tìm hiểu về nguồn thu nhận protease

Hệ Enzim Amylase seminar UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC    seminar: HỆ ENZIM AMYLASES GVHD: Ths Nguyễn Thò Thu Sang SVTH: Nguyễn Hoàng n Tạ Xuân Dũng Phạm Thế Vinh Lý Vũ Quốc Bảo TP.HỒ CHÍ MINH – 2006 seminar Hệ Enzim Amylase LỜI MỞ ĐẦU Hiện ,ngành công nghệ sinh học đà phát triển Dần khẳng đònh vò trí kinh tế quốc gia Nếu kỷ 20 kỷ công nghệ thông tin ,với phát triển vượt bậc máy tính kỷ 21 kỷ công nghệ sinh học với đời gien người vào năm 2003 Ngành công nghệ sinh học có bước phát triển mạnh mẽ.Xứng đáng ngành đầu ngành khoa học Phục vụ thiết thực cho sống người Làm cho sống người ngày tốt Trong ceminar giới thiệu cho bạn loại enzim nghiên cứu kỹ ứng dụng nhiều sống Đó hệ enzim amylase thuỷ phân tinh bột Chắc chắn trình thực thiện không tránh khỏi sai sót mong cô bạn đóng góp ý kiến để đề tài hoàn chỉnh Chúng xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp quý báu cô tất bạn Xin chân thành cảm ơn Hệ Enzim Amylase seminar HỆ ENZIM AMYLASE MỤC LỤC seminar Hệ Enzim Amylase LỜI NÓI ĐẦU GIỚI THIỆU SƠ BỘ VỀ ENZIM AMYLASE PHẦN :CƠ CHẤT I.1 TINH BỘT I.1.1 AMYLOSE I.1.2 AMYLOPECTIN .8 I.2 GLYCOGEN PHẦN :ENZIM HỆ AMYLASE 10 II ENZIM AMYLASE 11 II.1 EMZIM ANPHA-AMYLASE .12 II.1.1 CẤU TẠO .12 II.1.2 CƠ CHẾ TÁC DỤNG 14 II.1.3 ĐẶC TÍNH 16 II.2 ENZIM BETA- AMYLASE 17 II.2.1 CẤU TẠO .17 II.2.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 18 II.2.3 ĐẶC TÍNH 19 II.2 ENZIM GAMA- AMYLASE 20 II.2.1 CẤU TẠO .20 II.2.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 21 II.2.3 ĐẶC TÍNH 22 PHẦN :THU NHẬN EN ZIM AMYLASE 24 III.THU NHẠÂN ENZIM AMYLASE 25 III.1 NGUỒN THỰC VẬT .25 III.1.1 MALT ĐẠI MẠCH .25 III.1.2 MALT THÓC 28 III.2 NGUỒN VI SINH VẬT 30 III.3 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA AMYLASE 36 PHẦN : ỨNG DỤNG ENZIM AMYLASE 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 seminar Hệ Enzim Amylase GIỚI THIỆU SƠ BỘ VỀ HỆ ENZIM AMYLASE Amylase , loại enzyme có ý nghóa mặt sinh lý , thương mại lòch sử gọi diastase Enzyme có thực vật lẫn động vật vi sinh vật Amylase tinh từ malt vào năm 1835 Anselme Payen Persoz Amylase loại enzyme thuỷ phân , xúc tác từ phân giải liên kết glucoside nội phân tử polysaccharide với tham gia nước Amylase thuỷ phân tinh bột , glucogen dextri thành glucose , maltose dextri hạn chế Amylase nước bọt gọi ptyalin Trong nước bọt người có loại enzyme số động vật có vú khác ngựa ,chó, mèo Ptyalin bắt đầu thuỷ phân tinh bột từ miệng trình hoàn tất ruột non nhờ amylase tụy mà gọi enzyme amylopsin Amylase malt thuỷ phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm chất cho trình lên men nấm men Amylase loại enzyme phân bố rộng dãi tự nhiên loại enzyme ứng dụng rộng dãi công nghiệp , y tế nhiều lónh vực kinh tế khác , đặc biệt ngành công nghiệp công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột Amylase thu nhận từ hạt nảy mầm , nấm mốc , nấm men , vi khuẩn.Trong amylase thu nhận từ malt với số lượng nhiều , chủ yếu dùng sản suất bia seminar Hệ Enzim Amylase PHẦN : CƠ CHẤT seminar Hệ Enzim Amylase I CƠ CHẤT I.1 TINH BỘT Tinh bột: gluxit dự trữ phổ biến thực vật (khoai sắn hạt cốc) Hạt tinh bột có hình dáng khác với kích thước từ đến 15 µm Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1.633 – 1.648 Tinh bột chất keo háo nước điển hình, cấu tạo từ amyloza – mạch thẳng amylopectin Tỷ số amyloza amylopectin tinh bột thường vào khoảng : Cả hai cấu tạo từ gốc Ø α- D – glucoza Amylo có cấu tạo mạch thẳng Chúng liên kết nối α- 1.4 glucozit α- 1.6 glucozit nên tạo thành nhiều nhánh Ngoài amyloza amylopectin tinh bột chứa lượng nhỏ chất khác muối khoáng, chất béo, protit v.v… Hàm lượng chung chúng khoảng 0.2 – 0.7% Tinh bột không hoà tan nước lạnh, rượu ete Amyloza dễ tan nước nóng tạo nên độ nhớt dung dòch Amylopectin hoà tan nước nóng tạo dung dòch nhớt Trong nước nóng tinh bột hút nước trương nở tạo dạng gel Mức độ trương tinh bột phụ thuộc nhiệt độ Khi tăng dần nhiệt độ, dòch tinh bột biến thành dạng keo gọi hồ tinh bột Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi nhiệt độ hồ hoá tinh bột Trong thực tế tồn giới hạn nhiệt độ hồ hoá, tinh bột nguyên liệu gồm nhiều hạt có kích thước khác I.1.1 Amylose Amylose có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh ,dài khoảng 300 -1000 gốc glucose ,xoắn theo chiều lò xo xoắn có gốc glucose Cấu trúc xoắn giữ vững nhờ liên kết hidro tạo thành nhóm OH tự bên xoắn kết hợp với nguyên tử khác Ví dụ amylose tạo thành màu xanh kết hợp với Iot Nếu đun nóng Hệ Enzim Amylase seminar ,liên kết hidro bò cắt đứt Chuỗi amylose duỗi thẳng iot bò tách khỏi amilose dung dòch màu xanh Amilose thường phân bố phần bên hạt tinh bột Dung dịch amylose có độ nhớt thấp dung dòch amilopetin amylose bò kết tủa ancol butyric Hình :AMYLOSE I.1.2 Amylopectin Amylose có chứa liên kết 1-4 liên kết 1-6 glucozit Cấu trúc phân tử bao gồm nhánh trung tâm (chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh phát nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose Khối lượng phân tử amylopectin khoang 500000 -1 triệu Amylopectin phân bố mặt hạt tinh bột Dung dòch amylopectin có độ nhớt cao Khi đun nóng làm thay đổi sâu sắc không thuận ngòch cấu trúc phân tử amilopectin gây trạnh thái hồ hoá tinh bột Hình 2: AMYLOPECTIN Tinh bột bò thuỷ phân tác dụng enzim amylase axit tạo thành sản phẩm có khối lượng phân tử thấp gọi dextrin Các dextrin bò thuỷ phân hoàn toàn tạo thành gốc glucose Như sản phẩm thuỷ phân hoàn toàn tinh bột glucose Hệ Enzim Amylase seminar nhiên điều kiện xác đònh ,dưới tác dụng enzim disaccharit mantose lại sản phẩm chủ yếu sản phẩm thuỷ phân tinh bột I.2 GLICOGEN Glicogen thuộc glucan ,là polysacarit dự trữ người động vật Phân tử glicogen có công thức chung (C6H10O5)n phân nhánh giống phân tử amilopectin mức độ phân nhánh nhiều Phần lớn gốc glucose phân tử kết hợp với qua liên kết anpha -1,4 glucozit ,liên kết anpha -1,6 –glucozit chỗ phân nhánh phân tử glicogen có bò thuỷ phân tác dụng enzim amulase axit thuỷ phân hoàn toàn glicogen nhận anpha –D- glucose Glicogen hoà tan nước nóng cho màu dỏ tím đỏ nâu với iot Hình : Glycogen seminar Hệ Enzim Amylase PHẦN : ENZIM AMYLASE 10 seminar Hệ Enzim Amylase - > Hạt phải , tỷ lệ hạt ngoại lai chiếm 5% Không có hạt bò bệnh - > Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g - > Sức nảy mầm ( qua ngày thứ trình nảy mầm ) : 80 -90% - > Khả nảy mầm ( tính đến ngày thứ trình nảy mầm : > 95% ) - > Độ ẩm hạt khoảng 15% - > Dung trọng : 650 – 680g/l - > Hàm lượng protein : – 12% - > hàm lượng tinh bột > 63 – 65% b> SẢN XUẤT MALT Các bước quy trình sản xuất malt đại mạch : đại mạch - > làm > sấy bảo quản > ngâm hạt - > ủ mầm > malt tươi > sấy malt - > tách mầm rế > malt khô + Ngâm Hạt : Đại mạch ngâm nước đạt đến can bàng độ ẩm Chú ý đến thống khí khối hạt cách đảo trộn khối hạt thường xuyên Mục đích giai đoạn tạo độ ẩm cho hạt có điều kiện lấy đủ oxy vàđẩy co sản phẩm bất lợi cho trình nảy mầm hạt khối hạt Khi ngâm hạt , nước ngấm vào hạt cho thể tích hạt tăng nên, enzyme trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động hoạt tính enzyme mạnh dần thuỷ phân chất dự trữ có phân tử lượng cao hạt thành chất có phân tử lượng nhỏ đường , amino acid Vì , cần phải luôn ý đến thông khí , độ ẩm hạt nhiệt độ Hạt đại mạch khô hoạt lực α - amylase Khi hạt chuẩn bò nảy mầm xuất hoạt lực α - amylase hoạt lực tăng dần Đến ngày thứ ngày thứ trình nảy mầm ( nhiệt độ18–20 c), hoạt lực đạt đến mức độ tối đa , sau giảm xuống Vào lúc hoạt lực enzyme đạt đến mức tối đa phải ngừng trình nảy mầm cách sấy hạt nảy mầm nhiệt độ thích hợp * MỘT SỐ CHỈ TIÊU MALT TƯƠI PHẢI ĐẠT ĐƯC - Mùi Vò : có mùi dưa chuột 26 seminar Hệ Enzim Amylase - Hạt malt mềm , bóp vụn không nhão , dính tay - Chiều dài hạt từ 2/3 chiều dài hạt - Chiều dài rễ từ 1/2 đến lần chiều dài hạt - Hoạt động enzyme amylase : WK = 350 – 450 - Sấy malt : Sấy malt với mục đích làm giảm độ ẩm malt điều khiển malt khô có thành phần hoá học , màu sắc ,mùi vò thích hợp , đồng thời phải đảm bảo hoạt tính malt để đưa vào sản xuất bia Trong trình sấy , giai đoạn đầu độ ẩm cuả hạt cao nhiệt độ thấp ( 37- 40 C ) hoạt động thuỷ phân enzyme sảy mạnh giai đoạn hạt nảy mầm điều kiện thích hợp cho hoạt động nhiều loại enzyme Khi độ ẩm hạt cao mà nhiệt độ sấy tăng cao protein enzyme bò biến tính làm ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme Vì , độ ẩm hạt cao cần phải sấy nhiệt độ thấp Khi độ ẩm hạt giảm xuống đến mức cho phép ( mức độ an toàn cho enzyme ) bắt đầu tăng nhiệt độ sấy nhiệt độ sấy không làm sảy tượng caramel hoá , phản ứng melanoidin ……… • Đặc Điểm Của Malt Đại Mạch Khô Sử Dụng Trong Sản Suất Bia - Màu malt phải vàng tươi , vỏ óng ánh - Kích thứơc , hình dạng tương tự hạt đại mạch khô - Malt có mùi vò nhẹ - Không lẫn tạp chất không bò vỡ - Dung trọng : 530 – 560 g/l - Trọng lượng khô tuyệt đối 1000 hạt : 28 -38 g - Thành phần hoá học : + Độ ẩm tối đa cho phép giai đoạn bảo quản : 7% + Độ ẩm vừa sấy xong < 4,5 % + Thời gian thực đường hoá : 10 – 15 phút + pH dòch đường 5,5 – 6,5 + Thành phần malt khô ( % chất khô ) : Tinh bột : ; Pentozan hoà tan : 1,0 ; Hexozan pentozan không hoà tan : 9,0 ; Cellunose : 6,0 ; Saccharose : 5,0 ; Đường khử :4,0 ; Protein :10,0 ; Protein hoà tan : 3,0 ; Chất béo : 2,5 ; Tro : 2,5 + SƠ ĐỒ DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT MALT ĐẠI MẠCH 27 seminar Hệ Enzim Amylase III.2.1.2 MALT THÓC Đại mạch loại ngũ cốc trồng vùng ôn đới có khí hậu lạnh vùng nhiệt đới người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc , bắp để thay phần hay toàn malt đại mạch a > CÁC BƯỚC TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT MALT THÓC hạt lúa - > làm , phân loại > sấy bảo quản - > ngâm hạt > ủ mầm - > malt tươi - > sấy malt - > tách mầm rễ -> malt khô Trong qúa trình nảy mầm hạt , enzyme amylase , protease … , hoạt động mạnh xúc tác cho biến đổi sinh lý , sinh hoá hạt thuỷ phân chất cao phân tử tinh bột senllulose , protein thành chất đơn giản Quá trình nảy mầm xảy hạt có đủ điều kiện thích hợp độ ẩm , nhiệt độ Ngâm Hạt : hạt lúa có sẵn lượng nước dạng liên kết Nước từ bên thấm vào hạt hoà tan chất dự trữ , hoạt hóa enzyme xúc tác trình phân giải hợp chất cao phân tử hạt thành chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng trưởng phôi để hình thành mầm Phôi nơi hút nước mạnh Tốc độ hút nước mạnh thời gian đầu có chênh lệch áp suất thẩm thấu lớn môi trường bên tế bào bên hạt , đồng thời chất keo háo nước trương nở mạnh , sau , sức hút nước hạt giảm Ủ Hạt : việc ủ hạt trải qua giai đoạn 28 seminar Hệ Enzim Amylase Giai Đoạn : kéo dài ngày ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm , nhiệt độ khối hạt tang nhanh hoạt động hô hấp mạnh khối hạt cầnđược đảo 23lần/ngày Giai Đoạn : kéo dài ngày lúc chồi mầm rễ mầm tăng trưởng nhanh , nhiệt độ khối hạt tăng nhanh hoạt động hô hấp cao khối hạt cầnđược đảo 2-3 lần/ngày giai đoạn : ngày sau trình nảy mầm xảy chậm dầm , nhiệt độ tăng yếu khối hạt cầnđược đảo 2-3 lần/ngày * CÁC QUÁ TRÌNH XẢY RA TRONG QUÁ TRÌNH NẢY MẦM CỦA HẠT Khi nước bên thấm vào hạt , hợp chất cao phân tử bean hạt thấm nước trương nên , enzyme thuỷ phân hoạt động phân cắt chất thành chất đơn giản trạng thái hoà tan Các chất phần chuyển đến để nuôi phôi , phần bò tiêu hao hoạt động hô hấp phần lớn sử dụng để chuyển hoá thành chất cao phân tử mô nảy mầm Hoạt động hô hấp hạt cầnđược cung cấp oxy đồng thời thải khí CO toả nhiệt làm cho nhiệt độ khối tăng nên, cầnphải ý tới đảo trộn khối hạt Hoạt Động Của Enzyme : Trong khối hạt , enzyme dạng liên kết chúng chuyển sang trạng thái hoạt động hạt nảy mầm Ngoài có số enzyme tổng hợp Các enzyme hoạt động trình nảy mầm hạt lúa α - Amylase : Enzyme lày không hoàn toàn hoạt động hạt chín Hoạt tính Enzyme α - Amylase tăng dần trình nảy mầm hạt nhiệt độ 15-17 C , hoạt tính α - amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 trình nảy mầm ; nhiệt độ 28 - 30 C , hoạt tính enzyme α - amylase đạt cực đại vào ngày – β - Amylase : Enzyme β - amylase tồn dạng liên kết số hoạt động yếu hạt chín hoàn toàn Hoạt động tăng nên trình hạt nảy mầm Thời gian để hoạt động enzyme đạt đến cực đại tuỳ thuộc vào nhiệt độ * Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong trình nảy mầm , hoạt động ezyme tăng nên mạnh hoạt động hô hấp hạt gia tăng Hoạt động hô hấp hạt mạnh vào ngày thư – nhiệt độ 29 Hệ Enzim Amylase seminar 27 -28 C cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm hạt , nhiệt độ vào lượng O cung cấp III.2.2 NGUỒN VI SINH VẬT Nguồn thu nhận chủ yếu : nấm mốc , xạ khuẩn , nấm men vi khuẩn …… Khi nuôi VSV tạo amylase có hai trình liên quan mật thiết với Quá trình tổng hợp sinh khôi vsv trình tích tụ enzyme tế bào hay môi trường số VSV , trình tổng hợp amylase tiến hành song song với trình sinh trưởng , nghóa tích tụ enzyme phụ thuộc vào tuyến tính tăng khối Yêu cầu chung Muốn thu nhận enzyme amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập , chọn giống vsv để tuyển lấy chủng hoạt động mạnh , đồng thời phải tiến hành lựa chọn chất cảm ứng thành phần môi trường tối thích tiêu chuẩn hoá điều kiện nuôi Như tổng hợp enzyme amylase phụ thuộc vào tính chất di truyền vsv mà phụ thuộc vào việc tuyển chọn điều kiện nuôi đặc hiệu Ngoài yếu tố hoá học ( thành phần môi trường ) , điều kiện lý hoá trình nuôi cấy có ý nghóa lớn sinh tổng hợp enzyme amylase Trong yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme amylase trình nuôi vsv , thành phần môi trường , tính chất lý môi trường , độ tiệt trùng , độ ẩm ban đầu , độ thoáng khí , nhiệt độ nuôi pH môi trường … Là yếu tố tối quan trọng Nuôi vsv tạo amylase phương pháp bề mặt  Yêu cầu môi trường thành phần dinh dưỡng Yêu cầu thành phần môi trường nuôi vsv tạo amylase giống yêu cầu môi trường nuôi vsv tạo enzyme khác tính hoàn thiện Hầu hết vsv tạo amylase hất thụ carbon chủ yếu dạng hợp chất hữu ( tinh bột , dextrin……) hro dạng H2O hợp chất hữu , oxy thành phần cấu tử môi trường dạng oxy phân tử 30 seminar Hệ Enzim Amylase Cấu tử môi trường vsc tạo amylase phương pháp lên men bề mặt cám mì , cám gạo Cám mì , cám gạo nguyên liệu hoàn hảo cấu tử môi trường để nuôi vsv không cần bổ xung thêm chất khác Cám mì có 16 – 22% tinh bột , 10 – 12% protein, amino acid quan trọng methionine ( 0.19%), cystine ( 0.3% ) , arginine (1%) , lysine ( 6%) , tryptophan (0.3%), – % chất béo , 10.3% celulose , nguyên tố tro ( Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P -0.94% ) nguyên tố vi lượng chất khác Cám gạo có khoảng 20% tinh 10 – 15% chất béo , 10 – 14% protein , – 16% celulose, chất hoà tan không chứa nitơ ( 37 – 59 % ) Chất lượng cám gạo , cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực cám gạo Cám không chứa tinh bột 20 – 30 % Nên dùng cám tốt, cám vò chua hay vò đắng ,không hôi mùi mốc Độ ẩm cám không 15%, tạp chất độc không 0.05% … Tuy phế liệu công nghiệp xay xát , cám tưng đối đắt tiền , lữa trình nuôi vsv , chất dinh dưỡng không sử dụng hết , thay cám số cấu tử rẻ tiền Cấu tử thường mầm mạch ( 15 – 20 % ) , trấu ( – 5%), mùn cưa ( -10% ) …… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn ( sau cách ly enzyme ) cấu tử môi trường ( Silova, Fenikxov ) 1967 , đảm bảo chế độ tuyệt trùng Cám chất phụ gia chứa nhiều bào tử vsv khác nên cần phải tuyệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường canh trường sản xuất khôngchứa vsv ngoại lai Cần trùng áp suất 1- 5atm vòng -6 , trùng nóng nhiệt độ 120 oC 90 phút Khi trùng cho vào 0.2% formalin ( 40% ) 0.8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường  Độ ẩm tối thích cuả môi trường : Trong điều kiện sản xuất , độ ẩm ban đầu tối thích ( Asp.niger , Asp.awamort , Asp.flavus , Asp.aryzae ) môi trường 58 – 60% phải giữ cho môi trường có độ ẩm suốt trình nuôi Độ ẩm mà tăng 55 – 70% làm giảm độ thoáng khí , thấp 50 – 55% kìm hãm sinh trưởng phát triển vsv tạo enzyme amylase Trong điều kiện tuyệt trùng tốt ( môi trường bình tam giác , tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực amylase cao 31 seminar Hệ Enzim Amylase thu độ ẩm 65 – 68 % ) Cần nhớ nuôi điều kiện không vô trùng tuyệt đối ( khay ) , độ ẩm môi trường không vượt 60% , cao dễ bò nhiễm khuẩn Tuy , việc giữ độ ẩm cao ( việc phòng ngừa hạn chế hong không cảu canh trường ) suốt trình sinh trưởng nấm sợi lại có ý nghóa to lớn tạo thành enzyme nh hưởng độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp enzyme amylase sau : Phương 20 34 42 án thí Độ Hoạt độ Độ Hoạt độ Độ Hoạt độ nghiệm ẩm ẩm amylase đv/g ẩm amylase đv/g % amylase % canh trường % canh trường khô đv/g canh khô trường khô Khay để 27,8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 hở Khay đậy 46,4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 nắp o Bảng nh hưởng việc giữ độ ẩm trình sinh trưởng tới tạo α -amylase Asp.ozyzae nuôi phương pháp bề mặt Qua bảng số liệu thấy rõ hoạt lực α -amylase canh trường nuôi nấm sợi , bò hong khô giảm gần hai lần Điều khẳng đònh cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường mức độ tối thích Cần thông khí liên tục suốt thời kì sinh trưởng vsv Trong trình sinh trưởng vsv tiêu thụ 25 – 35% chất dinh dưỡng môi trường thải lượng lớn nhiệt sinh lý CO Vì cần phải thải nhiệt thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tươngs đối khoảng 100% Chế độ thông khí liên tục , gián đoạn ( không khí tự nhiên ) tuỳ thuộc vào chiều dày lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách tầng khay đóa khay Thường giai đoạn sinh trưởng thứ phải thông khí vào phòng nuôi khoảng -5 lần thể tích không khí thể tích phòng , giai đoạn thứ 30 – 60 thể tích không khí thể tích phòng nuôi / , giai đoạn thứ giảm 10 – 12 thể tích không khí 32 seminar Hệ Enzim Amylase  Nhiệt độ nuôi : Toàn chu kì sinh trưởng nấm mốc cám chia làm thời kỳ :  Thời kỳ trương nảy mầm đính bào tử ( nấm mốc 10 – 11 , vi khuẩn – ) Trong thời kỳ phải đốt nóng không khí phòng nuôi giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp 23 – 30oC nấm mốc trì nhiệt độ 32 – 38 oC cho vi khuẩn Độ ẩm tương đối không khí 96 -100%  Thời kỳ sinh trưởng nhanh hệ sợi ( kéo dài vòng -18giờ ) giai đoạn nấm mốc hô hấp mạnh tạo lượng nhiệt sinh lý lớn Kết lớp sợi nấm mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 -40oC , cao tới 47 oC cận phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đẹp nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28 – 29oC độ ẩm cao vào phòng nuôi  Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ ( kéo dài từ 10 -20 ) Trong thời kỳ trình trao đổi chất yếu , toả nhiệt giảm mạnh Các enzyme amylase tổng hợp mạnh mẽ Theo Rodxevits ( Pozerur, 1967 ) ngày đầu giai đoạn sinh trưởng thứ , thứ hai , nấm mốc Asp.ozyzae tạo 7.5 – 8% enzyme , vòng 12h sau , hoạt lực oligo – 1.6 – glucosidase tăng lên gấp 10 lần Đối với đa số vsv giai đoạn nên hạ nhiệt độ xuống – 4oC so với giai đoạn đầu Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số nấm mốc môi trường rắn 28 -30 oC , cho Bac.subtilis 35 – 37oC Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn : thời gian nuôi để có lượng enzyme cực lớn thường xác đònh thực nghiệm Tuỳ thuộc vào tính chất chủng vsv ngừng tổng hợp enzyme mà ngừng sinh trưởng nấm mốc vào lúc thấy cần thiết Sự tạo bào tử tượng không mong muốn thường làm giảm hoạt lực enzyme Đối với đa số nấm mốc Aspergillus , tạo enzyme amylase cực đại thường kết thúc nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thời gian nuôi để có tích luỹ amylase cực đại loại nấm sợi vi khuẩn sau : - Chủng thời gian nuôi ( ) 33 seminar - Asp.oryzae – 476 Asp.oryae – KC Asp.oryae 8F1 Asp.awamori 22 Bac.subtilis Hệ Enzim Amylase 24 -25 30 – 36 24’ – 30 36 68 – 72 ( 30oC ) Nuôi vsv tạo amylase phương pháp bề sâu  Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho môi trường nuôi vsv tạo enzyme amylase có chất cảm ứng : tinh bột , dextrin hay maltose Nguồi nito dinh dưỡng thường dùng nitơ vô ( NaNO ) Sinh tổng hợp α -amylase hoạt động chủng Aspergillus thường thấy môi trường có muôi acid sulfuric Đối với sinh trưởng số nấm sợi tạo maltase oligo – 1.6 – glucoamylase hoạt động lại cần có có mặt Mg môi trường Để tạo điều kiện cho vsv phát triển tốt sinh nhiều amylase người ta cho thêm vào môi trường loại nước chiết nước chiết mầm mạch , nước chiết ngô , nước chiết đậu lành ,… nguồn bổ xung amino acid , vitamin tạp chất sinh trưởng Dưới số môi trường lỏng dùng để vsv tạo enzyme amylase Đối với Aspergillus, người ta thường nuôi môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6%tinh bột ; 0.9% NaNO3 ; 0.001% FeSO4 ; 0.1% KH2PO4 ; 0.05%MgSO4; 0.05% KCl nước máy Để tăng cừơng khả sinh trửơng vsv khả tạo enzyme thêm nước chiết mầm mạch , nước chiết ngô , nước cám nấu nước chiết bột đậu nành  Nhiệt độ nuôi : Nhiệt độ nuôi yếu tốt quan trọng với sinh trưởng vsv tạo thành enzyme amylase Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ dẫn tới giảm hoạt lực amylase Nhiệt độ muôi tối thích nấm sợi thuộc giống Aspergillus 30 – 32 oC ( có Asp.oryzae – – 15 Asp.awamori 22 ) , Bacillus Môi trường thích hợp tạo nhiều amylase nhiệt độ 37 oC số vi khuẩn khác lại có nhiệt độ tối thích cao Bac.circulans phát triển mạnh nhiệt độ 65– 70oC song lại tạo nhiều amylase nhiệt độ 50 oC người ta thường cấy giống 70oC sau tiến hành cho tích luỹ nhiệt độ 50 oC nuôi chủng loại môi trường nước lỏng có nước nấu khoai tây , 34 seminar Hệ Enzim Amylase pepton phấn Nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới độ bền enzyme tạo thành amylase Bac.coagulans Bac.searothermophilus nuôi 35oC 55oC có độ bền nhiệt khác xa Khi giữ nhiệt 90 oC amylase chủng sinh trưởng nhiệt độ 35 oC bò 90 – 94% hoạt độ ban đầu ; lúc amylase chủng nuôi nhiệt độ 55oC bò vô hoạt có 10 -12% Các vsv ưa nhiệt sinh tổng hợp nên amylase bền nhiệt Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu lớn nhiều lónh vực sản xuất Ngoài nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại tiện lợi cho việc sản xuất công nghiệp, nuôi nhiệt độ cao tạo điều kiện chọn lọc cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe độ tuyệt trùng , đồng thời nuôi đỡ bò nhiễm  Sục khí khấy trộn Phần lớn vi sinh vật tạo amylase vsv hiếu khí Vì sinh trưởng cuả chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan dòch nuôi cấy Trong trình sinh trưởng ,vsv sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hoà tan môi trường lỏng phải luông bổ xung Chính lẽ , việc sục khí khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới trình sinh trưởng tích luỹ sinh khối sinh tổng hợp enzyme vsv : Việc khuấy đảo cách sau :  Sục không khí vô trùng vào thiết bò nuôi  Bằng máy kiểu chuyên dùng  Bằng tác dụng hiệp đồng sục khí lẫn máy khuấy  Bằng tác dụng khí sinh lên men Ex Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp 10 – 12m không khí vô trùng ( có nhiệt độ không 40 oC ) 1m3 môi trường với thời gian nuôi khoảng 68 – 72giờ Với thời gian nuôi ngắn thùng lên men nhân giống ( 48giờ ) thùng lên men sản xuất ( 48 – 52giờ ) lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae ( – -15 ) phải 30m 3/m3 môi trường /giờ thùng nhân giống 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae ( – -15 )tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường ( nồng độ oxy hoà tan đo máy cực phổ với điện cực kiểu clark ) Chủng có vận tốc tiêu thụ oxy hoà tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm Vận tốc tiêu thụ O giảm dần từ lúc bắt 35 seminar Hệ Enzim Amylase đầu pha ổn đònh Nuôi vsv ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí nuôi vsv ưa ẩm III.3.XÁC ĐịNH HOạT Độ CủA ΑNPHA_AMYLAZA III.3.1.NGUN TắC Amylaza có khả thủy phân tinh bột tạo thành dextrin có phân tử lượng khác Khi có tác dụng với iot chúng tạo màu Đo cường độ màu tạo thành tính hoạt độ amylaza Đơn vị hoạt độ amylaza lượng enzyme xúc tác thủy phân g tinh bột atn thành dextrin có phân tử lượng khác nhiệt độ 30oC pH cho amylaza malt 4,8 – 4,9 cho amylaza nấm mốc 4,7 cho amylaza vi khuẩn 6,0 Amylaza xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột , glicogen , polysacarit tương tự Amylaza chia làm loại : - α_amylaza ( 1,4- α-D-Glucan-Glucanohydrolase ; EC 3.2.1.1 ) có nước bọt , hạt hòa thảo nảy mầm , tụy tạng , nấm mốc , vi khuẩn Nó phân giải liên kết 1,4-glicozit chuỗi polysacarit ( nên gọi “endol amylaza” ) tạo thành dextrin phân tử thấp Dưới tác dụng enzyme ,dung dịch tinh bột nhanh chóng bị khả tạo màu với dung dịch iot độ nhớt giảm mạnh α_amylaza bền với nhiệt , bền với acid - β_amylaza ( EC 3.2.1.2) có nhiều hạt , củ thực vật Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glicozit từ đầu khơng khử tạo thành chủ yếu maltaza dextrin phân tử lớn Mất hoạt tính nhiệt độ tên 70oC bền với axit α_amylaza - Glucoamylaza có nhiều vi sinh vật, gan động vật Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4- 1,6-glicozit đầu khơng khử chuỗi polysacarit Sản phẩm chủ yếu glucoza dextrin Nó bị bất hoạt nhiệt độ 70oC Nhiều glucoamylaza hoạt động mạnh pH 3,5 – 5,5 III.3.2 HĨA CHấT - Dung dịch HCl 0,1N : cho vào bình định mức 100ml 8,2 ml HCl đặc , thêm nước cất đén vạch ngấn , lắc - Dung dịch iot gốc : hòa tan 0,5 giọt iot cà g KI nước , lắc nhẹ Chuyển dung dịch vào bình định mức 200ml , dùng nước cất dẫn thể tích đến vạch Cất giữ dung dịch lọ màu , dùng vòng tháng - Dung dịch iot phân tích :pha lỗng ml dung dịch iot gốc dung dich HCl 1,2N bình định mức 100 ml Trước dùng dung dịch iot phân tích cần kiểm tra mật độ quang bước sóng 453nm 0,16 ( 0,01 ) 36 seminar Hệ Enzim Amylase sai lệch mật độ quang cần phải hiệu chỉnh cách thêm vài giọt dung dịch iot gốc - Dung dịch chế phẩm enzyme gốc : cân 0,1 g chế phẩm cần nghiên cứu cho vào cốc thủy tinh dung tích 25 ml hòa với nước chuyển vào bình định mức 100 ml , thêm nước cất đến vạch ngấn , trộn , lọc Có thể bảo quản dung dịch enzyme ngày – 4oC - Dung dịch chế phẩm enzyme nghiên cứu : pha lỗng dung dich enzyme gốc cho ml dung dịch enzyme phân tích chứa lượng enzyme đủ để thủy phân tinh bột từ 20% đến 70% Muốn cần lượng dung dịch gốc khác tùy thuộc vào hoạt độ chế phẩm enzyme mà pha lỗng nước tới 50 ml ( hoạt độ từ 20 – 700 đơn vị/g ) tới 200 ml ( hoạt độ 700 đơn vị/g trở lên ) - Dung dịch đệm axetat pH 7,4 dùng để xác định amylaza nấm mốc , pH 4,9 dùng để xác định amylaza malt - Dung dịch tinh bột 1% : hòa g tinh bột ( theo trọng lượng khơ tuyệt đối ) bình định mức 100 ml với 50 ml nước cất , lắc tinh bột tan hòa tan hồn tan , làm nguội bình thêm 10 ml dung dịch đệm axetat pH ứng với phản ứng ) thêm nước cất đến vạch , lắc Chuẩn bị dung dịch tinh bột dùng ngày III.3.3 TIẾN HÀNH Cho vào bình nón 50 ml Mổi bình 10 ml dd tinh bột 10%đặt vào máy ủ nhiệt 30 độ C giữ 10 phút Thêm vào bình ml dòch chiết enzim Khuấu giữ 10 phút Lấy từ bình 0.5 ml hỗn hợp cho vào bình khác có chứa 50 ml dòch chứa iot.Lắc bình đối chứng có màu xanh ,bình thí nghiệm có màu tím Đo độ hấp thu bước sóng 656 nm mật độ quang bình đối chứng (OD1) lượng tinh bột ban đầu Mật độ quang bình thí nghiệm (OD2) lượng tinh bột lại sau anpha amylase thuỷ phân III.3.4 TÍNH KẾT QUẢ Lượng kết thuỷ phân tính theo công thức C=0.1x(OD1-OD2)/OD1 Với : OD1 mật độ quang dung dòch đối chứng OD2 mật độ quang dung dòch nghiên cứu 0.1 lượng tinh bột phân tích 37 seminar Hệ Enzim Amylase PHẦN 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZIM AMYLASE 38 seminar Hệ Enzim Amylase IV ỨNG DỤNG CỦA AYLASE Enzim amylase enzim thuỷ phân tinh bột ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp - Trong công nghiệp sản xuất rượu bia (giai đoạn đường hoá tinh bột ) - Trong công nghiệp sản xuất tương ,mạch nha ,mật, đường glucose … - Từ tinh bột làm cơm rượu làm thức ăn cho gia súc giàu chất dinh dưỡng - Amylase đựoc ứng dụng sản xuất làm bánh mì ,làm cho bánh nở xốp thơm ngon - Trong công nghiệp dệt chế phẩm enzim amylase để rũ hồ vải tẩy lớp hồ bột mặt vải Làm cho vải mềm mòn ,dễ tẩy trắng dễ bắt màu nhuộm - Trong công nghiệp chế biến dược phẩm - Trong cơng nghiệp sản xuất bột 39 Hệ Enzim Amylase seminar TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 [...]... (EC.3.2.1.68) Enzim này không có khả năng thu phân giống như pululan và không thể cắt đứt liên kết α - 1,6 của các phân tử chứa ít hơn 3 liên kết α -1,4 23 seminar Hệ Enzim Amylase PHẦN 3: THU NHẬN ENZIM AMYLAZA 24 seminar Hệ Enzim Amylase III.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME AMYLASE Enzim amylase có trong các tế bào vinh vật , động thực vật ,các loại nấm mốc Muốn thu nhận en zim cần chiết rút ra khỏi tế... ).Tốc độ thu pân cũng phụ thu c vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thu phân ,cũng như kích thùc và cấu trúc của cơ chất bò thu phân Nhất là với các α glucan mạch dài (amyloza và amylopectin )thì bò thu phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit Hình 11 Cơ chế tác dụng của enzim γ - amylase II.3.3 TÍNH CHẤT -> Glucoamylase có khả năng thu phân... đại cũng tuỳ thu c vào nhiệt độ * Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng Hoạt động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thư 4 – 6 ở nhiệt độ 29 Hệ Enzim Amylase seminar 27 -28 0 C và cường độ hô hấp phụ thu c vào độ ẩm của hạt , nhiệt độ vào lượng O 2 cung cấp III.2.2 NGUỒN VI SINH VẬT Nguồn thu nhận chủ yếu... ion ,điện di lọc gel…v.v.v III.2.NGUỒN THU III.2.1 THỰC VẬT III.2.1.1.MALT ĐẠI MẠCH Malt là từ chỉ trạng thái hạt nảy mầm Quá trình sản xuất malt gồm các bước sau : Ngâm hạt , ủ hạt cho nảy mầm , sấy malt tươi , tách mầm , bảo quản malt khô a> YÊU CẦU VỀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU - > Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi 25 seminar Hệ Enzim Amylase - > Hạt phải thu n , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được... ổn đònh với nhiệt Tốc độ phản ứng của amylase phụ thu c vào pH , nhiệt độ , mức độ polyme hoá của cơ chất Các Enzyme amylase từ các nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất , cơ chế tác dụng vào sản phẩm cuối cùng của quá trình thu phân khác nhau Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần , tính chất , nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thu phân khác nhau II.1 ENZIM : α – AMYLASE II.1.1... 1,4 và α - 1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thu phân các liên kết α - 1,2 và α - 1,3 glucoside -> Glucoamylase có khả năng thu phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose , mà không cần có sự tham gia cuả các loại enzyme khác Glucoamylase thu giải các polysaccharide thu giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so... nhau ở khả năng thu phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền củachúng Amyloglucosidaza I tự hấp thụ và thu phân tinh bột ở trang thái rắn ,ngược lại amyloglucosidaza II không có cả hai tinh chất này II.3.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG Amyloglucosidaza có thể giải phóng ra beta-D-glucoza bằng cách thu phân lặp lại nhiều lần các liên kết α -1,4 của mạch α - glucan từ đầu không khử chúng cũng thu phân được... tụ enzyme phụ thu c vào tuyến tính của sự tăng khối Yêu cầu chung Muốn thu nhận các enzyme amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập , và chọn giống vsv để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh , đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi Như vậy sự tổng hợp enzyme amylase không những phụ thu c vào tính... người ta còn gọi α -amylase là dextrin hoá hay amylase dòch hoá 14 seminar Hệ Enzim Amylase Hình 6 :Cơ Chế Thu Phân Của α - Amylase 15 Hệ Enzim Amylase seminar II.1.3 ĐẶC TÍNH CỦA α -AMYLASE -> α -amylase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần amino acid khác nhau , mỗi loại α -amylase có nguồn gốc tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α Amylase là một protein giàu tyrosine , tryptophan, acid glutamic... glucoside hay dextrin -6glucocanhydrolase Hai loại enzyme này đều thu phân dextrin triệt để hơn α và β - amylase do đó trong dung dòch thu phân có nhiều maltose hơn Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 40 0 C và pH tối thích là 5,1 II.5 PULULANAZA (PULULAN -6- GLUCANOHYDROLAZA ) (EC 3.2.1.4) Enzim này có thể thu phân các liên kết α - 1,6 của tinh bột ,glucogen , pululan và