thủy 100 0C nhồi vào cột Đặt phễu thủy tinh phía cột, cho Sephadex từ từ vào phễu khuấy liên tục Các hạt lắng từ từ xuống cột, ý phải khuấy liên tục đến nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi cho mật độ hạt đồng bọt khí Trong trình nhồi cột phải xả cột giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7phút Cân 100 mg bromelin thô hòa vào 1ml dung dòch đệm Sodium Phosphate 0,03m, pH 7,2 Khi bromelin hòa tan hoàn toàn cho hỗn hợp bromelin từ từ vào cột Cho dung môi phân ly bromelin qua cột điều chỉnh tốc độ chạy khoảng 2ml/7phút Loại bỏ 5ml bắt đầu thu dòch bromelin Dòch enzym thu đến dùng ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 thấy có xuất kết tủa trắng ngừng trình thu dòch enzym Dòch bromelin thu nhận làm đông khô Quá trình lọc bromelin qua Sephadex G-50 nên tiến hành điều kiện nhiệt độ thấp nhiệt độ thấp có khả giảm thiểu biến tính bromelin Quá trình diễn khoảng - Tinh cách lọc qua sephadex G-100 Sephdex G-100 đun cách thủy 100 0Ctrong giờ, sau nhồi vào cột kích thước 28x1cm Thực nhồi cột tương tự thực với sephadex G-50 Sau hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dòch đệm Sodium Phosphate 0,03m, pH 7,2 chảy qua cột khoảng 3-4 để cân cột Nguồn thu nhận protease dung dòch 37 • Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía mặt, sau lọc qua nhiều lớp vải mùn thu • Kết tủa: kết tủa NaCl nồng đôï bảo hòa 25%.Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đêùn dung dòch bão hòa, để yên dòch thủy phân 30 phút Có thể dung tác nhân tủa như: amon sulfate, côøn tuyệt đối, aceton, isopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000 Trong trình kết tủa dung môi hữu tạo nhiệt lượng lớn, làm hoạt tính enzym Do đó, dung dòch sau tự phân lọc dung môi làm lạnh trước sử dụng dung môi phải cho từ từ khuấy liên tục để trách tăng nhiệt độ cục bên hỗn hợp Thời gian –10 phút, lúc nhiệt độ không 50C Tác nhân PEG 6000: tương tự kết tủa muối vô Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dòch enzym khuấy liên tục cho tan hết • Ly tâm: hỗn hợp dung dòch sau để yên đem ly tâm 10 –15 phút với tốc độ 5000 –6000 vòng /phút • Sấy khô: sau ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí nhiệt độ 30 –40 C sấy chân không hay thiết bò sấy đông khô Để trách bò hoạt tính người ta trộn thêm vào phế phẩm enzym chất độn tinh bột hòa tan, maltose dextrin … trình sấy • Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần bảo quản điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng tác nhân lý,hóa học có ảnh hưởng đêùn hoạt tính enzym - Phương pháp hấp phụ: người tacó dùng số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym.Cơ sở khoa học phương pháp cho enzym hấp phụ chọn lọc lên chất hấp phụ như: caolin, oxyd sắt, than… Sau đó, dùng chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym khỏi chất hấp phụ thu nhận enzym mong muốn Sau ví dụ phương pháp hấp phụ pepsin: Thêm NH4OH 0,1N vào dung dòch pepsin thô cho đêùn phản ứng kiềm nhẹ, thêm hỗn hợp phosphat gồm: dung dòch CaCl 10%, dung dòch dinatriphosphat 5,5% với tỉ lệ 1:1 Pepsin kết tủa từ tư ø nhờ dung dòch NH 4OH hấp phụ ttrên mặt mỏng tricalciphosphat với tricalciphosphat lắng xuống Để nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH 4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết, lọc kết tủa rửa với nước cất Sau đó, lấy tủa xử lý với dung dòch oxalic acid 4%, tricalciphosphat chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin tan dung dòch, lọc lấy dung dòch pepsin Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH =2,4 –2,6 Sau đó,thêm thể tích hỗn hợp cồn: ete (tỉ lệ 1:1) để tủa pepsin Kết tủa thu rửa với cồn, sau với ete sấy khô nhiệt độ bé 450C - Phương pháp cô áp suất thấp để dung dòch pepsin đậm đặc : với phương pháp người ta phải tiến hành nhiệt độ bé 45 0C, áp suất thấp để enzym không bò giảm hoạt tính, tạo dung dòch pepsin thô đâïm đặc, sau trộn với tá dược lactose, tinh bột,sấy nhẹ tạo dạng bột khô Nguồn thu nhận protease 38 Pajagopalanetal thực xử ký dày heo cách tách màng nhầy trữ trạng thái đông, đưa đến pH= 2,7 – 2,9 HCl ủ 50 0C vài Dòch thủy phân trộn đêøu để yên: phần nhẹ lên mặt, để lạnh 0C cô đặc áp suất thấp, enzym bò tủa alcolhol tách Sau pepsin bò tủa alcolhol đem lọc làm khô Các phương pháp chiết tách cho phép thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết, có lẫn protein lạ protease khác Pepsin hoàn sử dụng điều trò y dược hay công nghiệp c- Phương pháp tinh pepsin: - Phương pháp kết tinh Northrop: Northrop bắt đâøu tư ødung dòch pepsin tinh Parke Davis lấy dung dòch cho kết tủa dung dòch sulfuric với MgSO bán bão hòa, chất kết tủa rửa với dung dòch MgSO 4, sau hòa tan băng dung dòch NaOH N/2, cho kết tủa lần hai cách pha thêm H2SO4 N/2 Kết tủa giữ yên vài nhiệt độ 0C, lần lại hòa tan NaOH N/2 pha loãng nước 45 0C, sau lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất phải qua loạt quy trình hòa tan kiềm tái kết tủa acid điều chế tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết hoạt tính cao - Phương pháp qua lọc gel sephadex: + Nguyên tắc: cho hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex trương nước, phân tử lớn không chui vào hạt gel mà di động gel, di chuyển khỏi cột sephadex nhanh Còn phân tử nhỏ chui vào hạt với mức độ khác tùy theo kích thước chúng Do kó thuật dùng để tách chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng lớn khỏ cột nhanh, phân tử lượng nhỏ chậm + Hóa chất dụng cụ :tùy theo đặc điểm cột loại gel sephadex dùng thí nghiệm mà ta ngâm lượng gel sephadex thích hợp Ở ta dùng buret có đường kính 1cm, cao 35cm gel sephadex G –100, cân 1,2g gel lượng thừa dung dòch NaNO3 0,028 72 để gel trương nở hoàn toàn Gel sau ngâm NaNO3 rửa nước cất sau nhồi vào cột, hay dùng gel sephadex G-75  Dung dòch đệm Mc Ilvaine pH=2,2 X: dung dòch citric acid 0,1M (hòa tan 21,008g citric acid 1lít nước cất); Y: dung dòch dinatri hydrophosphat 0,2M (hòa tan 35,63g Na 2HPO4.2H2O hay 71,7g Na2HPO4.12H2O 1lít nước cất) Pha 98ml dung dòch X 2ml dung dòch Y, ta dung dòch đệm pH = 2,2  Chọn cột có φ = 1,8cm ; chiều cao h = 80cm + Kó thuật nhồi cột: - Cột sau rửa (rửa cột để đổ gel): cột rửa HNO 50% rửa lại nước cất nhiều lần, tráng aceton, đem sấy khô - Rửa dụng cụ khác: ống nghiệm rửa ngâm vào dung dòch sulfo cromic ngày, rửa lại, tráng nước cất sấy khô Nguồn thu nhận protease 39 - Tiến hành nhồi cột với G-75 trương nở hoàn toàn: gel đưa vào cột với dung dòch đệm qua phễu cách từ từ tránh bột khí phân lớp Sau cho gel vào cột gel lắng thành lớp cao khoảng 5cm mở khóa cho dung dòch đệm chảy từ từ Sau tiếp tục cho gel vào cột cho đêùn đạt đến độ cao cần thiết Bề mặt dung dòch bên cột phải phẳng, mặt gel có lớp dung dòch đệm cao khoảng 2cm để gel không bò khô - Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn đònh 3giờ, sau rửa cột dung dòch đệm pH =2,2 khoảng 24 (thể tích dung dòch đệm dùng để rửa gấp lần thể tích cột) + Đưa mẫu vào cột:  Đem kết tủa 50ml dung dòch enzym thu sau trình tự phân qua lọc 283ml cồn tuyệt đối (nồng độ cồn hỗn hợp khoảng 85%) Sau xử ly tâm, kết tủa hoà tan lại 50ml dung dòch đệm pH =2,2 ta dung dòch A  Hút 3ml dung dòch A, thêm vào 2ml dung dòch pH=2,2; đem ly tâm bỏ cặn  Ngưng khóa dòng dung dòch đệm chảy qua cột, Khi lớp dung ddòch đệm vừa cạn đến mặt gel cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột 5ml (1-5% thể tích cột)  Sau cho mẫu vào cột hết tiếp tục cho dung dòch đệm chảy qua cột + Thu mẫu qua cột: sau mẫu vào hết cột, bắt đầu hứng dung dòch chảy qua cột Số phân đoạn n ống (ví dụ khoảng 30 ống), phân đoạn ta thu khoảng 4ml, phân đoạn thu được, đem đo mật độ quang OD bước sóng 280nm Vẽ đồ thò biểu diễn mối quan hệ phân đoạn giá trò OD tương ứng Ghi nhận peak tạo thành Sau xác đònh hoạt tính pepsin ống tương ứng với peak Theo kết tính hiệu suất hoạt tính enzym hàm lượng protein thu qua lọc gel Ví dụ: Một số phương pháp kết qủa thu nhận tinh pepsin dê  Tinh pepsinogen:pepsinogen dạng zymogen pepsin, enzim dòch dày Chúng tinh từ nhiều loài động vật có xương sống khac Có hai loại pepsinogen A C biết đến hoạt động động vật trưởng thành, tổng hợp người lừa cừu heo Thành phần lọai A thỏ gấu đen Asiatic Thành phần lọai C lòai gặm nhấm chuột heo…  Dạ dày dê cắt nhỏ để tiến hành tinh Tất tiến trình thực – 4o C, ngoại trừ FPLC thực nhiệt độ phòng Sắc ký DEAE – Sephacel lọc gel thực đệm Na SO4 0.01 M, pH 7,0 Thực FPLC đệm tris – HCl 0.01M;pH 7.0.Bản chất tiế trình giống tiến trình dùng tinh pepsinogen Suncus mô tả vắn tắt sau đây: Phần múi khế dày (tổng khối lượng trung bình 6.1 g) đồng hoa với 20 ml đệm Na SO4 0.01 M , dung dòch đồng ly tâm 15.000 vòng /phút Phần bên đem tiến hành qua cột DEAE – sephacel(1.5*30 cm) Protein hấp phụ giải phóng theo chiều gradient nồng độ NaCl từ – 0.5M Hoạt động thủy phân Hb phát tạo thành ba peak Peak I chứa loại pepsinogen C peak 2,3 chứa pepsinogen A protein peak sau lọc gel cột sephadex G – 100 (1.5 * 100cm).Dung dòch protein thực FPLC cột Mono Q ,HR 5/5 để tinh lần cuối Protein giải phóng theo chiều grdient nồng độ muối NaCl từ → 0.5 Nguồn thu nhận protease 40 M 30 phút nức nước chảy thấp 1,0 / phút Hỗn hợp pepsinogen A C phân tách hoàn toàn chia loại isozymogen Điẹân di protein:Pepsinogen tinh thực để không biến tính dựa vào phương pháp PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) SDS – PAGE theo Weber Osborn Protein nhuộm Coomassie brilliant blue Deglycozyl hóa: pepsinogen (khoảng 0.2 µg) ủ với đơn vò tối thiểu glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, viêït làm giảm khối lượng phân tử pepsinogen phân tích phương pháp SDS – PAGE Pepsinogen c –2 suncus sử dụng kiểm chứng dương tính trình glycozyl hóa pepsinogen Xác đònh nồng độ protein :nồng độ protein dung dòch enzim bước tinh xác đònh phương pháp Lowry cộng đo bước sóng 280 nm với serum album heo tiêu chuẩn Số lượng pepsinogen tinh xác đònh cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid khối lượng phân tử Phân tích amino acid :mẫu để phân tích amino acid (10µg protein) bò thủy phân HCl bay 15 C /1 hệ thống Waters PICCO – TAG TM Work station (Millipore Corp, Milford, MA) Mẫu phân tích máy phân tích amono acid Sự tinh pepsinogen dê: tinh pepsinogen từ ba múi khế dê thực cách riêng lẻ, kết đạt tương tương tự trường hợp Một kết tiêu biểu tinh tóm tắt bảng 5.12 Sắc ký DEAE sephacel tách họat tính thủy ngân pH = thành peak Khi thực pH 3.5, mối liên h6ẹ kích thước thay đổi đáng kể so sánh với trình thực pH = • Cột cân với đệm Na 2SO4 0.01 M; pH = protein giải phóng theo chiều gradient nồng độ của NaCl đệm Phân đọan chọn 10 ml Phân đọan tạo thành A-1, A-2, C-1, C – Quá trình thủy phân thực phương pháp thủy phân Hb pH pH 3.5 • Việc giảm đáng kể peak thứ ba giá trò đáng ý Những kết cho thấy đặc điểm enzym thủy phân chứa peak khác so với enzym khác Sự tinh cuối pepsinogen thực FPLC cột mono Q Sau đặc tính hóa, pepsinogen ba peak sắc kí DEAE –sephacel chia thành hai phần pepsinogen C (pepsinogen C-1 C-2), hai phần pepsinogen A (pepsinogen A-2 A -3) phần pepsinogen A (pepsinogen A-1) tương ứng Chỉ đònh nhữ ng pepsinogen phù hợp với báo cáo hội đồng khoa học IUBMB Mức độ liên quan pepsinogen A-1, A-2, A-3, C–1, C–2 dựa trọng lượng phần múi khế dày tính 27, 19, 14, 25 15% tương ứng Rennin a- Thu nhận dung dòch rennin: Ganguli cộng tách chiết rennet với động vật non sống thường thực hai lần vật non đượcc 3-4 tháng tuổi số lần thực khoảng 30-40 lần / Cũng thu rennin dày bê con, thường chuẩn bò lò mổ Nguồn thu nhận protease 41 hai cách: sấy khô ướp muối, lớp dày gỡ giữ nguyên, thổi phòng lên không khí làm khô Ở Mỹ ,người ta ướp muối dày sau rửa sạch, dày cần phải làm khô trước tách chiết Dạ dày khô từ hai trình tách chiết NaCl Gần người ta thực sau ướp muối bình thường chiết dòch dày không khô cách dễ dàng mức độ chiết dòch chậm so với dày khô Thường người ta tách chiết rennin HCl tượng tự pepsin Dòch rennet dược bảo quản nồng độ muối cao 14-20% thêm chất bảo quản sodium propylene glycol Dòch rennet rennet bốc màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm bột màu trắng đến nâu nhạt Dòch rennet chiết chứa rennin hoạt động tiền rennin bất hoạt Thêm acid vào để chiết đạt hiệu tối đa pH = thích hợp ,mặc dù hiệu trình tách chiết pH thấp nhanh ổn đònh rennin pH môi trường có NaCl cho hiệu suất tách chiết giảm - Quá trình thu nhận dòch rennin: Nguyên liệu thu rennin ngăn thứ tư cảu dày bê non dướ tháng tuổi Lấy phần múi khế bao tử bê lộn ngược cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng Rửa nhẹ nước lạnh sau rửa lại dung dòch NaCl 15% - Hóa chất: Muối NaCl, HCl sử dụng để kết tủa thu enzym, nên hóa chất phải tinh khiết, khô, không lẫn tạp chất, kim loại nặng gây tủa bất hoạt enzym Natribenzoat: chất bảo quản - Thiết bò sử dụng: máy điều nhiệt, ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hóa, máy đo pH, cân Mettler K7, cân Prolabo - Phương pháp thu nhận dung dòch rennin: thực hai cách sau: + Phương pháp1: Dạ dày bê xay nhuyễn HCl 0,2 % Tỷ lệ 1:3 theo V Cho vào 0,7% acid boric tổng V + Phương pháp : Dạ dày bê xay nhuyễn Nước muối 10% Tỷ lệ 1:3 theo V Chỉnh HCl để pH = Cho 0,7% acid boric treen tổng V (có tác dụng bảo quản) Giữ nhiệt độ 35-40 0C hai mẫu qua 30 tủ ấm Sau dùng HCl N chỉnh lại pH dung dòch hai phương pháp pH = Lấy đem lọc qua vải vải nhiều lớp dòch trích rennin thô (A) có chứa rennin c- Phương pháp thu nhận rennin thô Dòch rennet thực kết tủa cách acid hóa dung dòch bão hòa với NaCl hai cách Gelatin thường xuyên thêm vào để giúp kết tủa tách rennin khỏi dung dòch ly tâm 45 phút 5000 vòng / phút i Thu rennin dạng bột: Nguồn thu nhận protease 42 Tiến hành tủa enzym theo phương pháp diêm tích với muối trung tính cách cho từ từ vào dung dòch (A) lượng NaCl tinh thể nồng độ khoảng 22-23% cho đếùn đạt bão hòa NaCl Để tủ lạnh 20 phút Lấy ly tâm hay lọc Cạo lấy kết tủa để lên đóa petri, sấy quat cho khô để vào bình hút ẩm - Cách thu nhận tự tượng khác : Dạ múi khế dày bê cắt nhỏ “brei” mổng điều chỉnh đến pH = 2-3 acid HCl ủ 42 0C để hoạt hóa dạng tiền enzym prorennin thành rennin điều chỉnh pH gần 5,5 với Na 2PO4 Sự có mặt phosphat, hỗn hợp trở thành dung dòch làm khô chân không hay dạng bột Sản phẩm chứa chất béo, tách khỏi bột khô cách trích dung môi Dung môi thường acetol hay la alcohol, phần lại dễ dàng tách từ dung dòch chuẩn bò ban đầu Phương pháp chuẩn bò khác: dày bê làm khô nghiền Bột khuấy vài ngày với dung dòch HCl chứa chất bảo quản Dòch chiết tách khỏi phần không hòa tan, acid hóa dung dòch HCl thích hợp để tủa phần nhầy Enzym bò tủa kết tiếp NaCl vừa đủ để dung dòch bảo hòa Phần tủa đem lọc làm khô nhiệt độ phòng Sản phẩm chứa muối protein tinh khiết so với phương pháp đầu Enzym chuẩn bò thường pha loãng, có chất bảo quản (tránh vi sinh vật phát triển dung dòch chuẩn bò, chống oxy hóa…) Trong số chất dùng rennet thương mại chuẩn bò chứa NaCl, propylene glycol, sodium benzoat sodium propionate c- Phương pháp thẩm tích túi colodium Màng bán thấm dializ dùng để tách muối cho chất có phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại chất có phân tử lượng lớn Cân xác lượng enzym bột vào túi colodium Cân trọng lượng túi có chứa enzym cho túi vào becher đựng nước cất vào cho thẩm tích môi trường nước lạnh 0-40C Khuấy thay nước lạnh thường xuyên làm khô nhanh túi cách sấy quạt gió, nhiệt độ 30-400C Cân trọng lượng túi sau sấy khô Hiệu số trọng lượng túi ban đầu sau thẩm tích lượng NaCl: m1 – m2 = m Trong đó: m1: trọng lượng túi +mẫu thí nghiệm trước thẩm tích (g) m2: trọng lượng túi + mẫu thí nghiện sau thẩm tích (g) m: trọng lượng muối NaCl thẩm tích qua màng (g) Một số nghiên cứu tách chiết rennin: Tauber Kleiner mô tả phương pháp để lấy rennin, prorennin tinh chúng Chymosin (rennin) chiết tinh sắc kí DEAE – Sephadex thực Dekoning Nói chung việc tách chiết tinh rennin tương tự pepsin, người ta thực đạt kết với nhiều phương pháp khác Tái chế: cách khác để giảm việc rennet tách enzym từ nước sữa tái sử dụng chúng phương pháp sắc kí Nguồn thu nhận protease 43 Mặc dù kết khoa học đầy hứa hẹn phương pháp chưa chấp nhận thực tế Tóm lại, nghiên cứu enzym có khả động tụ dang tiếp tục có nhiều tranh cãi Pancreatin a- Nguyên liệu: Tụy heo, bò lấy sau vật bò giết hay bảo quản nhiệt độ đông đá Trước tách chiết để thu nhận enzym, phần tụy phải loại bỏ mỡ, mô liên kết xay nhỏ máy xay đồng hóa b- Phương pháp: - Phương pháp tách chiết pancreatin cồn: Các giai đoạn tách chiết với cồn tuyệt tỉ lệ 1:4, 1:5, 1:7 cồn 96 tương tự với aceton thay aceton cồn -Tách chiết pancreatin với aceton rửa tủa (lần 2) aceton Tụy heo bảo quản tươi nhiệt độ đông đá Tách bỏ mỡ mô liên kết , xay nhỏ đem cân trọng lượng NaCO3 1,2% (tỷ lệ 1:2) 200, khuấy Lọc lấy dung dòch rây Aceton lạnh(1:4)khuấy 10 phút Để lắng15phút nhiệt độ lạnh Tủa thu lấy enzym Ly tâm để lấy tủa ( lần 1) Rửa tủa aceton Ly tâm lần lấy tủa Sấy tủa nhẹ 30 -350C Nghiền nhỏ Sản phẩm Pancreatin thô Nguồn thu nhận protease 44 Sơ đồ thu nhận pancreatin phương pháp tách chiết với aceton - Phương pháp tách chiết pancreatin kết tủa muối (NH4)2SO4 : Tụy heo bảo quản tươi Tách bỏ mỡ mô liên kết , xay nhỏ đem cân trọng lượng Pha với nước cất (1:1) tự Phân 200C 6-8h Lọc lấy dung dòch H2SO4 0,25N( 2:1) PH = 3,5-4 ,trong 1h Ly tâm lấy tủa (NH4)2SO4 60 – 70% (1:2) Sấy tủa nhẹ 40 C Nghiền nhỏ sản phẩm Pancreatin thô Thu nhận pancreatin thô phương pháp sấy: lấy tụy tươi bảo quản, cân trọng lượng trộn với tinh bột lượng 10% so với trọng lựơng tụy tươi, sau đem sấy nhiệt độ 50 0C, 600C, 700C Sau thời gian sấy nhiệt độ ta đem xay nhuyễn chế phẩm pancreatin thô Chymotrypsin a- Chuẩn bò: - Đệm Phosphate 0,067M , pH =7 Hòa tan 4,54g K2HPO4 nứớc thành dung dòch 500ml Hòa tan 4,73g NaH2PO4 khan vào nước thành dung dòch 500ml Hòa tan chung 38,9ml dung dòch K 2HPO4 với 61,1ml dung dòch NaH 2PO4 Điều chỉnh pH cách nhỏ giọt (nếu cần thiết) dung dòch NaH 2PO4 đến pH =7 - Dung dòch chất: Hòa tan 23,7mg N-acetyl-Dtyrosin ethyl ester (cơ chất thích hợp dùng để xác đònh chymotrypsin) vào khoảng 50ml dung dòch đệm phosphate 0,067M, pH =7 Giữ lạnh pha loãng với đêïm pH=7 đến 100ml - Dung dòch trypsin tinh khiết: hòa tan lượng xác trypsin tinh thể vào hydrochloric acid 0,001N để thu dung dòch chứa 650 đơn vò USP trypsin ml b- Cách thực hiện: Độ hấp thu đo bằn quang phổ kết điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh không thay đổi 0,50C nhiệt độ ngăn để mẫu 250C Hút 200µl dung dòch acid HCl 0,001N 3ml dung dòch chất vào cuvette 1cm Đặt cuvette vào quang phổ kế điều chỉnh thiết bò để có độ hấp thu 0,2 bước sóng 273nm Hút 200µl dung dòch trypsin tinh khiết vào cuvette khác, thêm 3ml dung dòch chất đặt cuvette vào quang phổ kế Bắt đầu tính thời gian từ bắt đầu thêm chất vào enzym Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không 5mn kể từ cho chất vào enzym Lập lại bước lần Các giá trò độ hấp Nguồn thu nhận protease 45 thu tuyệt đối quan trọng ổn đònh phút phải lập đến tiến trình cần thiết thực với nồng độ thấp Lập lại trình lần thứ hai với nồng pha loãng, theo dõi thay đổi độ hấp thu lần thực Xác đònh thay đổi độ hấp thu trung bình phút, sử dụng giá trò vòng phút Cách tính số đơn vò USP chymotrypsin mg trypsin tinh khiết theo công thức: (A2 – A1)/ (0,0075TW ) Với: A2 độ hấp thu lần đàu tiên A1 độ hấp thu lần cuối T thời gian tính phut lần dọc đầu cuối W trọng lượng (mg) trypsin tinh thể thể tích dung dòch dùng xác đònh độ hấp thu D NGUỒN THU NHẬN PROTEASE TỪ VI SINH VẬT I ĐẶC TÍNH CỦA PROTEASE VI SINH VẬT [1] Các công trình nghiên cứu protease VSV ngày nhiều Các kết nghiên cứu cho thấy protease nòi VSV khác nhiều tính chất Căn vào chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… nhà khoa học phân loại proteinase VSV thành bốn nhóm sau: + Protease – serin; + Protease – thiol; + protease – kim loại; + protease – acid Một số tác giả khác chia protease làm ba nhóm; dựa vào pH hoạt động chúng, bao gồm: + protease – acid; + protease – trung tính ; + protease – kiềm Trong bốn nhóm protease kể trên, protease – xerin protease – thiol có khả phân giải este liên kết amide dẫn suất acid amino acid Ngược lại protease kim loại, protease acid thường hoạt tính esterase amidase dẫn suất amino acid Nhiều protease ngoại bào VSV nghiên cứu tương đối kỹ cấu tạo phân tử, số tính chất hóa lý chế tác dụng Kết nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử enzyme tương đối bé, protease – xerin Các protease–xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20–27 ngàn Datton Tuy nhiên, có số proteinase–xerin có trọng lượng phân tử lớn enzyme Penicillium cyoneo-fulvum (44000), Asp, oryzae OUT 5038 (52000) (Martin 1962, Morihara Tsuzuki 1969) Trọng lượng phân tử protease kim loại lớn so với Nguồn thu nhận protease 46 protease–xerin, (vào khoảng 33800–48400) Protease thiol nhiều protease acid có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000–40000 Có thể tóm tắt đặc tính nhóm proteinase bảng sau: Nhóm Nguồn enzyme Chất kìm hãm Đặc điểm trung tâm hoạt động Xerin pH tối thích Proteinase Bac.subtilis xerin Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coli DFP + Proteinase Streplococus thiol Clostridium histoly - ticum Iodoaxeta – -SH mit Ps.cloromer curbenzoat EDTA + + Kim loại hóa 1,10octa - trò fenantrolin 7,5 7,0 Diazoaxetil COOH Dl norlox – inmetil este Acid Proteinase Bac.subtilis kim loại Bac.subtilis NRRL B3411 Bac.subtilisamy Iosaccarilicis Bac.megaterium Pseudomonasaeruginosa Atreptomyces naraensis Asp.oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyticum Proteinase Asp.niger acid Asp.awamori Asp.sailoi, Penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pusillus Endothia parasilica Kiềm Trung tính Cách phân loại nhiều tác giả trí sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, thời gian sau này, số protease VSV nghiên cứu ngày nhiều, ngày nhận nhiều enzyme mang tính chất trung gian nhóm kể trên, nhóm nhóm ba Do người ta bắt đầu có ý kiến cách phân loại Nguồn thu nhận protease 47 Năm 1975, Morihaba thử phân loại protease VSV chia chúng thành bốn nhóm lớn, dựa vào tính đặc hiệu chúng chất tổng hợp chuỗi β-insulin bò oxi hóa Nhóm có tính đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm – CO2 liên kết peptide, gọi carbonxyendopeptidase Nhóm ba có tính đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm -NH- liên kết peptide (aminoendopeptidase) Mỗi nhóm phân thành nhóm nhỏ dựa vào tính đặc hiệu chúng số tính chất khác Nói chung, tính đặc hiệu protease gốc amino acid chứa nhóm – CO – nhóm – NH – liên kết bò phân giải (đặc hiệu sơ cấp) mà gốc amino acid xa liên kết bò phân giải (đặc hiệu thứ cấp tương tác thứ cấp) Các enzym nhóm, có tính đặc hiệu giống chòu ảnh hưởng giống tương tác thứ cấp Nói chung, enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chòu ảnh hưởng tương tác thứ cấp ngược lại Chẳng hạn protease - xerin giống trypsine Streptomyces, protease kim loại trung tính,… thường chòu ảnh hưởng tương tác thứ cấp chúng tác dụng với chất phân tử bé peptide phân tử lớn protein Ngược lại, protease–xerin kiềm protease-acid chòu ảnh hưởng lớn tương tác thứ cấp enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt chất phân tử bé Khi tác dụng chất phân tử lớn, tính đặc hiệu enzyme xác đònh tương tác thứ cấp Các protease VSV ý nghiên cứu từ năm 1960, từ năm 1918, 1919 Waksman phát khả phân giải protein xạ khuẩn Trong 10 năm này, số công trình nghiên cứu protease VSV tăng lên đáng kể nhiều công trình nghiên cứu protease động vật thực vật Những kết đạt lónh vực nghiên cứu protease VSV góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme ứng dụng enzyme thực tế Trong thời gian gần đây, người ta có phương pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan protease Kết mở triển vọng to lớn nghiên cứu ứng dụng protease II NGUỒN VI SINH VẬT [1] Nhiều VSV có khả tổng hợp mạnh protease Các enzyme tế bào tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp y học Các loài VSV có khả tổng hợp mạnh protease trình bày bảng sau: Vi sinh vật Vi Bac.subtilispha khuẩn Bac.cireulans Bac.sphaericus Bac.thermophilus Bac.aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermoproteoly ticus Bac.brevis Ghi Protease trung tính , protease kiềm (subtilizin) Protease kiềm Protease trung tính Nguồn thu nhận protease Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium Bac.cereus Bac.pumilus Cl.perfringens Cl.histolyticum Cl.sporogens Ps.aeruginosa 48 Protease trung tính , protease acid Protease acid protease kiềm Colagenase Protease trung tính , protease kiềm Xạ Str.griseus khuẩn Str.rimosus Str.fradiae Str.faeca is Str.reetus ar.pro-teolyticus Dùng kỹ nghệ Nhật,Mỹ,gồm 11 enzyme với chất procolagen phân giải 70% đến amino acid có protease , peptidase (lơxinaminopeptidase , cacboxypeptidase),2 protease:proteaseserin Nấm mốc Protease kim loại protease serin, có ba loại protease acid, protease trung tính, protease kiềm Protease acid (aspergilopeptidase A) Protease acid Hai protease acid Protease acid Hai protease : protease acid protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa Protease trung tính Protease kiềm Hai protease : protease kiềm protease trung tính Protease acid Protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa dùng Nhật để thay cho rennin Asp.oryzae Asp.satoy Asp.awamori Asp.niger Asp.shirousami Asp.fumigatus Asp.tericola Asp.candidus Asp.ochrraceus Asp.sojae Asp.flavus Pen.janthinellum Pen.cyaneo fulvum Mucor.pusillus Rh.chinensis Rh.delemar Rh.niveus Rh.nodous Rh.pseudokinensis Rh.peka III NGUYÊN LIỆU LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [2] Nguồn thu nhận protease 49 Thành phần môi trường dinh dưỡng yếu tố đònh ảnh hưởng đến hoạt động sống VSV khả sinh tổng hợp enzym Để bảo đảm yêu cầu tối thiểu cho sinh trưởng VSV sinh tổng hợp protease môi trường cần có chất chứa C, H, N, O chất vô khác Mn, Ca, P, S, Fe, K số chất khác + Nguồn cacbon: thường hợp chất hữu trước hết gluxit Khi sử dụng đường làm nguồn cacbon cần nhớ số đường có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp số enzym thủy phân Ngoài gluxit dùng nguồn cacbon khác mỡ, dầu, aacid hữu cơ, rượu Trong số acid hữu cơ, acid lactic VSV hấp thụ dễ dàng Acid có nhiều nước chiết ngô, cao ngô thường nguồn C nguồn đạm dùng nhiều để nuôi cấy chủng VSV + Nguồn nitơ: hợp chất hữu vô Các hợp chất hữu nguyên liệu giàu đạm cao ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc,…Ngoài số acid amin, bazơ purin (adenin , guamin,…), pyrimidin thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy VSV Các bazơ purin, ARN sản phẩm thủy phân thường có khả kích thích sinh tổng hợp proteinase + Các nguyên tố khoáng có ảnh hưởng rõ rệt đến trình sinh tổng hợp protease Các nguyên tố bao gồm nguyên tố vi lượng đa lượng Nguyên tố vi lượng thường Fe, Zn, Cu, Co,… nguyên tố thường có nước thành phần hữu khác môi trường (bột, cao ngô) không cần bổ sung bổ sung dạng vết Chú ý: tăng nồng độ nguyên tố kìm hãm mạnh phát triển VSV Các nguyên tố đa lượng đưa vào môi trường nuôi cấy dạng muối vô cần tính hàm lượng nguyên tố có sẵn thành phần khác môi trường Khi lựa chọn môi trường dinh dưỡng cần lưu ý thành phần đònh tính đònh lượng môi trường, tỷ lệ thành phần môi trường Cũng cần nhớ nhiều trường hợp, môi trường thích hợp cho sinh trưởng VSV chưa thích hợp để sinh tổng hợp protease Có môi trường kìm hãm tích lũy sinh khối tế bào tăng cường sinh tổng hợp protease Các loại môi trường: phân biệt thành hai loại môi trường: Môi trường tổng hợp môi trường tự nhiên + Môi trường tổng hợp: loại môi trường bao gồm chất với lượng xác đònh: nguồn C môi trường tinh bột, loại đường, rượu, acid hữu cơ; nguồn N loại muối vô có chứa N acid amin, peptide có thành phần xác đònh,… + Môi trường tự nhiên: thường dùng phế liệu nguyên liệu tự nhiên có chứa chất hữu khác để làm nguồn C, N, … môi trường Trong nguyên liệu tự nhiên chứa nhiều nguyên tố khoáng kể vi lượng đa lượng, yếu tố sinh trưởng có sinh tố nhóm Biotin Do nhiều trường hợp không cần bổ sung thêm loại muối vô Mặt khác nguyên liệu lại rẻ tiền loại môi trường thường dùng công nghiệp để sản xuất chế phẩm enzyme từ VSV Khi lựa chọn môi trường cần ý đến chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt chất cảm ứng, chất cảm ứng sinh tổng hợp proteinase protein polypeptide có trọng lượng phân tử nhỏ Nguồn thu nhận protease 50 Các nguyên liệu dùng để chuẩn bò môi trường tự nhiên thường cám gạo, cao ngô phế liệu men bia, rỉ đường,… nguyên liệu cám bột ngô thường nguồn C tốt nhất, men bia tự phân, khô lạc nguồn N tốt IV PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PROTEASE [1],[2] Nuôi cấy phương pháp bề mặt Môi trường thường dùng cám, có pH từ 5,6–6,2 (đối với nấm sợi) từ 6,2– 7,2 (đối với vi khuẩn) Cho môi trường vào khay lớn để nuôi cấy Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào VSV, VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp (thời gian mà lượng enzyme môi trường lớn nhất) Nói chung đa số nấm sợi mesofil nuôi từ 32–42 Sau dùng nước dung dòch nuôi để chiết rút enzyme khỏi môi trường, loại bỏ phần không hòa tan, kết tủa enzyme muối vô hay dung môi hữu Nuôi cấy phương pháp bề sâu Chuẩn bò môi trường thích hợp thùng lên men khử trùng Sau làm lạnh, cấy VSV vào với tỉ lệ 1–10% Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme dòch môi trường nuôi cấy Khi hoạt độ đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzyme khỏi tế bào VSV cách ly tâm hay lọc Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết tốt cần xác đònh cho lượng oxy cần thiết thời gian sinh trưởng loài VSV Thể tích thùng lên men lớn khó khống chế yếu tố Nhật thường dùng thùng lên men 20–30m Theo tác giả Nhật, nên cấy trực tiếp vi khuẩn vào thùng lên men (chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) bảo đảm môi trường khỏi bò nhiễm Tách protease Như nói ,để tách enzyme từ môi trường nuôi cấy VSV theo phương pháp bề mặt dùng dung dòch đệm thích hợp, dung dòch muối loãng nước để chiết rút enzyme Cho canh trường sau nuôi cấy vào dung dòch nói theo tỉ lệ thích hợp, khuấy đều, lắc máy lắc thời gian xác đònh, lọc ly tâm, thu lấy dòch Trong sản xuất thường dùng nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích môi trường, tiến hành chiết rút enzyme Tiến hành theo phương pháp cho kết tốt Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dòch enzyme Quá trình giai đoạn quan trọng khó khăn kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzyme Nhật Bản tìm phương hướng thích hợp để làm nước chiết dòch môi trường nuôi cấy Theo tác giả Nhật nên lọc không nên ly tâm ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzyme F KẾT LUẬN Trong ba nguồn thu nhận protease (động vật, thực vật, vi sinh vật), nguồn vi sinh vật nguồn có ưu lớn do: tốc độ sinh trưởng VSV nhanh, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất theo quy mô công nghiệp rẻ tiền dễ kiếm, thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp, VSV tổng hợp lúc nhiều loại enzym khác enzym có hoạt tính cao Do đó, nguồn VSV khai thác nhiều tương lai Nguồn thu nhận protease 51 phát triển Nguồn protease VSV dần thay protease từ động vật thực vật ưu điểm Tài kiệu tham khảo [1] [2] [3] [4] [5] Nguyễn Đức Lượng – Công nghệ enzym – NXB ĐH quốc gia tp.HCM Nguyễn Trọng Cẩn – Công nghệ enzym – NXB khoa học kỹ thuật 1998 Internet – www.crfg.org/pubs/ff/papaya.html Internet – www.crfg.org/pubs/ff/pineapple.html Internet – www.crfg.org/pubs/ff/fig.html