tìm hiểu về hệ enzyme protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC  SEMINAR: HỆ ENZYME PROTEASE GVHD: SVTH: LỚP: NGUYỄN THỊ THU SANG LÊ THỊ NGỌC BÍCH VÕ VĂN GIÀU PHAN CHÍ HIẾU TRẦN THỊ KIM YẾN 08SH1N NIÊN KHÓA: 2005-2006 MỤC LỤC: Trang Mục lục Lời mở đầu .3 Phần I: Sơ lược enzyme protease .4 1.Giới thiệu chung enzyme protease .5 2.Phân loại protease Phần II: Các loại enzyme protease .7 A.Protease thực vật I.Bromelin II.Papain 12 III.Ficin 22 B.Protease động vật 28 I.Đặc điểm chung nguồn enzyme protease từ động vật 28 1.Tính chất phân loại .28 2.Nguồn cung cấp enzyme động vật 29 II.Một số tính chất protease từ nguồn động vật 31 1.Protease acid 31 1.1 Pepsin 31 1.2 Renin .38 2.Protease kiềm 40 2.1 Pancreatin 40 2.2 Trypsin .41 2.3 Chymotripsin 47 C.Protease vi sinh vật 51 I.Nguồn thu nhận enzyme protease 51 II.Một số loại enzyme vi sinh vật 53 1.Subtilisin .53 2.Colagenase 56 Tài liệu tham khảo 58 Hệ enzyme protease - trang - LỜI MỞ ĐẦU Enzyme chất xúc tác sinh học ý nghóa cho trình sinh trưởng, sinh sản động vật, thực vật vi sinh vật, mà đóng vai trò quan trọng công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, công nghệ gen bảo vệ môi trường Ngày nay, có nhiều nhóm enzyme hydrolase nhóm enzyme xúc tác thủy phân Trong quan trọng protease Protease nhóm enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide, liên kế chủ yếu phân tử protein peptide Seminar trình bày protease có động vật, thực vật vi sinh vật Qua biết tính chất đặc điểm loại protease Trong trình làm seminar không tránh khỏi sai sót Rất mong cô bạn đóng góp ý kiến cho nhóm Xin chân thành cảm ơn Nhóm thực Hệ enzyme protease - trang - PHẦN I SƠ LƯC VỀ ENZYME THUỶ PHÂN PROTEASE Hệ enzyme protease - trang - GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE - Chúng ta biết protein có vai trò quan trọng đời sống sinh vật trái đất, thành phần cấu tạo nên tế bào tham gia vào chế xúc tác sinh lượng ( enzyme), bảo vệ thể ( kháng thể), chế vận chuyển O v.v… Hàng ngày lượng protein tao ra, hấp thu vào, chuyển hoá lớn Nhưng quan hay thành phần thể tồn độc lập mà không chòu kiểm soát quan khác thể Điều xảy nguy hiểm Protein , tạo hoài mà chế phân huỷ, thể có cấu trúc đảm nhận chức phân huỷ protêin hợp chất Cấu trúc gọi la protease - Protease enzyme có chức phân huỷ protein ( proteolytic) , thường có tên gọi khác proteinase, peptinase hay C – N hydrolase Enzyme phân cắt liên kết peptide L-acid amin PHÂN LOẠI PROTEASE [1,2] Hiện có nhiều cách để phân loại protease a) Dựa vào nguồn thu enzyme chia thành : - Protease động vật : pepsin, Tripsin, chymotripsin, …… - Protease thực vật : papain, bromelin, ficin…… - Protease vi sinh vật: subtilisin, Protease kiềm , acid…… b) Dựa vào phân bố chia làm nhóm: - protease nội bào: enzyme hoạt động chủ yếu tế bào, lyzosome, ví dụ capthesin… - protease ngoại bào : enzyme hoạt dộng mô, quan đặc hiệu tế bào, ví dụ enzyme đường tiêu hoá pepsin, chymotripsin… c) Tính đặc hiệu chất chia thành: - endopeptidase: enzyme thuỷ phân liên kết mạch.Chủ yếu phân giải liên kết peptide nằm phân tử protein tạo thành đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton…).Nhóm protease tiêu hóa chủ yếu người động vật gồm có : pepsin rennin có dòch dày, trypsin Hệ enzyme protease - trang - chymotrypsin tuyến tụy niêm mạc ruột non thuộc nhóm enzim Ở thực vật có: papain, bromelin… - Exopeptidase: enzyme thuỷ phân liên kết đầu mạch Chủ yếu phân cắt liên kết peptide hai đầu mạch ví dụ : nhóm carboxypeptidase aminopeptidase phân giải liên kết từ đầu mạch có nhóm carboxyl amine tự Ngoài có dipeptidase phân giải dipeptide thành aminoacid tự d) Dựa vào nhóm chức TTHĐ: - Protease serin: TTHĐ có nhóm OH như: tripsin, subtilopeptidase - Protease cystein ( thiol) : TTHĐ có nhóm SH như: papain, Bromelin ……… - Protease aspartic : TTHĐ có nhóm COOH như: pepsin, renin - Protease kim loại : TTHĐ có nguyên tố kim loại: cacbonxypeptidase A… Hình 1: Một số loại Protease e) Dựa vào độ pH hoạt động chia thành : Protease acid : pepsin, rennin,… hoạt động vùng pH acid Protease kiềm : trypsin , chymotrypsin, hoạt động vùng pH kiềm Protease trung tính : amylase, papain, hoạt động vùng pH trung tính Hệ enzyme protease - trang - PHẦN II: CÁC LOẠI ENZYME PROTEASE Hệ enzyme protease - trang - A PROTEASE THỰC VẬT I.Bromelin Đặc điểm chung Bromelin [1] Bromelin tên gọi chung cho nhóm enzim thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ họ Bromeliaceace đặc biệt dứa (thân trái) Bromelin có vai trò y học nên nghiên cứu nhiều Bromelin enzim thuỷ phân protein, phân cắt protein thể vi sinh vật Một lợi ích ý đến chất giúp cho tiêu hoá Vì hoạt động môi trường acid dày môi trường kiềm ruột non Bromelin thay cho enzim tiêu hoá khác pepsin trypsin Bromelin có tác dụng kháng viêm có hiệu việc chữa trò bệnh thấp khớp, chuyên gia y tế đề nghò sử dụng bromelin chất giảm đau, kháng viêm kháng sưng Hiệu bromelin làm giảm lượng prostaglandin thể gây đau viêm thấm chất dinh dưỡng qua mô cách ngăn cản tiền chất gây viêm Bromelin hoạt động tốt pH từ 6-8, bromelin có hoạt tính xúc tác tương tự papain ficin Nó có trọng lượng phân tử khỏang 33.000 Da, lớn gấp 1.5 lần so với papain Tính chất Bromelin [1] Thành phần chủ yếu bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein Trong dòch chiết bromelin có chứa peroxydase, phosphatase acid chất cản protease 2.1 Cấu tạo hóa học : Bromelin thân protease khác với protease thực vật khác papain, ficin chỗ glycoprotein, phân tử có glycan gồm manose, glucosamine, xylose fructose Sợi hydrate carbon liên kết hóan vò với sợi polypeptide Trong sợi hydrat carbon dường nửa sợi không liên quan đến chế xúc tác phân tử Tuỳ theo thành phần aminoacid thân và phương pháp thu nhận mà thành phần amino acid có khác Bromelin có thành phần amino acid thay đổi khoảng 321 -> 144 amino acid bromelin 283 ->161 amino acid Hệ enzyme protease - trang - fructose OH Hình 2: Cấu tạo sợi Hydratcacbon Bromelin OH OH OH OH CH2OH maltose OH CH2 maltose OH OH maltose OH OH OH OH xylose glucosamine CH2O H NHCON H3 CH2OH NH-COCH2-CH C OH N NHCON H3 Bromelin thân sợi polipeptide có amino acid đầu amine valine đầu cacbonhidrat glycin, bromelin có amino acid đầu amine alanin 2.2 Cấu trúc không gian bromelin Murachi Busan phân tích cấu trúc bậc bromelin nhận thấy cách xếp amino acid phân tử bromelin sau: Ser-Val-Lys-Asn-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp- -Gly-Cys-LysBromelin protease trung tâm hoạt động có chứa cysteine hai sợi polypeptide liên kết với cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu có cách xếp phức tạp Trong phân tử Bromelin thân có chứa nhóm Sulfhydryl có vai trò chủ yếu họat tính xúc tác phân tử có tất cầu nối disulfite Ngòai ra, có ion Zn2+ có lẽ có vai trò trì cấu trúc không gian enzim 2.3 Tính chất vật lí Các nghiên cứu tính chất vật lí Bromelin thân dứa Murachi cộng nghiên cứu công bố vào 1964 sau: Hệ enzyme protease - trang - Bảng 1: Những tính chất vật lí Bromelin thân Hằng số sa lắng Hằng số khuyếch tán Thể tích riêng phần Độ nhớt bên Tỷ số ma sát Điểm đẳng điện Sự hấp thu Trọng lượng phân tử S D V [I] f/f0 Pl A1%cm 280nm 2,73S 7.77x10-7 cm2/s 0,743ml/g 0,039dl/g 1,26 9,55 20,1 33.200* 32.100** 35.500*** *: tính phương pháp sa lắng- khuếch tán **: Tính từ số sa lắng độ nhớt bên ***: Tính phương pháp Archibald 2.4 Hoạt tính phân giải Bromelin Bromelin có họat tính khác : peptidase, amidase esterase Bromelin thân có nhiều chất tự nhiên thủy phân chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp Bảng 2:Khả phân giải casein Bromelin: Cơ chất casein Hoạt tính phân giải casein(UI/mg) Bromelin thân Bromelin xanh Bromelin chín 7.4 4.0 3.0 Bảng 3: Khả phân giải chất nhân tạo-BAA(Benzoyl-L-Arginine amide) Bromelin: Hoạt tính phân giải (UI/mg) Bromelin thân Bromelin xanh Bromelin chín BBA 3.7 9.1 7.2 Bromelin xanh có hoạt tính phân giải BAA cao bromelin thân chín Cơ chất 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelin Giống chất xúc tác sinh học khác bromelin chòu ảnh hưởng yếu tố: nồng độ chấ, pH, nhiệt độ, ion kim loại, số nhóm chức, phương pháp ly trích …… Các yếu tố thiệt độ , pH thích hợp cho hoạt động phản ứng xúc tác bromelin không ổn đònh phụ thuộc vào yêu tố khác chất chất , nồng độ chất , nồng độ enzym thời gian phản ứng, có mặt chất hoạt hoá… Hệ enzyme protease - trang 10 - d Hoạt động tính đặc hiệu : Trypsin có tác dụng hầu hết chất protein, bất chấp protein có trọng lượng phân tử lớn hay nhỏ, tác dụng protein bị biến tính tốt protein chưa bị biến tính Trypsin có tác dụng hemoglobin, albumin biến tính huyết tương, collagen hay albumin trúng cần phải xử lý sơ với nhiệt trypsin có tác dụng Trypsin khơng làm đơng tụ sữa pepsin, rennin ,chymotrypsin Trung tâm hoạt động trypsin gồm gốc serrin (vò trí 83) hai gốc histidin ( vò trí 29 46) Nhờ cấu trúc bậc mà gốc gần không gian Hình 14: Trung tâm hoạt động trypsin: hình chữ nhật để cầu nối disunfua Trung tâm hoạt động Trypsin có thứ tự amino acid : -Gly – Asp – Ser – Gly – Pro – Trypsin loại enzym thủy phân protein khơng triệt để Khi sử dụng Trypsin có 1/3 liên kết peptide phân tử protein bị thủy phân, phần lại peptide có phân tử ngắn Hệ enzyme protease - trang 44 - Trypsin cắt liên kết tạo nhóm (–COOH) lysine hay arginin nhóm amine ( -NH2) amino acid trýpin không cắt liên kết giàu lysine arginine Các phân tử protein bò cắt tạo đoạn peptide mạch ngắn amino acid tự tryptophan, tyrosine Trypsin -CO-NH-CH-CO + H R1 OH NH–CH- -CO-NH-CH-COOH + H2N–CH- R2 R1 R2 Các phân tử protein bò cắt trypsin tạo peptide có trọng lượng phÂn tử nhỏ tạo amino acid tự tryptophan, tyrosine Trypsin phân cắt cách chọn lọc liên kết peptide nhóm –COOH gốc lysine arginin - NH – CH – CO–NH–CH - CO R1 Lys Arg -NH –CH – CO R3 Ngồi hoạt động thủy phân liên kết peptide , trypsin thuỷ phân liên kết ester Hệ enzyme protease - trang 45 - Hình 15: Cơ chế thuỷ phân Serine Proteases Hệ enzyme protease - trang 46 - II.2.3.CHYMOTRYPSIN: [E.C.3.4.21.1] [1,5,6] Hình 16: Chymotrypsin Chymotrypsinogen Chymotrypsin protease tiết từ tuyến tụy, protease kiềm tính quan trọng sau Trypsin Chymotrypsin tụy tiết dạng khơng hoạt động chymotrypsinogen, sau chymotrypsinogen chuyển sang dạng hoạt động chymotrypsin nhờ tác dụng Trypsin a Cấu trúc: Chymotrypsin cấu tạo từ sợi polypeptide: Sợi A: amino acid từ 1-13 Sợi B: amino acid từ16-146 Sợi C: amino acid từ149-245 Các sợi liên kết với cầu nối disulfit Các sợi polypeptide liên kết với tạo dạng hình cầu b Sự hoạt hóa Chymotrypsin: Từ dịch tụy bò thu loại chymotrypsinogen A chymotrypsinogen B Hai loại có số lượng gần khoảng 16% protein dịch tụy Hệ enzyme protease - trang 47 - Chymotrypsinogen A protein biết đến nhiều Nó chiết tách từ tụy tạng bò pH acid Chymotrypsinogen B quan trọng chymotrypsinogen A Khi Chymotrypsinogen A hoạt hố tạo chymotrypsin dạng α, β, γ, δ, ε, π…, chymotrypsinogen B hoạt hố thành dạng chymotrypsin B hoạt động Các enzym α, β, γ-Chymotrypsin có tính đặc hiệu hoạt tính số chất giống nhau, khó phân biệt chúng mặt enzym Tuy nhiên chúng lại khác tính chất protein, dạng tinh thể, độ hồ tan, trọng luợng phân tử… c Tính chất Chymotrypsin : Chymotrypsin protease hoạt động mơi trường có pH kiềm nên xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự trypsin Chymotrypsin hoạt động pH 7-9 pH tối ưu 8-9, điểm đẳng điện pI=5,4 pH khơng thuận tiện cho hoạt động chymotrypsin chymotrypsin lại bền vững mơi trường pH = Trong ruột, Chymotrypsin thủy phân protein sản phẩm tiêu hóa phần pepsin để tạo peptide ngắn amino acid tự Hoạt tính Chymotrypsin tương đối yếu Trypsin lại có khả thủy phân protein sâu sắc d Cơ chế hoạt động xúc tác: Hình 17: Cơ chế thuỷ phân Chymotrypsin Hệ enzyme protease - trang 48 - Chymmotrypsin xúc tác thuỷ phân liên kết peptide phân tử protein Nó phân cắt có chọn lọc liên kết peptide chuỗi polypeptide vò trí đầu –C amino acid có nhân thơm (Tryptophan, tyrosine, phenynalanin) Hoạt động xúc tác sau: - Cơ chất khuếch tán đến TTHĐ enzym, amino acid có nhân thơm gắn vào vò trí liên kết S - Sau liên kết với chất (S), proton H + Ser 195 bò His 57 thu lấy kết His 57 tích điện dương trung hòa điện tích âm Asp 102 Ser 195 proton nên tích điện âm có khả tạo vò trí liên kết Nguyên tử O Ser 196 tạo nối C nhóm – COOH S tạo LK tứ diện (một nguyên tử carbon tạo liên kết với nguên tử cacbon khác) Nguyên tử O chất tích điện âm trung hoà điện tích dương nhóm amin enzyme Như chất tạm thời tạo mối liên kết đẳng trò với enzym - Trạng thái trung gian bò phá vỡ liên kết peptide ( C-N) bò cắt đứt Phần mang đầu C S khuếch tán khỏi TTHĐ mang theo proton His 57 Nhưng đầu N S tạo liên kết đẳng trò, tranïg thái gọi acyl trung gian - Một phân tử khuyếch tán đến TT phản ứng enzym tạo hydrogen vứi His 57 His lấy proton tích điện dương trung hoà Asp 102 Nguyên tử O phân tử H2O tách mang điện tích âm - Một lk theo kiểu hình tứ diện trung gian thứ hai tạo thành, lúc phân tử H2O công vào S Một lần S lại mang điện tích âm trung hoà điện tích enzym His 57 giữ lại proton phân tử nước - Liên kết theo kiểu tứ diện trung gian bò phá vỡ tạo đầu –C phần lại S S tách Proton His 57 chuyển ngược lại 195 Enzym trở lại trạng thái ban đầu chuẩn bò xúc tác cho chất khác e Tính đặc hiệu: Chymotrypsin hoạt động endopeptydase phân cắt mạch polypeptide thành peptide ngắn tác dụng lên liên kết mà trypsin không phân cắt Những liên kết tạo thành nhóm –COOH amino acid có nhân thơm tryptophan, tyrosine, phenynalanin với nhóm amino acid khác Hệ enzyme protease - trang 49 - ChymoTrypsin -CO-NH-CH-CO R1 OH NH–CH+ H -CO-NH-CH-COOH + H2N–CH- R2 R1 R2 R1: Gốc amino acid có nhân thơ (Try, Trp, Phe) R2: Gốc amino acid Tương tự trysin, chymotrypsin khả phân cắt liên kết khác có khả tác dụng lên liên kết ester Hệ enzyme protease - trang 50 - C PROTEASE VI SINH VẬT I Nguồn thu nhận enzim protease [1] Nhiều vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh protease Các enzym có tế bào tiếp vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào sản xuất qui mô công nghiệp sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiêp y học Căn vào chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp ,…các nhà khoa học phân loại proteinase vi sinh vật thành nhóm sau: protease-acid; protease- thiol; protease-kim loại ; ptotaese-xerin; protaese –acid Một số tác giả khác chia protease nhóm , dựa vào pH hoạt động chúng bao gồm : protease-acid; protease trung tính; protease kiềm Các protaese-serin protaese-tiol có khả phân giải liên kết este liên kết amide dẫn xuất acid amino acid Ngược lại protaese kim loại protease acid thường hoạt tính eseterase amidase dẫn xuất amino acid Các protease-serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000- 27.000 Da Tuy nhiên có số protease –serin có trọng lượng phân tử lớn emzym Penicillium cyoneo-fulvu,Asp, oryzae OUT 5038 Trọng lượng phân tử protease kim loại lớn so với protease –xerin Protease tiol nhiều protease acid có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Da Nói chung, tính đặc hiệu protease amino acid chứa nhóm –CO- hoạc nhóm –NH- liên kết bò phân giải mà ccøn gốc amino acid xa liên kết bò phân giải, chẳng hạn protease –xerin giống Trysine Streptomyces, protease kim loại trung tính ,… Các protease –xerin kiềm protease acid chòu ảnh hưởng lớn tương tác thứ cấp enzym có tính đặc hiệu nghiêm ngặt chất phân tử bé Khi tác dụng lên chất phân tử lớn Tính đặc hiệu enzym xác đònh tương tác thứ cấp Trong 19 năm này, số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều công trình nghiên cứu protease động vật thực vật, thời gian Hệ enzyme protease - trang 51 - gần người ta có phương pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan protease Kết mở triển vọng to lớn nghiên cứu ứng dụng protease Trong trung tâm hoạt động protease vi sinh vật gốc amino acid đặc trưng cho nhóm có số gốc amino acid khác Các kết nghiên cứu cấu trúc không gian trung tâm hoạt động số protease vi sinh vật cho phép rút số nhận xét sau: Trung tâm hoạt động protease vi sinh vật đủ lớn bao gồm số gốc aminoacid Các protease kim loại có trung tâm họat động lớn vào khoảng 21 0A, phân biệt thành phần trung tâm hoạt động, phần trung tâm hoạt động tương ứng với gốc amino acid phân tử chất Khi nghiên cứu cấu trúc thermolysin thấy trung tâm hoạt động enzym tạo thành nhờ gốc amino acid chuỗi polypeptide, tạo thành rãnh sâu phân tử , gốc amino acid trung tâm hoạt dộng thermolysin glu-143, asp-179, arg-203, tyr-157, his-231 Histidin phía trước nguyên tử kẽm, kẽm tạo liên kết muối với Asp-226 Về vai trò gốc tyrosin trung tâm hoạt động proteinase kim laọi trung tính Tsuru tập thể xác nhận (1970) Các tác giả cho rằng, có gốc tyrosin với nguyên tử kẽm tham gia trung tâm hoạt động protease trung tính củ a Bac.sublilis Đối với protease acid cấu trúc trung tâm hoạt động tinh protease acid Rhizopus chineis Endothia parasilica cho thấy phân tử protease gồm hạt, chúng có khe hở khoảng 20 0A Khe hở phần tiếp xúc enzym, gốc Asp-35,và Asp-215 xếp đối diện khe Theo tác giả , có lẽ kiểu cấu trúc trung tâm hoạt động đặc trưng cho protease acid Ngoài gốc –COOH- theo Ichishida Yshida (1986), gốc trytophan đóng vai trò quan trọng aspergilopeptidase A Đối với protease không chứa cyteine, trung tâm hoạt động chúng không vững cầu disulphide Hệ enzyme protease - trang 52 - Mặc dù trung tâm hoạt động protease vi sinh vật có khác enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo chế chung sau : E + S E - S E – S + P1 E + P2 Trong :E enzym , S chất , E –S phức hợp emzym chất E-S’ – phức trung gian enzym chất hoá(axilenzym) P1 – sản phẩm phản ứng (với nhóm amide tự tạo thành) P2 – sản phẩm thứ hai phản ứng (với nhóm cacboxyl tự đïc tạo thành ) Theo số tác giả, chế tác dụng protease vi sinh vật giống với protease xerin động vật, tiến hành theo kiểu xúc tác acid-bazơ theo sơ đồ Pogar Bender(1969) Protease acid vi sinh vật có lẽ xúc tác cho phản ứng theo chế giống pepsin II Một số loại enzyme Vi sinh vật [1,2,5,6] Subtilisin (EC3.4.4.16) Hình 18: Subtilisin Hệ enzyme protease - trang 53 - Trước người ta tưởng tất protease serin tạo thành họ có hoạt động chức giống nhiên thực tế có protease từ vi khuẩn có cấu tạo không gian khác biệt Đó subtilisin enzym ngoại bào thuộc nhóm protease serin mang tính kiềm tính Bacillus subtilis loài tương tự sản xuất enzyme cầu disulfua phân tử , song lại có tính lực mạnh với ion canxi Trong số có subtilisin BPN có khối lượng phân tử 27537 Da bao gồm 275 axit amin Sự hoạt động enzyme nhờ ba axit amin theo tứ tự AspartatHistidin-Serin, khác so với protease serin theo kiểu tripsin thường có thứ tự His (57) – Asp (102)-Ser(195) Subtilisin bền so với chất tẩy rửa Hình 19: Cấu trúc tâm hoạt động Subtilisin Subtilisin protein gồm sản xuất để tiết khỏi tế bào vi khuẩn Subtilisin tổng hợp thường dạng “ tiền subtilisin” gồm 30 axit amin “ chuỗi tín hiệu” tiếp đến 77 axit amin “chuỗi tiền” cuối subtilisin Điều thú vò tất 107 axit amin đầu N bỏ để chuyển thành enzyme tự có chứa axit amin D, H, S trung tâm hoạt động Hệ enzyme protease - trang 54 - -107 -77 -1 275 +1 C N Chuỗi tín hiệu Chuỗi tiền Subtilisin D H S Hình 20: Quá trình tổng hợp Subtilisin Tiền subtilisin liên kết hoàn toàn với màng vi khuẩn gần không hoạt động Khi subtilisin giải phóng môi trường trạng thái hoà tan hoạt động Quá trình tự giải phóng enzyme trình tự xúc tác Sự có mặt chuỗi tiền phân tử “ tiền subtilisin” có vai trò cưuc kỳ cần thiết cho thể hoạt tính en zyme Nhiều nghiên cứu cho subtilisin khả trở trang thái ban đầu , trở trạng thái có mặt “ chuỗi tiền “ Có thể nói chuỗi tiền giống ‘Khăn trùm phân tử” giúp cho protein tự hoàn thiện cấu trúc tránh ảnh hưởng bên Màng Tiền subtilisin Sơ đồ hoạt hóa subtilisin Hình 21: Sơ đồ hoạt hoá Subtilisin Hệ enzyme protease - trang 55 - Colagenase ( EC.3.4.24.3) Colagenase loại enzyme có khả thuỷ phân liên kết dạng L- prolin đặc trưng vùng xoắn colagenase trạng thái tự nhiên chất Colagenase thu nhận từ tế bào eukaryoetae prokarotae Trong hệ thống phân loại enzyme, colagenase vi sinh vật xếp phân nhóm, nhóm metaloendopeptidase có mã hiệu phân loại EC.3.4.244.3 đại diện colagenase Clostridium hitolyticum tên gọi colagenase visinh vật , chúng có tên gọi khác Clostridium histolycum: Colagenase, Clostridiopeptidase A, Colagenase hay Colagenase L Nhìn chung, colagenase protein có khối lượng phân tử lớn có cấu trúc phân tử không giống Phân tử colagenase tạo nên từ phần đơn vò Một số colagenase vi sinh vật colagenase mô thường tồn dạng isozyme Trong hệ thống phân loại enzyme , colagenase xếp vào nhóm protease kim loại với có mặt nguyên tố Ca Zn Tuy nhiên, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy trung tâm hoạt động colagenase khác chứa nhóm hoạt động khác SH, OH Mặc dù chưa có số liệu cấu trúc colagenase người ta phát colagenase thường bao gồm từ 230 -> 739 gốc axit amin Đặc biệt colagenase serin kim loại thường chứa số đoạn trình tự giống Người ta chưa phát tương đồng trình tự colagenase vi sinh vật với colagenase eukaryote khác Đa số colagenase có pH hoạt động khoảng trung bình kiềm ( pH 7-8) Colagenase từ Bacillus alvei DC-1 colagenase phát hoạt động vùng acid yếu trung tính ( 4,5 -7) Nhiệt độ hoạt động thích hợp colagenase thường 40 o C Các enzyme bò giảm phần lớn hoạt lực tăng nhiệt độ lên 450C Hầu hết colagenase có tính đặc hiệu cao colagen Colagenase mô có tính đặc hiệu cao enzyme vi khuẩn phân giải colagen tới peptide dễ phân giải , mở đường cho hoạt động protease khác nhiệt độ phản ứng 37 0C cao nhiệt độ gelatin hoá colagen Hệ enzyme protease - trang 56 - colagenase từ vi khuẩn lại xem có khả phân cắt tích cực so với enzyme Liên kết phân cắt điển hình colagenase vi sinh vật liên kết X-Gly nằm trình tự X-Gly-Pro-Y chuỗi xoắn α colagenase khác khác Do khả phân cắt đặc hiệu colagen, colagenase dùng công cụ để phân tích thành phần mô liên kết Khi nghiên cứu miễn dòch, enzymm sử dụng để tách colagen khỏi mô trước cho phản ứng với kháng thể chống colagen Colagenase có khả ngăn chặn phát triển khối u phân cắt trình tự hexapeptid malpalan Pro-Gln-Gly-Ile-Met-Gly để tạo thành tripeptide malaphan Ile-Met-Gly có độc tính tế bào cao Điều gợi mở khả đầy hứa hẹn sản xuất loại thuốc có hoạt tính colagenase cao để ngăn ngừua khối u Colagenase enzyme đầy tiềm công nghiệp da, mỹ phẩm đặc biệt công nghiệp thực phẩm Hệ enzyme protease - trang 57 - Tài liệu tham khảo Nguyễn Đức Lượng (chủ biên) 2004 Công nghệ enzym NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM Lê Ngọc Tú (chủ biên) 2000 Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt Nhà Xuất Bản Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Tiến Thắng 2005 Hoá học Protein NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM Http://chemistry.umeche.maine.edu/ CHY431/Peptidase.html http://bmbiris.bmb.uga.edu/8010/moremen/weblinks/WebSerineProteases/ SerProtease1.html http://bmbiris.bmb.uga.edu/8010/moremen/weblinks/Comparison/Compari son1.html Hệ enzyme protease - trang 58 - [...]... papain gần giống như ficin và trypsin, mặc dù chúng từ những nguồn gốc khác nhau d) Hoạt tính enzim và cơ chế tác dụng Hệ enzyme protease - trang 15 - Hình 6: Cơ chế tác dụng của papain [4] Hệ enzyme protease - trang 16 - Hình 7: Cơ chế xúc tác của các cystein proteinase Hệ enzyme protease - trang 17 - Papain thuỷ phân protein thành các polypeptide và các amino acid, nó đóng vai trò vừa... tuổi chứa nhiều nhựa nhất Nhựa là hỗn hợp enzim chứa các protease sau: papain, chymopapain A, chymopapain B, protenase III, protease IV, thyolprotease Trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất đến 95%, và là enzim có ý nghóa quan trọng nhất Các tính chất vật lý của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn Hệ enzyme protease - trang 12 - 2 Tính chất [1,2,5,6] 2.1... mức cực đại Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzim do: Hệ enzyme protease - trang 26 -  Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzim  Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất  Tác dụng vào độ bền của phân tử enzim  Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tử enzim… Hệ enzyme protease - trang 27 - B PROTEASE ĐỘNG VẬT Enzym là nhóm protein lớn nhất và quan... tràng Các enzyme này thuộc nhóm enzyme phân cắt các liên kết amide, liên kết peptide Ngoài ra Hệ enzyme protease - trang 30 - chúng cũng có thể cắt cả liên kết carbob –carbon Tuy nhiên vai trò chính của enzyme này trong cơ thể là thuỷ phân liên kết peptide trong suốt quá trình tiêu hoá ở ruột non II MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT : [1,2] II.1.Enzym protease acid: II.1.1.PEPSIN:... hoạt tính xúc tác:50-65oC Hệ số sa lắng:2.5-2.7S Điểm đẳng điện:9-10 Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước và glycerine Tính chất vật lý của ficin ở các nguồn thu nhận khác nhau được trình bày ở bảng sau Bảng 6: Tính chất vật lí của ficin Hệ enzyme protease - trang 23 - Nguồn thu nhận Phương pháp tinh sạch Hệ số sa lắng Trọng lượng Điểm Hệ phân tử đẳng điện 0 (S... liên hệ tỷ số cao với pepsinogen A , pepsinogen C ở dê có giá trò 40% Trypsin và chymotrypsin: Trypsin và chymotrypsin là những protease kiềm tiết ra từ tuyến t của động vật máu nóng Các enzyme này khi mới tiết ra điều ở dạng tiền enzyme ( proenzyme) bất hoạt ( trypsinogen và chymotrypsinogen), sau đó chúng được hoạt hoá và trở thành dạnhg hoạt động là trypsin và chymotrypsin ở trong tá tràng Các enzyme. .. như blue acid 83, Redacid 17, …để làm tăng tính bền vững của enzim Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu dược o từ đu đủ , sung , vả , dứa có tên gọi là Thiol-proteae, cystein -protease hay sulfhydrul -protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 60 0 -> 800 ở pH tự nhiên Tâm hoạt động của các enzyme này gồm có 2 amino acid là cystein và histidine Cơ chế thuỷ giải protein xảy ra... hóa một phân tử nước và chính phân tử nước này tham gia xúc tác phản ứng thuỷ phân Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin Hệ enzyme protease - trang 35 - e Hoạt động xúc tác của pepsin: [4,5,6] Hình 10: Cơ chế tác dụng của Aspartic proteinases Hệ enzyme protease - trang 36 - ... Igelstrom 1966, Brubacher và Bender 1966 Tính ái nhân của phân tử sulfur và nhóm SH mạnh hơn oxygen và được tăng lên nhiều nhờ hệ thống histidine-asparagine mặc dù ảnh hưởng của nó không rộng như hệ thống histidine- asparagine trong cơ chế enzym chymotrypsin Nhờ đó mà nó thúc đẩy Hệ enzyme protease - trang 18 - phản ứng thuỷ phân xảy ra dễ dàng hơn do carbon của cơ chất có khuynh hướng phản ứng với những... lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzim bò chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxi hóa Hệ enzyme protease - trang 25 - Bền vững với pH:Trong một vùng pH khá rộng(4.5-9.5) độ bền o vững của enzim ficin đạt đến mức cực đạinhưng trong một vùng pH hẹp dao động quanh pH=8 thì nó lại có tính bền vững ở mức độ tối thiểu Nguyên nhân là do một nhóm SH tối cần thiếtbò oxi hóa Tuy nhiên,